|
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Карпенко Юлія Вікторівна
УДК 574.23 : 582.288.4
екологічна характеристика мікроміцетів, що виявили ознаку позитивного радіотропізму
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жданова Неллі Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фізіології та систематики мікроміцетів
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Соломко Ельвіра Федорівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник відділу мікології
доктор біологічних наук, професор Гамалія Микола Федорович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу клітинної фотобіології і фотомодуляції росту пухлин
Провідна організація: Одеський державний університет ім. І.І. Мечнікова, кафедра мікробіології, Міністерство освіти України, м. Одеса
Захист відбудеться “ 17 ” грудня 2003 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
Автореферат розісланий “7” листопада 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження ґрунтових грибів, вилучених із зони відчуження ЧАЕС, дозволило виявити ряд цікавих морфологічних та фізіологічних характеристик вивченої мікобіоти, зокрема, здатність ряду грибів обростати та з часом руйнувати “гарячі” частинки в модельній системі [Жданова и др., 1991, 1994]. В результаті більш детального дослідження цього процесу виявилось, що він обумовлений направленим ростом грибного міцелію до “гарячої” частинки (позитивний радіотропізм – новий серед інших видів тропізмів грибів). Це дозволило прийти до висновку, що мікроміцети, які мають таку властивість, можуть брати участь в процесах біогенного руйнування “гарячих” частинок, помітно прискорюючи процес їх природного руйнування (за швидкістю росту в модельній системі – в 10-15 разів), тобто можуть бути перспективними в подальших розробках по знешкодженню радіоактивних відходів.
Оскільки вивчені нами штами грибів були виділені з твердих субстратів, ми вважали доцільним в першу чергу дати детальну характеристику їх ростових процесів як інтегрального показника метаболічного стану організму на агаризованих середовищах [Kotov, Reshetnikov, 1990; Moore, 1998], а також направлено дослідити ряд фізіолого-екологічних ознак, притаманних організмам, вилученим з радіоактивних субстратів.
Більшість живих організмів на 80% складаються з води, тому вплив іонізуючого випромінювання повинен викликати в них утворення активних форм кисню [Гамалей, Клюбин, 1991; Штамм и др., 1991]. Серед останніх найбільш стійким є перекис водню [Менщикова и др., 1994; Штамм и др., 1991], дію якого на різноманітні організми часто вивчають в лабораторних умовах. Стійкість організму до такої речовини може в ряді моментів корелювати з його стійкістю до іонізуючого випромінювання [Эйдус, 2001].
Виходячи з вищесказаного, продовження вивчення штамів з ознакою позитивного радіотропізму та більш детальне дослідження особливостей біології мікроміцетів, вилучених із зони відчуження ЧАЕС, є доцільним та актуальним.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, зокрема з темами “Дослідити еколого-фізіологічну активність мікроміцетів в умовах екстремальних антропогенних навантажень” (№ державної реєстрації 0100U004338). Робота була підтримана грантом National Science Foundation grant (IBN 981141).
Наукова робота Карпенко Ю.В. була відзначена стипендією Президії НАН України на 2003–2004 роки.
Мета і задачі дослідження. Метою представленої роботи було еколого-фізіологічне дослідження мікроскопічних грибів, які були виділені з різних субстратів зони відчуження ЧАЕС та мали ознаку позитивного радіотропізму. Це вимагало вирішення таких завдань:
- Дослідити основні ростові параметри (радіальна швидкість росту, одиниця гіфального росту, інтенсивність освоєння субстрату) мікроскопічних грибів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів та штамів тих же видів, ізольованих з чистих від радіонуклідів територій;
- Розробити модельну систему та дослідити вплив слабкого освітлення (1 лк) білим світлом на ряд мікроміцетів;
- Провести порівняльне дослідження реакцій радіотропізму та фотостимуляції тих же грибів;
- Вивчити вплив довготривалої дії градієнту перекису водню на апікальний ріст ряду грибів, виділених із зони відчуження ЧАЕС.
Об’єктами дослідження були мікроскопічні гриби відділів Zygomycota, Ascomycota та Mitosporic fungi, які були виділені з радіоактивно забруднених субстратів та з чистих відносно радіонуклідів регіонів (контрольні).
Предметом дослідження було вивчення ряду еколого-фізіологічних показників вищевказаних грибів.
Методи дослідження. Вирішення задач дослідження реалізувалось комплексом засобів, який включав класичні методи експериментальної мікології, а також оригінальні методики – визначення ознаки радіотропізму, вивчення фотостимуляції грибів, вивчення впливу градієнту концентрацій перекису водню на гіфальний ріст мікроміцетів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для характеристики росту міцеліальних організмів було застосовано поняття інтенсивності освоєння субстрату (І) на прикладі мікроскопічних грибів. Вивчення ростових параметрів ряду мікроміцетів, виділених із зони відчуження ЧАЕС, дозволило виявити дві притаманні їм принципово різні стратегії освоєння субстрату: швидкий ріст з слабким спороношенням та, навпаки, досить повільний ріст з утворенням великої кількості дрібних конідій.
Дослідження властивості радіотропізму серед широкого кола грибів дозволило виявити адаптивний характер цієї ознаки, яка притаманна лише штамам, виділеним з радіоактивних субстратів. Реакція позитивного радіотропізму спостерігалась як у меланінвмісних, так і у світлозабарвлених видів, та проявлялась на штамовому, а не на видовому рівні.
Розроблено модельну систему для дослідження впливу слабкого освітлення (1 лк) білим світлом на розвиток грибів та показано їх високу чутливість до такої дії. Вперше виявлено повне співпадіння реакцій радіотропізму та фотостимуляції у досліджених нами грибів. Зроблено припущення про універсальність фото- та радіорецепторних систем у грибів
Розроблено та вперше використано оригінальну методику для вивчення впливу перекису водню на апікальний ріст грибів. Гриби, виділені з радіоактивних субстратів, проявили високу резистентність до великих концентрацій перекису водню (10-2-10-1 М), які не були летальними для грибів, виділених із зони відчуження ЧАЕС, що може свідчити про значну загальну резистентність таких організмів.
Практичне значення одержаних результатів. Визначення фотостимуляції як ознаки, сполученої з ознакою позитивного радіотропізму, може бути перспективним методом для виявлення радіотропічних штамів без використання джерела γ-випромінювання.
Отримані ростові показники (зокрема, інтенсивність освоєння субстрату) можуть бути використані для екологічних прогнозів щодо біодеструкції будівельних конструкцій приміщень 4-го блоку ЧАЕС.
Матеріали дисертаційної роботи використовуються в курсі лекцій “Основи загальної мікології” на біологічному факультеті Київського Державного Університету ім. Тараса Шевченко, кафедра мікробіології.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором особисто. Автором самостійно проведено визначення ростових показників одиниці гіфального росту та інтенсивності освоєння субстрату ряду мікроміцетів на агаризованих середовищах. Розроблено систему для визначення фотоефектів грибів та досліджено реакції мікроскопічних грибів на слабке освітлення, а також зв’язок таких реакцій з реакціями позитивного радіотропізму. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми дисертації, проведено статистичну обробку всіх отриманих експериментальних даних, їх аналіз та співставлення з існуючими даними літератури, а також підготовку матеріалів результатів досліджень для їх публікації.
Визначення радіальної швидкості росту проведено сумісно з к.б.н. Вембер В.В., яка є співавтором відповідних публікацій. Дослідження ознаки позитивного радіотропізму проведене сумісно з к.б.н. Редчиць Т.І., яка також є співавтором публікацій. При дослідженні впливу перекису водню на ріст грибних гіф консультативну допомогу надавав д.ф.-м.н. К.Б. Асланіді (Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН). У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні результатів брав участь науковий керівник д.б.н. проф. Жданова Н.М.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені, доповідались та обговорювались на: Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених та спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (м. Ужгород, жовтень 2001 р.); Щорічній науковій конференції в Інституті ядерних досліджень НАН України, секція “Радіоекологія. Радіобіологія” (Інститут ядерних досліджень НАН України, січень, 2002 р.; лютий 2003 р.); I съезде микологов России (м. Москва, Росія, квітень 2002 р.); Международной конференции “Микробиология и биотехнология XXI столетия” (Мінськ, Бєларусь, травень 2002 р.); Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників в Інституті мікробіології та вірусології НАН України (грудень 2001 р.; грудень, 2002 р.); засіданні мікологічної секції Українського Ботанічного Товариства (Інститут ботаніки ім. Холодного НАН України, квітень, 2003 р.); 7-й Пущинской школе-конференции “Биология – наука XXI века” (м. Пущіно, Росія, квітень 2003 р.); 22nd Fungal Genetics Conference at Asilomar (Pacific Grove, California, USA, March 18-23, 2003).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць: 6 статей у наукових фахових виданнях та 5 тез.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 154 cторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Експериментальна частина”, “Заключення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 287 найменувань, в тому числі 210 іноземних авторів. Робота містить 8 таблиць та 42 рисунки.
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури
Складається з 3 підрозділів, в яких докладно розглянуті питання росту мікроскопічних грибів на щільних середовищах, розвитку грибної колонії, ритмічного росту колонії. Розглянуті тропічні реакції грибів, зокрема реакція фототропізму та впливу світла на розвиток грибів. Також проаналізовані питання впливу іонізуючого випромінювання на грибні об’єкти та участі перекису водню в цьому процесі, а також питання радіостійкості грибів.
РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи досліджень
Об’єктами досліджень були 65 штамів 13 видів 8 родів мікроміцетів, виділених з радіоактивно забруднених субстратів 10-км зони ЧАЕС та місцеіснувань з фоновим рівнем радіоактивності. Ці ізоляти були отримані з колекції відділу фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ.
Ростові показники було досліджено для 63 штамів 13 видів 8 родів. Порівняльне вивчення реакцій радіотропізму та фотостимуляції було проведено для 23 штамів 11 видів 8 родів. Вплив градієнту перекису водню вивчено для 3 видів 3 родів (7 штамів).
Методи досліджень. В залежності від мети дослідження штами грибів культивували на агаризованих середовищах – сусло-агарі (СА), голодному агарі (ГА), середовищі Чапека та на модифікованому рідкому поживному середовищі Чапека з вмістом сахарози 100 мг/л.
Визначення радіальної швидкості росту проводили за загально відомими методами (Паников, 1991; Перт, 1978, Методи…, 1982). Висновки про галуження грибного міцелію робили за значеннями показника одиниці гіфального росту, який визначали за загальноприйнятим методом Trinci [1974]. Показник інтенсивності освоєння субстрату на основі радіальної швидкості росту та одиниці гіфального росту розраховували, використовуючи викладки Prosser [1993].
Ознаку позитивного радіотропізму визначали за методом, розробленим Ждановою Н.М. та Редчиць Т.І. [1991, 1994] (Рис. 1).
Фотостимуляцію грибів вивчали за методом [Блажеєвська, Редчиць, 2003], розробленим на основі експрес-методу для визначення радіотропізму [Жданова и др., 1991, 1994] (Рис. 2).
При розрахунках інтенсивності освітлення, яке супроводжує іонізуюче випромінювання радіоактивного джерела, було встановлено, що в нашому випадку воно дорівнювало 1 лк [Вальтер, Залюбовский, 1991].
Вивчення тривалого впливу перекису водню на апікальний ріст проводили на базі Інституту теоретичної та експериментальної біофізики РАН під керівництвом доктора фізико-математичних наук Асланіді К.Б.
Отримані в роботі дані оброблені статистично [Лакин, 1968], з використанням програм Microsoft Exel_97 та SigmaStat_2.0.
РОЗДІЛ 3. Дослідження ряду ростових параметрів у мікроміцетів, виділених з радіоактивних субстратів
Крім радіальної швидкості росту, у вивчених штамів визначали такі ростові параметри: тривалість лаг-фази, максимальний (в рамках експерименту) діаметр колонії, максимальні та мінімальні значення радіальної швидкості росту та характер ритмічного росту.
На СА тривалість лаг-фази всіх вивчених штамів коливалась від 7 (швидкоростучі ізоляти родів Penicillium та Ulocladium) до 39 год. (представники повільноростучого Cladosporium sphaerospermum). Лише штами Alternaria alternata практично не мали лаг-фази на СА, що може пояснюватись можливістю розмноження цього виду не конідіями, а фрагментами міцелію певної довжини, проростання яких на повноцінному середовищі відбувається практично без затримки [Иванова, 1999; Иванова, Марфенина, 1998]. На ГА початок росту штамів цього виду відбувався через 24 год., а для решти штамів коливався в межах 7-39 год.
Наприкінці експерименту (240-432 год.) на обох середовищах максимальний радіус колонії мали представники видів U. consortiale, A. alternata, P. roseo-purpureum, C. cladosporioides та P. spinulosum. Мінімальний – штами C. sphaerospermum 5-1 та 60, виділені з високорадіоактивних субстратів.
Для переважної більшості вивчених нами штамів була характерна здатність генерувати 1,0-добові біоритми (Рис. 3).
Рис. 3. Характер росту Ulocladium consortiale 1728 (середнє значення біоритмів – 0,5 діб)
Найбільшими значеннями біоритмів (1,5-2 доби) характеризувались штами C. sphaerospermum, які мали найменшу швидкість росту. Найменші значення біоритмів – 0,5 доби – мали штами U. сonsortiale, які росли найшвидше. Тобто, порівнюючи тривалість біоритмів та радіальну швидкість росту, можна спостерігати певний зв’язок між ними – чим більше значення радіальної швидкості росту, тим менше тривалість біоритмів, і навпаки. Виключення становили лише штами A. alternata, які мали найвищі значення швидкості росту, але тривалість їх біоритмів складала 1-1,5 доби.
За середніми значеннями радіальної швидкості росту всі вивчені види розподілились на три основні групи: 1) види з найвищою швидкістю росту – U. consortiale (0,16-0,19 мм/год.) та A. alternata (0,15-0,20 мм/год.); 2) вид, швидкість росту якого була найнижчою – C. sphaerospermum (0,02-0,06 мм/год.); 3) інші досліджені види з проміжним положенням за цим параметром (0,07-0,15 мм/год.).
Порівняння радіальної швидкості росту на СА та ГА показало, що з 63 вивчених нами штамів, 32 росли на СА на 40-75% краще, ніж на ГА. Лише один штам (A. strictum 64, вилучений з приміщення 4-го блоку ЧАЕС) на голодному середовищі ріс на 56% краще, ніж на багатому (Рис. 4а). Решта (30 штамів) однаково росли на обох досліджених середовищах – багатому та голодному. Тенденція до такої подібності може передбачати толерантність грибів до широкого градієнту концентрацій вуглецю в поживному середовищі [Курченко, 1996, 1999].
Рис. 4. Ростові характеристики вивчених мікроміцетів
Вивчення галуження грибного міцелію на СА та ГА (ОГР) (Рис. 5) показало, що більшість досліджених штамів (21 з 23) утворювали краще галуження на СА або однаково галузились на цих двох середовищах (Рис. 4б). Лише 2 штами – M. isabellina 2 та P. spinulosum 2г – мали тенденцію до кращого галуження на голодному агарі. Обидва вони були виділені з субстратів, рівень радіоактивності яких був високим та становив 2,1·105 Бк/кг та 1,4·107 Бк/кг відповідно.
| 
