|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ЗИМА Галина Володимирівна
УДК 577.352.57.043:539.166
ЗМІНИ АТФазної АКТИВНОСТІ ТА МОЛЕКУЛЯРНІ
ПЕРЕБУДОВИ ЕРИТРОЦИТАРНИХ МЕМБРАН ПРИ
ВПЛИВІ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ
03.00.02 - біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна
Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, доцент
Древаль Владислав Іванович
Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,
професор кафедри молекулярної та прикладної біофізики
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Костерін Сергій Олексійович
Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,
заступник директора по науковій роботі та завідувач відділу біохімії м'язів
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
Філенко Анатолій Максимович
НДІ фізіології ім. акад. Петра Богача Київського національного
університету ім. Тараса Шевченка, старший науковий співробітник
відділу біофізики
Провідна установа:
Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України,
відділ фізико-хімічної біології клітинних мембран м. Київ
Захист відбудеться " 11 " червня 200 року о14.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету
ім. Тараса Шевченка (01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64,
біологічний факультет, ауд. 215)
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного
університету ім. Тараса Шевченка (01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58)
Автореферат розісланий " 26 " березня 2001 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Давидовська Т.Л.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Однією з центральних проблем сучасної науки про дію іонізуючого випромінювання на біологічні об'єкти є вивчення кількісних та якісних ефектів так званих “малих” доз радіації. Малими зазвичай вважаються дози від тих, що не перевищують природнього радіаційного фону до десятих долей сГр. Існує ряд принципових особливостей відповідної реакції клітини на дію малих доз. Але зараз немає єдиної загальновизнаної концепції біологічної дії малих доз іонізуючого випромінювання. З одного боку найбільше поширення отримала лінійна безпорогова концепція, яка постулює безумовну небезпеку опромінювання, починаючи з доз, що не перевищують природнього радіаційного фону. З іншого боку можлива пороговість ушкоджуючої дії радіації, яка зумовлена дією репаруючих систем клітини, міцністю біосистем, включенням захисних та компенсаторних механізмів. При різних співвідношеннях прямого (ушкодження) та зворотнього (відновлення) процесів можливий будь-який вид результуючої дозової залежності.
В Україні, у зв'язку з наслідками аварії на ЧАЕС, все ширше коло людей зазнає дії іонізуючої радіації. Тому великий інтерес має вивчення формування та розвитку відповіді на вплив іонізуючого випромінювання на біологічні структури. В клітині мембрана є областю локалізації сигналу про радіаційну дію та однією з мішеней радіаційного ураження. Індуковані іонізуючим випромінюванням ушкодження ультраструктури зовнішньої мембрани з′являються майже миттєво і набагато раніше, ніж у внутрішньоклітинних органелах. Плазматичні мембрани клітин є важливими регуляторами клітинного метаболізму. Та відомо, що фізико-хімічний стан мембрани зумовлює структурний стан і активність ферментів, включених до її структури. У процесах обміну ферменти посідають центральне місце. Виникає питання – чи не руйнуванням цих регуляторів обміну визначається променеве ураження мембран. Са2+-АТФаза та Мg2+-АТФаза є ферментами плазматичної мембрани, які відрізняються структурно і функціонально. Тому дослідження структурно-функціональних змін цих ферментів при дії радіації дасть змогу оцінити перетворення, що їх зазнають різні ділянки мембрани. Звертаючи на викладене вище є актуальним дослідження впливу опромінення у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр на активність зазначених ферментів і структуру плазматичних мембран.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри молекулярної та прикладної біофізики ХНУ, в межах програми Міносвіти “Здоров'я людини” та координаційного плану “Взаємодія електромагнітного випромінювання та потоків заряджених частинок з речовиною” за темами: “Дослідження гідратації макромолекул і механізмів їх взаємодії з іонізуючим випромінюванням” № держреєстрації 0197U016740 та “Дослідження впливу іонізуючого випромінювання і біологічно-активних речовин на клітини та організми” № держреєстрації 0197U016741.
Мета і задачі дослідження. Дослідити вплив іонізуючого випромінювання у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр на функціональні та структурні характеристики плазматичних мембран еритроцитів.
Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
Вивчити вплив іонізуючого випромінювання у діапазоні 4⋅10-3-103Гр на Са2+-АТФазну та Мg2+-АТФазну активність.
Використовуючи спектрофлуоресцентні методи вивчити зміни структури білків плазматичних мембран при дії іонізуючого випромінювання.
Дослідити зміни поверхневого потенціалу плазматичних мембран.
Визначити індуковані радіацією зміни ліпідного компоненту плазматичних мембран еритроцитів шляхом вивчення інтенсивності процесів ПОЛ та мікров'язкості мембранних ліпідів.
Об'єкт досліджень: плазматична мембрана еритроцита, ферментативна активність Са2+-АТФази та Mg2+-АТФази.
Предмет досліджень: вплив іонізуючого випромінювання у малих (від 4⋅10-3 Гр) та у великих (до 103 Гр) дозах на структуру та функціональні властивості плазматичних мембран еритроцитів.
Методи: Са2+-АТФазну та Mg2+-АТФазну активності визначали методом Карафолі – за кількістю вивільненого у надосадочну рідину неорганічного фосфату.
Зміни при дії радіації структури білкового компоненту плазматичної мембрани в цілому оцінювали за допомогою нейтрального гасія власної флуоресценції триптофанових залишків мембранних білків – сукциніміда. Викликані радіацією зміни білків плазматичної мембрани, які зв'язують АТФ, Са2+, та конкретно Са2+-АТФази та Mg2+-АТФази визначали за власною флуоресценцією триптофанилів мембранних білків при титруванні мембранних препаратів специфічними іонами. Зміни поверхневого потенціалу мембрани визначали за допомогою флуоресцентного зонду піроніну. Вплив іонізуючого випромінювання на ліпідну компоненту мембран досліджували за змінами інтенсивності процесів ПОЛ та в’язкості ліпідної фази, яку визначали за ступенем ексимеризації пірену.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведене комплексне дослідження впливу іонізуючого випромінювання на структурно-функціональні характеристики плазматичних мембран еритроцитів у діапазоні доз, від малих, які наближаються до фонових (4⋅10-3Гр), до летальних та сублетальних доз (103Гр).
Встановлені порівняльні особливості змін активності та кінетичних характеристик Са2+-АТФази та Мg2+-АТФази при дії іонізуючого випромінювання у широкому дозовому інтервалі (4⋅10-3-103Гр).
Вперше встановлено, що ділянка активного центру Са2+-АТФази, яка зв'язує Мg-АТФ2- чутливіша до дії радіації і уражується вже малими дозами, а активний центр ферменту, який зв'язує Са2+ помітно реагує на більші дози.
Встановлено, що різні білки плазматичних мембран еритроцитів зазнають специфічних структурних змін при дії різних доз радіації.
Отримані нові дані, що свідчать про кооперативні структурні зміни в плазматичних мембранах еритроцитів при дії радіації у діапазоні 4⋅10-3-103Гр.
Встановлена наявність двох пулів ліпідів, що вони оксидуються із зміною мікров'язкості при дозах 4⋅10-3 - 4⋅10-1Гр та при дозі 400Гр.
Вперше показано, що при дії іонізуючого випромінювання у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр основні компоненти плазматичної мембрани – білки та ліпіди, а також функціональні покажчики зазнають змін, які є специфічними для кожної окремо взятої дози і комбінації цих змін і визначають специфіку перетворень мембрани при кожній вивченій дозі.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають важливе значення для з'ясування загальних принципів та механізмів дії іонізуючого випромінювання та для успішного вивчення функціонування плазматичних мембран клітини в умовах впливу іонізуючого випромінювання та їх ролі в організації метаболізму в клітині у зазначених умовах. Ці результати можуть бути використані в експериментальних дослідженнях як структурних, так і функціональних змін мембранного апарату клітини при дії іонізуючого випромінювання.
Вивчення механізму реалізації відповіді плазматичних мембран на дію радіації у вигляді неспецифічного адаптаційного синдрому представляє істотний інтерес як для теоретичного аналізу, так і для практичного вивчення механізмів захисту від іонізуючого опромінення. А оскільки неспецифічний адаптаційний синдром є необхідною ланкою майже любого патологічного процесу, результати роботи можна використовувати при дослідженні структурно-функціональних змін мембранного апарату клітини при дії різних фізичних та хімічних факторів.
Теоретичний інтерес має аналіз структурно-функціональних станів плазматичної мембрани, які реалізуються при дії іонізуючого випромінювання у різних дозах, а також структурних переходів, що відбуваються у мембрані між цими станами.
Характер відповідних реакцій мембран на дію “малих” та “великих” доз іонізуючого випромінювання дозволяє визначити найчутливіші та найрезистентніші до радіації компоненти. Це створює передумови для пошуку нових радіопротекторів та профілактичних заходів специфічних до впливу різних доз іонізуючого випромінювання.
Отримані закономірності дозволяють визначити шляхи корекції змін, викликаних у клітинах малими дозами іонізуючої радіації. А це є актуальним для України, у зв'язку із наслідками аварії на ЧАЕС.
Особистий внесок здобувача. Підбір, обробка та аналіз даних літератури; постановка наукової задачі, вибір методів дослідження для ії вирішення. Весь обсяг робіт, пов'язаний з отриманням експериментальних даних та формулюванням висновків.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались і обговорювались на:
II З′їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 29червня-3липня 1998;
Міжнародній конференції “Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты”, Санкт-Петербург, 8-10 вересня 1999;
Семінарі Харківського відділення біофізичного товариства України, Харків, 15 червня 2000.
Публікації. Результати дисертації опубліковано в 8 наукових працях, у тому числі в 6 статтях у наукових журналах та у 2 тезах доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів: 1- огляд літератури, 2-матеріали та методи досліджень, 3- результати досліджень, 4- обговорення результатів досліджень, висновків, переліку використаної літератури із 286 найменувань, додатків. Повний обсяг дисертації складає 167 сторінок, вона містить 16 таблиць і 25 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У першому підрозділі наведено теоретичні та експериментальні дані про дію іонізуючого випромінювання на біологічні об'єкти. Розкрито поняття “малі дози”. У другому підрозділі охарактеризовані структурні особливості біологічних мембран. Показана роль, яку відіграють плазматичні мембрани у ефектах, викликаних радіацією. У третьому підрозділі описані мембранозв'язані ферменти плазматичної мембрани еритроцитів – Са2+-АТФаза та Мg2+-АТФаза, показані їх основні структурні, функціональні особливості, тощо.
Матеріали і методи досліджень
Об'єкт досліджень - плазматична мембрана еритроцитів: нативна та опромінена у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр. Тіні еритроцитів виділяли за методом Доджа. Отримані мембрани суспендували у 50мМ тріс НСІ буфері, що містив 100 мМ КСІ, рН=7,4.
Вміст білку у препаратах мембран еритроцитів визначали мікробіуретовим методом на спектрофотометрі СФ-46 (λ=330нм).
Са2+-АТФазну та Мg2+-АТФазну активність плазматичних мембран визначали в 1мл середовища інкубації, що містив 100 мМ тріс НСІ, рН=7,4, 200мМ КСІ, Мg-АТФ2- 0,5ммоль, Са2+в=5,7мкмоль за методом Карафолі.
Для реєстрації конформаційних змін білків плазматичної мембрани під впливом іонізуючого випромінювання використовували аналіз власної флуоресценції триптофанилів білків при титруванні препаратів мембран АТФ4-, іонами Са2+, VO43-, La3+, Mg2+ та сукцинімідом.
Вивчення зміни поверхневого потенціалу плазматичної мембрани еритроцитів при дії іонізуючої радіації проводилось за допомогою флуоресцентного зонду піроніну (z = +1), при λзбудж= 550нм, λфл=600нм.
Спектрофлуоресцентні дослідження проведені на спектрофлуоріметрі Hitachi-850 (Японія) в термостатуємих при +250С кварцевих кюветах 10×10 мм. Концентрація мембранного білку 0,5 мг/мл.
Інтенсивність процесів ПОЛ в плазматичних мембранах визначали за накопиченням одного з кінцевих його продуктів (МДА), що реагують з тіобарбітуровою кислотою.
Визначення мікров′язкості мембранних ліпідів проведено вимірюванням відношення інтенсивностей флуоресценції мономерної форми пірена (λ=373нм) і його ексимера (λ=465нм) - Fм/Fе (λзбудж=319нм).
В роботі досліджувався вплив рентгенівських та γ-променів. Суспензію плазматичних мембран з визначеною концентрацією білка опромінювали у дозах 4⋅10-3-4⋅10-1Гр на рентгенівській установці РУМ-17. Опромінювання у дозах 1-103Гр проводили на ізотопній γ-установці “Досліджувач” (60Со).
Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Ст’юдента та кореляційного аналізу.
Результати досліджень та їх обговорення
Визначення Са2+-АТФазної та Мg2+-АТФазної активності плазматичних мембран еритроцитів. При дії іонізуючого випромінювання у дозі 4⋅10-3 Гр Са2+-АТФазна активність знижується у 3,4 рази (р<0,05), а у дозі 40 Гр-падає у 4,25 рази (р<0,05) відносно неопроміненого контролю (рис. 1). Кінетичні параметри ферментативної реакції визначали за методом Іді-Хофсті (табл. 1). У всьому дослідженому діапазоні (табл.1) індуковані радіацією структурні зміни в молекулі ферменту призводять до зростання спорідненості активного центру Са2+-АТФази до субстрату Mg-АТФ2-. Зміни максимальної швидкості ферментативної реакції (Vmax) у дозах 4⋅10-3Гр та 1Гр не є достовірними. У діапазоні великих доз (40, 103Гр), спостерігається зменшення швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продуктів реакції.
Таблиця 1
Зміни величин константи Міхаеліса (Km) та максимальної швидкості (Vmax) Са2+-АТФазної реакції плазматичної мембрани еритроцита при дії іонізуючого випромінювання
Примітка. * р<0,05
Вплив іонізуючого випромінювання у дозах 4⋅10-3–103Гр на плазматичні мембрани еритроцитів веде (рис. 2) до збільшень активності Mg2+-АТФази при дозах 1Гр у 3,52 (р<0,05) рази, а при дозі 1000Гр у 4,68 (р<0,05) рази відносно контролю, які супроводжуються змінами (табл. 2) кінетичних параметрів Mg2+-АТФази. У всих досліджених дозах спостерігається зменшення швидкості розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продуктів реакції. При дозі 40Гр структурні зміни фермента приводять до зменшення спорідненості активного центра до субстрату Mg–АТФ2-, а при дозах 1 Гр та 1000Гр до збільшення такої спорідненості (табл. 2).
Таблиця 2
Зміни величин константи Міхаеліса (Km) та максимальної швидкості Mg2+-АТФазної реакції (Vmax) еритроцитарної мембрани при дії іонізуючого випромінювання
Примітка. * р < 0,05.
Зміни кінетичних параметрів Са2+-АТФазної та Мg2+-АТФазної реакцій вказують на структурні перебудови активних центрів ферментів при дії радіації. Тому було цікавим дослідити, яких структурних перебудов зазнають мембрани в цілому, Са2+-АТФаза та Мg2+-АТФаза при дії радіації у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр. Для цього використовували спектрофлуоресцентні методи.
Зміни білків плазматичних мембран еритроцитів при дії іонізуючого випромінювання у дозах 4⋅10-3–103Гр, вивчені за допомогою нейтрального гасія флуоресценції сукциніміда. Са2+-АТФаза та Mg2+-АТФаза є мембранними ферментами стан яких залежить від мікрооточення і стану мембрани в цілому. Тому досліджували зміни білків мембрани в цілому. при дії іонізуючого випромінювання нейтральним гасієм флуоресценції сукцинімідом. Спостерігається (табл. 3) відсутність істотних структурних змін у білках при дозі 4⋅10-3Гр. При дозі 1000Гр відбувається зниження структурної жорсткості мембранних білків. У цій же дозі кількість доступних сукциніміду білкових залишків(f) зменшується в 1,8 рази.
Таблиця 3
Зміни ефективності гасіння (величин КSV –константи штерна-фольмера і f- долі початкової флуоресценції, доступної для гасіння) білкової флуоресценції плазматичних мембран сукцинімідом при дії іонізуючого випромінювання
Примітка.* р < 0,05.
Таким чином, однією з причин спостережених змін Са2+-АТФазної та Mg2+-АТФазної активності у діапазоні дії великих доз радіації є структрні зміни молекул інкорпорованих у мембрани білків.
Дослідження структурних змін мембранних білків при опроміненні у діапазоні доз 4⋅10-3–103Гр титруванням АТФ. Мембранозв′язані АТФази є білками, які специфічно зв′язують АТФ.
Таблиця 4
Зміни ефективності гасіння білкової флуоресценції плазматичних мембран (величин константи Штерна-Фольмера (Ksv) та долі початкової флуоресценції доступної для гасіння (f)) іонами АТФ4- при опроміненні
Примітка.* р < 0,05.
За даними гасіння флуоресценції триптофанилів мембран іонами АТФ4- у інтактних мембран 51% загальної флуоресценції доступний для гасіння (табл. 4). Величина f (табл. 4) свідчить про зменшення долі загальної флуоресценції, доступної для гасіння при дії радіації у всьому дослідженому діапазоні доз. Величина KSV (табл. 4) у всьому досліджуваному діапазоні вказує на зменшення структурної жорсткості мембранних білків порівняно неопроміненого контролю.
Характер змін величин KA– константи асоціації і-N кількості місць зв′язування білків з лігандом (табл. 5) вказує на те, що при дії іонізуючого випромінювання у всьому дослідженому діапазоні АТФази зазнають конформаційних перебудов.
Таблиця 5
Параметри зв′язування АТФ з АТФазами плазматичних мембран еритроцитів
Примітка.* р < 0,05.
Дослідження структурних змін мембранних білків при опроміненні у діапазоні доз 4⋅10-3–103Гр титруванням іонами Са2+. З метою охарактеризувати особливості конформаційних пострадіаційних змін білків, які зв′язують кальцій, у тому числі Са2+-АТФази, визначали гасіння власної флуоресценції триптофанилів білків плазматичної мембрани іонами Са2+.
Таблиця 6
Параметри зв′язування іонів Са2+ з активними центрами білків плазматичних мембран еритроцитів, що зв′язують Са2+.
Примітка. * р < 0,05.
Величина коефіцієнта Хілла (nH) (табл. 6) при дії радіації у дозі 40 Гр, свідчить про глибокі кооперативні зміни в структурі мембран. Характер змін величин KA –константи асоціації і-N кількості місць зв′язування (табл. 6) при дії різних доз радіації свідчить про різні у діапазонах впливу малих та великих доз перебудови як білкових глобул в цілому, так і про структурні зміни активних центрів білків, що зв′язують Са2+.
Дослідження змін структури Са2+-АТФази плазматичних мембран еритроцитів при опроміненні у діапазоні доз 4⋅10-3-103Гр титруванням іонами VO43- та La3+. Зміни ефективності (табл.7) зв′язування іонів VО43- з активним центром Са2+-АТФази (KA×N) порівняно контролю вказують на структурно-конформаційні перебудови, яких зазнає активний центр Са2+-АТФази при опроміненні. Коефіцієнт Хілла (табл.7) вказує на кооперативні властивості притаманні інтактним та опроміненим у дозі 1000Гр мембранам.
Таблиця 7
Параметри зв'язування іонів VО43- з плазматичними мембранами еритроцитів
Примітка. * р < 0,05.
| 
