|
АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ
ім. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО
УДК 579.22:57.083
ЧОРНОГОР Наталія Павлівна
ДОСЛІДЖЕННЯ РІСТСТИМУЛЮЮЧИХ
ВЛАСТИВОСТЕЙ ЛІЗОЕНЗИМНОГО ПРЕПАРАТУ
STREPTOMYCES RECIFENSIS VARIANT LYTICUS
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 1998
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в науково-дослідному інституті біології Дніпропетровського державного університету.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Бабенко Юлія Семенівна
науково-дослідний інститут біології
Дніпропетровського державного університету,
гол. наук. співробітник
Науковий консультант: академік АНВШ України, доктор
біологічних наук, професор
Вінніков Альберт Іванович,
Дніпропетровський державний університет,
зав. кафедрою мікробіології та вірусології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Захарова Ірина Яківна,
Інститут мікробіології та вірусології
ім. Д.К.Заболотного,
провідний наук. співробітник
доктор медичних наук, професор
Кременчуцький Генадій Миколайович
Дніпропетровська медична академія,
зав. кафедрою мікробіології
Провідна установа: Київський державний університет ім. Т. Шевченко
Захіст відбудеться “ 17 ” червня 1998 року о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою:
252143, м.Київ, вул.Заболотного, б.154, ІМВ ім. Д.К.Заболотного
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного.
Автореферат розісланий “ 17 “ травня 1998 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Пуріш Л.М.
.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В основі сучасних біотехнологічних виробництв лежить мікробний синтез різних речовин, які мають широке практичне застосування. Центральною ланкою у промисловому виробництві біологічно активних речовин є вирощування мікроорганізмів. Ефективність вирощування продуцентів невід’ємно пов’язана з проблемою підвищення їх життєдіяльності, з розробкою засобів інтенсифікації їх росту та підвищення продуктивності.
Відомо, що основні фактори, які впливають на ріст та розвиток мікроорганізмів, поділяються на дві групи: внутрішньоклітинні фактори, обумовлені структурою та специфічними особливостями організму; а також зовнішні фактори, до яких відносяться склад живильного середовища, фізико-хімічні умови культивування. У регулюванні росту мікроорганізмів велике значення належить екзогенним факторам, таким як амінокислоти, піримідини, вітаміни та споріднені сполуки, які здатні в невеликих концентраціях збільшувати швидкість росту та біосинтетичну активність. При вирощуванні продуцентів знайшли широке застосування в якості стимуляторів росту різноманітні по хімічній природі, походженню та механізму дії речовини.
Перспективними являються продукти життєдіяльності мікроорганізмів, які здатні впливати на ріст та метаболізм близькоспоріднених та віддалених видів. Широко вивчаються в цьому плані стрептоміцети, у яких виявлено ряд ауторегуляторів, а також різні по хімічній природі речовини, які здатні стимулювати ріст інших мікроорганізмів та тварин.
Інтенсивний розвиток мікробіологічної промисловості, активне впровадження в неї останніх досягнень біотехнології визначають актуальність досліджень, які стосуються пошуку продуцентів нових біостимуляторів, встановленню їх природи та ролі в активації життєдіяльності мікроорганізмів, а також розробці технологій виробництва таких препаратів.
На протязі декількох років співробітниками Дніпропетровського університету вивчається новий препарат, одержаний на основі біосинтезу S. recifensis var. lyticus, який має широкий спектр літичної дії за рахунок літичних ендопептидаз та глікозидаз. Показана перспективність його використання для дезінтеграції клітин мікроорганізмів та в якості терапевтичного засобу (Соколова, 1986; Гніломедова, 1986; Кілочок, 1988).
Мета та задачі дослідження. Мета даної роботи складалась з дослідження рістстимулюючих властивостей препарату літичних ферментів S. recifensis var. lyticus та визначення нових галузей його практичного застосування.
Задачі досліджень складали такі питання:
- визначення рістстимулюючої активності ферментного препарату по відношенню до мікробних об’єктів;
- вивчення впливу нативного та автоклавованого препарату на кінетику та параметри росту мікроорганізмів;
- дослідження закономірностей біосинтезу бактеріолітичних ферментів та рістстимулюючого фактору у різних штамів продуцента;
- фракціонування, виділення та очищення рістстимулюючого фактору та вивчення його властивостей;
- дослідження впливу комплексного ферментного препарату на показники росту експериментальних тварин;
- вивчення імунотропних властивостей лізоензимного препарату.
Наукова новизна роботи. Отримані нові дані про здатність лізоензимного препарату стимулювати ріст мікроорганізмів, впливати на показники росту та імунологічний статус експериментальних тварин. Встановлено, що ефективність препарату залежить від його концентрації у живильному середовищі, видових та штамових особливостей тест-культури, а також від умов культивування. Вперше показано, що нативний препарат не тільки збільшує швидкість росту та накопичення біомаси досліджених мікроорганізмів, а також впливає на кінетику їх росту.
Одержані дані про тісний зв’язок рістстимулюючого фактору з кислими білками. Розроблено засіб виділення та очищення біостимулятора. На основі УФ-спектрів поглинання та методу аффінної хроматографії встановлено його глікопротеінову природу.
Практичне значення. Результати, отримані в дисертаційній роботі, вказують на перспективність використання лізоензимного препарату для стимуляції росту та збільшення виходу біомаси промислових мікроорганізмів. Вперше показана висока ефективність його застосування в якості кормової домішки при вирощуванні молодняка експериментальних тварин. Визначені дози препарату та схеми його використання. На основі цих даних були проведені науково-виробничі випробування препарату Г3х у ряді тваринницьких господарств при вирощуванні норок. Результати були розглянуті міжвідомчою комісією по випробуванню та реєстрації ветеринарних фармакологічних препаратів у СРСР (протокол №3 від 21 травня 1991 р.).
Новий ферментний препарат лізорецифін (умовна назва) має комплекс цінних властивостей (антимікробна, протеолітична активність, рістстимулююча та імунотропна дія), які свідчать про можливість його використання в різних галузях народного господарства.
Особистий внесок здобувача. Дисертанту належать ідеї та розробка програми експериментальних досліджень, аналіз одержаних результатів. Автором особисто виконано дослідження впливу лізоензимного препарату на ріст, кінетику та параметри росту мікроорганізмів, а також рістстимулююча дія на тваринах. Виділення та очищення рістстимулюючого фактору проведено особисто за консультативною допомогою д. б. н. Віннікова А. І., к. б. н. Жерносекова, вивчення імунотропних властивостей лізоензимного препарату проведено автором за консультативною допомогою к. м. н. Свіріденко А. І.
Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на VII та VIII з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989; Київ, 1993), на ІІІ–V Українському біофізичному з’їзді (Київ, 1995), на Всесоюзних конференціях “Мікроорганізми—стимулятори та інгібітори росту рослин та тварин” (Ташкент, 1989), “Мікробіологічні основи інтенсифікації рослинництва та тваринництва” (Алма-Ата, 1990), на конференціях молодих вчених (Тбілісі, 1987; Москва, 1989), на Міжнародних конференціях “Біотехнологія одержання кормового білку, екологічно чистих продуктів, підвищуючих урожайність, преміксів, ферментів та вітамінів кормового призначення” (Дніпропетровськ, 1995), “Мікроорганізми та їх метаболіти у народному господарстві” (Кишинів, 1996), а також на наукових конференціях Дніпропетровського державного університету (1987—1997 рр.).
Публікації. Основні результати досліджень опубліковані в 10 наукових працях.
Структура та об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів результатів власних досліджень, заключення, висновків та двох додатків.
Робота вміщує 16 рисунків та 26 таблиць. Дисертація викладена на 154 сторінках. Список використаних літературних джерел включає 244 найменувань, з яких 77 іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з двох розділів, що висвітлюють питання про вплив зовнішніх факторів на ріст та біосинтетичну активність мікроорганізмів при їх промисловому вирощуванні, а саме стимуляторів хімічної природи та стимуляторів мікробного походження. Наведено матеріали про спеціальні фактори росту та неідентифіковані стимулятори, ауторегулятори росту мікроорганізмів, критично проаналізовані різні точки зору про літературні дані відносно здібності антибіотиків стимулювати ріст организмів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об’єктом дослідження був штам Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 (Шинкаренко, 1979) та препарати літичних ферментів Г3х та Г10х, отримані на основі біосинтезу за дослідно-промисловими умовами.
Продуцент вирощували в глибинних умовах (220 об/хв) на оптимізованому ферментаційному середовищі (Кілочок, 1986).
Літичну активність визначали турбодиметричним методом (Isono, Takahashi, Jamadzaki, 1972). Реакційну суміш, яка містить 1 мл ферментного розчину та 1 мл клітин тест-культури (вихідна оптична щільність реакційної суміші в 0,5 см кварцевій кюветі складала 0,5–0,6), інкубували на протязі 30 хвилин при 550С. За одиницю активності приймали таку кількість ферменту, яка знижувала оптичну щільність суспензії на 0,001 за 1 хвилину в 1 мл реакційної суміші при розведенні ферменту, здатному сприяти лізису клітини на 25–30%. В якості субстрату (тест-культури) бактеріолітичних ферментів використовували відмиті інтактні клітини S. aureus 209P, M. lysodeikticus.
При визначенні рістстимулюючої активності продуцента, лізоензимного препарату, а також різних фракцій, які отримували при виділенні, використовували в якості тест-культури штам C. guilliermondii 249. Накопичення біомаси оцінювали оптичним методом на ФЕК-56 при 540 нм (кювета 0,5 см). За рістстимулюючу активність дослідних проб приймали величину приросту біомаси у порівнянні з контролем, яку виражали у відсотках. Питому активність фракцій, одержаних при ультрафільтрації, гель-фільтрації та афіній хроматографії, розраховували на 1 мг білку.
За умовну одиницю стимулюючої активності було прийнято мінімальну кількість препарату (або культуральної рідини), яке викликає збільшення приросту біомаси C. guilliermondii 249 у порівнянні з контролем на 30% при вирощуванні тест-культури на цукровому бульоні в глибинних умовах (220 об/хв) протягом 24 год при 280С. При розрахунку рісттимулюючої активності використовували дані тих визначень, у яких приріст біомаси дріжджів коливається в межах 20–50%.
При вивченні впливу автоклавованого та нативного препарату на кінетику та параметри росту мікроорганізмів визначали фази затримки та експоненційного росту, обчислювали врожай, розраховували значення питомої швидкості росту (μ год-1), час подвоєння біомаси (Шлегель, 1987).
З метою виділення та очищення стимулятору використовували ряд засобів (Скоупс, 1985). Водні розчини препарату фільтрували через ультрамембрани УАМ-50, 100, 150, 200 під тиском газоподібного азоту 1,5–2 атм.
Електродіаліз проводили на електрофоретичному приладі ЕФМ-2. Використовували електроди-накопичувачі з різною полярністю (+ та –). Гель-фільтрацію здійснювали на сефадексі G-75 та G-100 (Pharmacia, Швеція). Врівноваження колонки та елюцію проводили 1М розчином NaCl.
Аффінну хроматографію проводили з використанням конканаваліну-А-сефарози в якості сорбенту (Pharmacia, Швеція). Колонку (2×5 см) урівноважували 1М розчином NaCl, який містив MgCl2, MnCl2, CaCl2 (по 1 ммолю). Елюцію глікопротеідів проводили 10%-ним метил-глюкопіранозидом.
При використанні методів ультрафільтрації, електролізу, гель-фільтрації та аффінної хроматографії в отриманих фракціях визначали кількість білку та рістстимулюючу активність. Білок визначали методом Lowry e. a. (1951) або спектрофотометрично на СФ-26 по поглинанню при 280 нм, рістстимулюючу активність—за % приросту біомаси. Вуглеводи визначали з використанням реактиву Антрона (Неменова, 1972).
Ультрафіолетові спектри рістстимулюючих фракцій, одержаних при гель-фільтрації, реєстрували на спектрофотометрі Spekord M-40 (ДДР), товщина поглинаючого шару—0,5 см.
При дослідженні впливу лізоензимного препарату на показники росту та імунологічний статус експериментальних тварин було використано щури лінії “Вістар” та миші лінії СВА×С57BL/F1. В кожній серії іспитів групи компонували за принципом аналогів.
З метою оцінки впливу лізоензимного препарату на імунологічний статус експериментальних тварин використовували реакцію бластної трансформації лімфоцитів, основану на включенні міченого тимідину (Кисельова, 1958), визначали кількість антиген-реактивних клітин методом імунних розеток (Фрімел, 1987; Пастер та ін., 1989), кількість антитілоутворюючих клітин—методом локального гемолізу (Фрімел, 1987).
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Сепетлієвим (1968), з використанням довірчого коефіцієнту Ст’юдента.
ВПЛИВ ЛІЗОЕНЗИМНОГО ПРЕПАРАТУ НА РІСТ МІКРООРГАНІЗМІВ
Основні аспекти наших досліджень стосувались визначення рістстимулюючої активності ферментного препарату Г10х на різних мікробних об’єктах та її залежності від умов культивування; вивчення впливу нативного та автоклавованого препарату на кінетику та параметри росту мікроорганізмів.
Встановлено, що рістстимулююча дія лізоензимного препарату розповсюджується на представників кокової групи бактерій, бацилярні форми, грамнегативні бактерії та дріжджі. Нативний препарат у концентрації від 0,02% до 0,16%, внесений у живильне середовище до інокуляції мікроорганізмами, збільшує накопичення біомаси. Величина приросту біомаси залежала від концентрації препарату у середовищі, а також від видових та штамових особливостей мікроорганізмів. Найбільший ефект стимуляції спостерігався при концентрації препарату 0,04–0,08%. Максимальний приріст біомаси було виявлено у дріжджів (60–80% від контролю). На прикладі Bac. thuringiensis при вирощуванні на бульоні показано, що препарат не лише збільшує накопичення біомаси, але й стимулює формування життєздатних спор. Рістстимулююча активність препарату зберегалась і після термічної обробки (автоклавування).
Встановлено, що ефект стимуляції досліджуваного препарату в значній мірі залежить від умов культивування. Відомо, що аерація має важливе значення для накопичення біомаси мікроорганізмів. При вирощуванні на м’ясо-пептоному бульйоні в стаціонарних умовах (без перемішування) та на шутелі (110 об/хв) накопичення біомаси бактерій, у порівнянні з контролем, збільшується на 52,6–53% та 34–47,7%. Більш істотну різницю виявлено у дріжджів: в стаціонарних умовах препарат збільшує приріст біомаси на 367%, на шутелі—на 250%, але при активній аерації (220 об/хв) на фоні інтенсивного розмноження, ефект стимуляції знижується і складає лише 64% від контролю (табл. 1).
Таблиця 1 — Рістстимулююча ефективність автоклавованого
препарату в залеж-ності від умов аерації мікроорганізмів,
вирощених на живельному бульйоні
Певне значення має також живильне середовище та джерела вуглецевого живлення. При вирощуванні дріжджів в умовах недостатньої аерації (на шутелі) у синтетичному середовищі Рідер з різними джерелами вуглецевого живлення виявлено високу стимулюючу ефективність препарату. Накопичення біомаси збільшилось: на патоці—на 290%, на глюкозі—на 450%, на важкодоступному субстраті парафіну—на 830%. Але при активній аерації (220 об/хв), при інтенсивному розмноженні тест-культур, приріст біомаси досягав лише 72–75% у порівнянні з контролем (табл. 2).
Таблиця 2 — Вплив автоклавованого препарату на накопичення біомаси дріжджів на середовищі Рідер в залежності від
джерела вуглецевого живлення
При вирощуванні різних видів дріжджів на м’ясо-пептоному бульйоні та пивному суслі в умовах активної аерації (220 об/хв) препарат в концентрації 0,08% виявив різний ефект стимуляції. На бульйоні ефект стимуляції досягав 65–100%, на пивному суслі—лише 7–25%. При вирощуванні Bac. thuringiensis на дріжджеполісахаридному середовищі ми спостерігали навіть зниження активності спороутворення. Це можна пояснити тим, що вказані середовища містять природні біостимулятори і додаткове внесення стимуляторів до таких середовищ мало ефективне, або негативно впливає на процес росту.
При вивченні впливу ферментного препарату Г10х на кінетику та параметри росту мікроорганізмів на прикладі Candida tropicalis було встановлено, що автоклавований препарат у концентрації 0,04% не впливає на довготривалість фаз розвитку, але питома швидкість росту, врожай та економічний коефіцієнт у досліджуваної культури були вищі, ніж у контролі. Вплив стимулятору було виявлено вже у лаг-фазі: за 9 год потайного періоду споживалось більше глюкози, ніж у контролі, відповідно більше знижувалися значення pH.
З метою розподілу ефектів, пов’язаних з дією літичних ферментів та стимулятору росту, подальші дослідження проводились у двох модифікаціях: культури мікроорганізмів вирощували на живильному бульйоні в присутності нативного та автоклавованого препарату (табл. 3).
Таблиця 3 — Вплив автоклавованого та нативного ферментного
препарату Г10х на параметри росту мікроорганізмів
Встановлено, що дослідний препарат впливає на параметри росту мікроорганізмів; автоклавований препарат скорочує лаг-фазу у бактерій, збільшує питому швидкість їх росту та накопичення біомаси. Нативний препарат збільшує тривалість лаг-фази як у бактерій, так і у дріжджів. В дослідах з нативним препаратом показники питомої швидкості росту у дослідних бактерій та дріжджів вищі, ніж під впливом автоклавованого препарату.
У фазі експоненційного росту дріжджів нативний препарат викликає додаткову затримку росту (рис. 1), але завдяки більшій швидкості росту урожай досягає такого ж рівня, як і при дії автоклавованого препарату. На прикладі дріжджів чітко простежується те, що ефект стимуляції залежить також від дози препарату: при низьких концентраціях (0,04%) його дія виявляється тільки на початку фази експоненційного росту, коли є сприятливі умови живлення, аерації та невелика густота клітин. При концентрації 0,08–0,16%, препарат стимулює ріст клітин не лише в першій, але і в другій половині експоненційної фази.
 
Рисунок 1 — Вплив різних концентрацій автоклавованого (а) та
нативного (б) препарату на динаміку росту C. guilliermondii:
1 – контроль, 2 – концентрація препарату в живильному
середовищі—0,04%, 3 – 0,08% та 4 – 0,16%
БІОСИНТЕЗ, ВИДІЛЕННЯ ТА ВЛАСТИВОСТІ РІСТСТИМУЛЮЮЧОГО ФАКТОРУ
В даній роботі ми мали можливість порівняти активність та динаміку біосинтезу рістстимулюючого фактора та літичних ферментів у вихідного штаму та селекціонованого 2Р-15, який було одержано на основі відбору ріфампіциностійких мутантів.
 
Рисунок 2 — Закономірності біосинтезу літичних ферментів та стимулятору росту селекціонованого 2Р-15 (а) і вихідного 2435 (б) штамів. Рістстимулююча активність - 1; літична активність (ЛА) по відношенню до тест-культур: S. aureus - 2, M. lysodeikticus - 3
Результати проведених досліджень свідчать про те, що підвищення стафілолітичної активності у процесі селекції штаму корелює із збільшенням біосинтезу інших ферментів та стимулятора росту. Так, біосинтез стафілолітичних ферментів штаму 2Р-15 у порівнянні з вихідним зріс в 2 рази (5600 од/мл), глікозидазна активність підвищилась в 3,8 рази (8800 од/мл), а рістстимулююча—у 2,4 рази. Динаміка накопичення досліджених ферментів, а також стимулятора росту у вихідного та селекційованого штамів схожі. Біосинтез рістстимулюючого фактору здійснюється тільки у фазі експоненційного росту, в зв’язку з чим пік його активностей попереджає на 12 годин максимум накопичення стафілолізинів та глікозидаз (48-60 год). Отримані дані мають важливе значення при визначенні часу завершення ферментації у промисловому виробництві комплексного лізоензимного препарату.
З метою виділення та очищення рістстимулюючого фактору з ферментного препарату Г10Х було випробувано ряд методів. У виборі методів ми виходили з припущення, що виявлений у складі комплексного лізоензимного препарату термостійкий стимулятор відноситься до низькомолекулярних біологічно активних речовин.
Відділити біостимулятор від основного пула білку нам вдалося при використанні методу гель-фільтрації на сефадексі G-75 з подальшою елюцією сольовими розчинами високої молярності (1М розчином NaCl) (рис. 3). Було встановлено, що основна маса білку виходить двома великими піками, потім виходять фракції з низьким його вмістом. На цьому фоні виявлено ряд піків (Mr 2670D—707D)з рістстимулюючою активністю (приріст біомаси дріжджей досягав 35–50%).
Отримані фракції I–IV були досліджені методом УФ-спектрофотометрії. Встановлено, що значення оптичних щільностей для цих фракцій знаходяться в інтервалі 1,18–1,26, що вказує на їх схожий характер, а розширення смуг поглинання дозволили припустити наявність у виділених фракціях компоненту вуглеводної природи. В цих фракціях нами було виявлено вуглеводи, вміст яких коливався в межах 0,06–0,19 мг/мл.
При дослідженні об’єднаного препарату (I-IV фракції) використовували метод аффіної хроматографії на конканавалін-А-сефарозі. Встановлено, що стимулюючий фактор сорбується на колонці та елююється 10%-ним розчином метил-L, D-глюкапіранозида, що вказує на наявність в углеводній частині стимулятора росту термінальних L, D-манозильних, L, D-глюкозильних або специфічно східних груп (рис. 4).
При послідовному використанні гель-фільтрації та аффінної хроматографії ступінь очищення рістстимулюючого фактору досягла 61–98 разів (табл. 4).
Рисунок 3 — Фракціонування лізоензимного препарату методом
гель-фільтрації на колонці (1×40 см) з сефадексом G-75. Елюцію
проводили 1М розчином NaCl. Вільний об’єм колонки 19,5 мл.
Профілі елюціі білку (А280)—1, розподіл величин активності рістстимулюючого фактору—2
Рисунок 4 — Хроматографія на конканавалін-А-сефарозі об’єднаних істстимулюючих фракцій, отриманих після гель-фільтрації. Стрілкою вказано початок елювання. Профілі елюції білку (А280)—1, розподіл величин активності рістстимулюючого фактору—2
| 
