|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
БЄЛИХ ІРИНА АНАТОЛІЇВНА
УДК 57.043:577.11:612.014.464
ДІЯ ОЗОНУ НА БІОПОЛІМЕРИ ТА ОЗОНОВІ МЕТОДИ В КРІОБІОЛОГІЇ
03.00.19 – кріобіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2006
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник:
Доктор біологічних наук, професор Зінченко Василь Демидович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник відділу кріобіофізики, м. Харків
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділом низькотемпературного консервування, м. Харків
Доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, головний науковий співробітник відділу молекулярної біології, м. Київ
Провідна установа:
Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерство освіти і науки України, кафедра біохімії
Захист відбудеться „21” березня 2006 р. о 13.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, м. Харків, 61015
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська, 23, м. Харків, 61015
Автореферат розісланий „16” лютого 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Зберігання живих систем при температурах нижче температури склування рідини в системі і можливість відновлення життєздатності після дії низьких температур набуває статусу біотехнології, практичне застосування якої швидко розвивається. Кріоконсервування клітин покликане, в першу чергу, до вирішення таких проблем, як зберігання рідких та зникаючих біологічних видів і застосування кріоконсервованих клітин у наукових дослідженнях і лікуванні.
При довгостроковому зберіганні клітин враховуються результати досліджень і досвід, які отримані при кріоконсервуванні інших біологічних об’єктів, а також механізми кріоконсервування і кріозахисту, які мають загальний характер для різних біологічних систем. За останні 50 років встановлено декілька більш чи менш детальних механізмів ушкодження та виживання живих систем при низьких температурах.
Вагомим фактором кріоушкодження є осмотична дегідратація клітин при виморожуванні частини води в системі, що призводить до зморщування клітин і до високих (токсичних) концентрацій розчинених сполук у цитоплазмі. Висока концентрація позаклітинних солей викликає “сольове навантаження” при низьких температурах, що може призвести до осмотичного дисбалансу і надмірного набрякання клітин і лізису при відтаюванні [B.J. Lyuet, 1953].
Інший механізм дії гіперконцентрації солей полягає у тому, що ушкодження виникає в результаті зневоднення клітини до мінімально можливого значення.
Витіснення клітин у вузькі канали між кристалами льоду призводить до щільної упаковки клітин і тісного контакту з льодом, що викликає механічні ушкодження [T. Меryman, 1963, 1989].
До ушкоджуючих факторів заморожування біологічних систем відносять також змінення рН, термотропні перебудови мембран і зв’язані з цим змінення бар’єрної функції мембран, руйнування біологічного об’єкту в результаті термомеханічних напружень.
Однак, термін “ушкодження” вимагає уточнення. В деяких випадках біологічні об’єкти можуть витримувати глибоке охолодження, і хоча після дії холоду відбуваються метаболічні зрушення, вони можуть зникати з часом у нормальних фізіологічних умовах. У таких випадках говорять про нелетальні ушкодження. Виявлено, що деякі сполуки та іони, наприклад, неоміцин, пептон, Mg2+, Са2+ ефективно відновлюють холодові ушкодження.
В останні роки з’явилось багато публікацій відносно стимулюючої дії малих доз озону на функціонування різних біологічних систем, що свідчить на користь можливості використання вказаної властивості озону для інтенсифікації репараційних процесів у біологічних системах після дії холоду. Інший аспект застосування озонових технологій у кріобіології пов’язаний зі здатністю озону у високих дозах знешкоджувати мікроорганізми. Кріобіологічні технології у більшості випадків пов’язані з чисельними лабораторними маніпуляціями над біологічним матеріалом, де стерильність має велике значення, оскільки на кожному етапі існує ризик контамінації біологічного матеріалу мікроорганізмами. Озонові технології є також дуже привабливими для розробки способів стерилізації кріобіологічного обладнання.
Ці посилки були підґрунтям для виконання даної роботи і зумовили необхідність детального вивчення дії озону на клітинному і молекулярному рівнях.
Чутливість клітин до факторів кріоушкодження зв’язують, в першу чергу, із станом цитоплазматичних мембран, що вимагає дослідження дії малих доз озону на цілісність клітинних мембран в умовах, які моделюють заморожування біологічних систем.
Розуміння механізмів дії озону на біологічні системи вимагає знання особливостей взаємодії озону з біополімерами. Для досліджень в даній роботі були вибрані бичий сироватковий альбумін і ацетилхолінестераза. Отримані в роботі результати використані з одного боку для експериментальної перевірки і чисельної оцінки ефектів дії різних доз озону на деякі біологічні системи, а з іншого – для розробки рекомендацій щодо використання озонових технологій на різних етапах кріоконсервування для покращення технологій кріоконсервування біологічних об’єктів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіофізики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України у відповідності з планами науково-дослідних робіт за темами “Дослідження можливих механізмів профілактичної і терапевтичної дії озону і перекису водню, які генеруються у газовому розряді при використанні в акушерстві, гінекології, а також як стимуляторів метаболічних процесів в біологічних об’єктах після кріоконсервування” (номер державної реєстрації 0102U002025) і “Підвищення ефективності технологій кріоконсервування біологічних систем шляхом інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду і зниження ризику мікробної контамінації на різних етапах кріоконсервування” (номер державної реєстрації 0105U03918).
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – встановити особливості впливу малих доз озону на репараційні процеси в деяких біологічних об’єктах після дії холоду в реальних і модельних експериментах, ступінь вираженості цього впливу, а також особливості дії високих доз озону у газовій фазі і у водних розчинах на мікроорганізми.
Для досягнення цієї мети були вирішені наступні задачі:
- Дослідити дію малих доз озону в ростовому середовищі на кінетику росту мікроорганізмів Escherichia coli у нормальних фізіологічних умовах.
- Дослідити вплив малих доз озону на проліферативні властивості мікроорганізмів (бактерій, дріжджоподібних грибів) після заморожування-відтавання і у нормальних умовах.
- Дослідити вплив малих доз озону на стійкість еритроцитів до гіпертонічного гемолізу.
- Дослідити вплив озону на структурний стан білка – бичого сироваткового альбуміну та ферментативну активність ацетилхолінестерази.
- Дослідити динаміку інактивації деяких мікроорганізмів (бактерій, дріжджоподібних грибів, спорових форм бактерій) озоном у газовій фазі і водних розчинах.
- На підставі отриманих експериментальних результатів рекомендувати можливі шляхи використання озону в технологіях кріоконсервування біологічних об’єктів.
Об’єкт дослідження. Репараційні і проліферативні процеси в біологічних об’єктах після дії різних доз озону і заморожування-відтавання, процеси інактивації мікроорганізмів озоном у газовій фазі та у водних розчинах.
Предмет дослідження. Озон у газовій фазі і водних розчинах, культури бактерій Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, дріжджоподібні гриби Candida albicans, бичий сироватковий альбумін, фермент ацетилхолінестераза, еритроцити донорської крові людини.
Методи дослідження. У роботі було використано біофізичні (оптична спектроскопія), біохімічні та мікробіологічні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше експериментально показано, що в присутності озону в певних дозах у ростовому середовищі М9 зростає проліферативна активність бактерій Escherichia coli.
Уперше встановлено, що під дією малих доз озону після заморожування-відтавання активізуються репараційні процеси у дріжджоподібних грибах Сandida albicans і величина цього ефекту є дозо-залежною.
Доведено, що стійкість еритроцитів до гемолізу в гіпертонічних умовах зростає у присутності певних доз озону і знижується при перевищенні цих доз.
Уперше показано, що активність ацетилхолінестерази зростає під дією малих доз озону і знижується при підвищенні деякого порогового значення дози.
На підставі отриманих результатів встановлено, що озон у визначених дозах може сприяти інтенсифікації репараційних процесів після дії холоду на біологічні об’єкти і тому може бути використаний у технології кріоконсервування біологічних об’єктів.
Практичне значення одержаних результатів. Виявлений у роботі ефект стимуляції репараційних процесів в мікроорганізмах малими дозами озону після заморожування-відтавання може бути підґрунтям для розробки нових протоколів кріоконсервування. Встановлений експериментально ефект дії малих доз озону на стійкість еритроцитів до гіпертонічного лізису може знайти застосування при оптимізації процедури кріоконсервування еритроцитів і, можливо, інших клітин. Важливе в практичному плані значення має також встановлення факту, що озон стимулює ріст деяких видів бактерій у нормальних фізіологічних умовах. Цей ефект може знайти застосування в експериментальній та промисловій мікробіології. Результати дослідження інгібування росту мікроорганізмів високими дозами озону в газовій фазі і встановлені при цьому концентрації і дози озону, необхідні для повної інактивації мікроорганізмів, можуть мати безпосереднє практичне застосування при стерилізації озоном низькотемпературних сховищ та іншого кріобіологічного обладнання, приміщень, низькотемпературних банків, боксів і медичного інструментарію.
Особистий внесок здобувача полягає у підготовці аналітичного огляду літератури, проведенні експериментальних досліджень, аналізі і узагальненні результатів досліджень та їх підготовці до опублікування. В наукових працях, виконаних у співавторстві здобувачу належить планування дослідницької роботи, організація експерименту та участь в його реалізації, обробка та аналіз результатів досліджень.
Співавторами робіт, опублікованих за темою дисертації є:
Зінченко В.Д. – консультації щодо вибору методик досліджень в роботах [2,3,5,6,7,8,9,10,11,13,14,15]; Грищенко В.І. – консультації з методів дослідження біологічної дії озону в роботах [6,14]; Зінченко О.В. – консультації щодо вибору методики дослідження в роботах [8,11,15]; Дюбко Т.С. – допомога у підготовці експериментів і консультації щодо проведення досліджень біологічних об’єктів методами спектроскопії і спектрофлуориметрії в роботах [2,9,13]; Висеканцев І.П., Каднікова Н.Г., Казанжан С. В. – консультації з проведення мікробіологічних досліджень і допомога у підготовці експериментів з дослідження дії озону на мікроорганізми в роботах [1,3,7,10,11,14,15]; Гузій Ю.І., Голота В.І., Сухомлин Є.О., Ковальчук І.М.,– консультації та допомога в збірці експериментального озонаторного обладнання [1,6]; Сахаров Г.В. – допомога в підборі матеріалів з проблеми дезінфекції та зберігання води в роботах [1,8]; Мусіна І.А. – допомога в оформленні патенту [7]. В роботах [5,15] участь Мусіної І.А. полягає у виконанні частини дослідження дії озону на стан гемоглобіну в еритроцитах, що не ввійшло до даної дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: VIII Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Методи спектроскопії в спеціальних технологіях” (м. Київ, 2003 р.); Міжнародній конференції з озонотерапії (м. Харків, 2003 р.); Конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (м. Алушта, 2004 р.); Конференціях молодих вчених Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України “Холод в біології і медицині”(м. Харків, 2004, 2005 р.р.); III Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень, 2004”
(м. Дніпропетровськ); І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (м. Харків, 2004 р.); VIII Міжнародній конференції “Клінічна мікробіологія і антибактеріальна терапія: проблеми і рішення” (м. Харків, 2005 р.); І Всеросійській конференції „Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии”
(м. Москва, Росія, 2005 р.); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Современные аспекты применения озона в медицине и экологии”
(м. Євпаторія, 2005 р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт: 2 у фахових виданнях, 8 тез доповідей, 2 деклараційні патенти на винахід.
Обсяг та структура дисертації. Матеріали дисертації викладено на 146 стор., які включають 112 стор. основного змісту, 26 рисунків, 19 таблиць, список використаних джерел літератури у кількості 231 на 22 стор. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження
Озон для досліджень отримували методом електросинтезу з кисню або з повітря за допомогою установки, розробленої в ІПКіК НАН України разом з Інститутом плазмової електроніки і нових методів прискорення національного наукового центру „Харківський фізико-технічний інститут”.
Концентрацію озону у газовій фазі і водних розчинах вимірювали спектрофотометричним методом, визначаючи екстинкцію на смузі Хартлі (довжина хвилі 255 нм) за допомогою спектрофотометра Specord UV VIS.
У дослідженнях застосовували комерційні стандартні препарати: 1) бичий сироватковий альбумін (БСА) фірми “SERVA”, Fraction V, мм 6700; 2) ацетилхолінестеразу сироватки крові коня (ХЕ), КФ 3.1.1.8, VI клас чистоти, стандартної активності 25 АО/мг, виготовлену Пермським НДІ вакцин і сироватки. Концентрація білка і ферменту в розчинах складала 0,2 – 2 мг/мл.
Озон вводили у розчини БСА і ХЕ шляхом барботування розчинів озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону від 6 до 8 мг/л.
Активність ферменту визначали за стандартною методикою фотоколориметричним методом із субстратом бутирилтіохоліна йодидом [Блажеєвський М.Є., 2002]. Фотоколориметричні вимірювання проводили на довжині хвилі 400 нм.
Реєстрацію спектрів власної флуоресценції БСА і ХЕ проводили при довжині лінії збудження 280 нм. Спектри поглинання біополімерів реєстрували в діапазоні довжин хвиль 260 – 300 нм.
Спектральні дослідження проводили у термостатованих кюветах при температурі (22+10С).
Дослідження біополімерів проводили оптичними методами за допомогою спектрофотометрів Specord UV VIS (Німеччина) і Pye Unicam SP – 8000 (Англія), а також методами спектрофлуориметрії на приладах F – 4010 (фірма “Hitachi”, Японія) і Cary Eclipse (фірма Varian, США).
В дослідженнях використовували донорську кров людини, отриману із Харківської обласної станції переливання крові. Еритроцити відділяли від плазми шляхом центрифугування крові протягом 5 – 10 хвилин при 1500 – 2000 об/хв., далі клітини суспендували у фізіологічному розчині.
Чутливість еритроцитів до гіпертонічного шоку визначали спектрофотометричним методом шляхом вимірювання виходу гемоглобіну в позаклітинне середовище і виражали у відсотках по відношенню до загальної кількості гемоглобіну у вихідній суспензії клітин. Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ – 4А при довжині хвилі 543 нм. Для визначення 100 % гемолізу еритроцити руйнували тритоном Х – 100 (0,1 %).
Кріоконсервування еритроцитів здійснювали за методикою Воротіліна А.М. з кріопротектором “Пропандіосахароль” [Воротилин А.М., 1987]. Заморожування еритроцитів проводили шляхом занурення зразків у рідкий азот у спеціальних чохлах [Воротилин А.М., 1987]. Відігрівали зразки у два етапи: перший етап – повільне відігрівання від –1960C до –1000C зі швидкістю 50С/хв.; другий етап – відігрівання у водяній бані при 42 – 450C .
Для досліджень використовували культури бактерій Escherichia coli, штам B (із Російської колекції промислових мікроорганізмів ДНДІ генетики, Москва) і Staphylococcus aureus, штам 209 (із колекції Харківського інституту імунології, вакцин і сироваток АМН України), Bacillus subtilis АТСС 6633 і дріжджоподібні гриби Candida albicans АТСС 835-653 (2 останніх штами отримані із колекції АОЗТ “Здоров’я”, Харків).
Культури бактерій Escherichia coli і Staphylococcus aureus вирощували на м’ясопептонному агарі (МПА) при температурі 370C протягом 20 – 22 годин, дріжджоподібні гриби Candida albicans – на скошеному агарі протягом 40 годин при температурі 300C [Лабинская В.С., 1978]. Аспорогенну форму бактерій Bacillus subtilis вирощували на скошеному МПА при температурі 370C протягом 20 – 22 годин. Спорову форму бактерій Bacillus subtilis отримували при культивуванні на “голодному агарі” [Лабинская В.С., 1978] протягом 48 годин при температурі 370C. Життєздатність мікроорганізмів оцінювали “чашковим методом Коха” за кількістю макроколоній, які сформувалися на агаризованих середовищах [Лабинская В.С., 1978]. Серійні розведення проводили у фізіологічному розчині (0,9 % NaCl).
Культуру Escherichia coli вирощували на агаризованому середовищі МПА, змивали і переносили у сольове середовище М9 з додаванням глюкози. Склад середовища М9: на 1 л дистильованої води: Na2HPO4 – 6 г, KH2PO4 – 3 г, NH4Cl – 1 г. Після автоклавування додавали: 10 мл 0,01М розчину CaCl2, 1 мл 1М розчину MgSO4, 5 мл 40% розчину глюкози; рН = 7,0 [Миллер Дж., 1976]. Паралельно озонували середовище М9 шляхом барботування озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л. Концентрація розчиненого озону в середовищі складала 0,0013; 0,013; 0,062; 0,12; 0,35; 0,57 мг/л. В отримані розчини вносили суспензію бактерій із розрахунку 107 клітин на 50 мл озонованого розчину. Бактерії культивували в термостатованій качалці при температурі 370C, при обертанні платформи зі швидкістю 100 об/хв. Час культивування після внесення інокуляту становив 6 – 8 годин до початку стаціонарної фази росту культури. В процесі культивування відбирали проби і будували логарифмічні криві росту періодичних культур бактерій на підставі вимірювання оптичної густини. Оптичну густину вимірювали на фотоелектроколориметрі ФЭК – 56, використовуючи кювету об’ємом 1 мл і зелений світлофільтр.
Кінцева концентрація озону в зразках Escherichia coli i Candida albicans складала 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80 г/мл. Програмне заморожування зразків мікроорганізмів Escherichia coli i Candida albicans проводили за двома режимами: 20С/хв. від +180С до –700С з наступним зануренням у зріджений азот на програмному заморожувачі “Cryoson SV” (Німеччина). Після заморожування зразки діставали з азоту і відігрівали на водяній бані при температурі 370C. Далі проводили висів бактерій на чашки Петрі.
Результати власних досліджень та їх обговорення
В роботі досліджено кінетику загибелі бактерій Escherichia coli, Staphylococcus aureus, спорової форми Bacillus subtilis, дріжджоподібних грибів Candida albicans під дією озону в газовій фазі, в різноманітних суспензійних середовищах і на поверхні міліпорових фільтрів у зневодненому вигляді. В таблиці 1 подані результати дослідження у вигляді залежності числа колонієутворюючих одиниць в 1 мл (КУО/мл) від тривалого їх інкубування в озоно-повітряній суміші з концентрацією озону 6,8 мг/л при температурі 200C.
Як видно з наведених даних інактивація мікроорганізмів настає через 6 годин інкубації в газовому озоно-повітряному середовищі з концентрацією озону 6,8 мг/л.
Аналогічні дослідження проводили з мікроорганізмами, що були висіяні в рідинні середовища: дистильовану воду, фізіологічний розчин, м’ясопептонний бульйон (МПБ) і бульйон Сабуро (для дріжджоподібних грибів). На відміну від дії газоподібної озоно-повітряної суміші, повна загибель мікроорганізмів в рідинних середовищах наставала протягом більш короткого часу – приблизно через 60 хв. при барботуванні середовищ озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л. На живильних середовищах повної загибелі мікроорганізмів протягом цього часу не відбувалось, можливо, внаслідок того, що ефективна концентрація озону зменшується в результаті реакції з органічними сполуками середовища.
Таблиця 1
Життєздатність мікроорганізмів, нанесених на міліпорові фільтри після інкубування їх протягом різного часу в озоно-повітряній суміші з концентрацією озону 6,8 мг/л при 200С
Примітки:
-ч – середнє арифметичне,  – середньоквадратичне відхилення, р – рівень значимості
На рис. 1 представлені кінетичні криві загибелі бактерій Escherichia coli в різних середовищах при обробці їх барботуванням озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л, а також у середовищах, які заздалегідь були насичені озоном шляхом барботування озоно-кисневою сумішшю при температурі 200С.
Рис. 1. Кінетичні криві загибелі бактерій Escherichia coli при обробці озоно-кисневою сумішшю. Суцільні лінії – барботування озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л при температурі 200С: 1 – в дистильованій воді, 2 – в 0,9 % розчині хлористого натрію і 3 – в МПБ. Пунктир – інкубація мікроорганізмів, висіяних в ті ж середовища: 4 – дистильована вода,
5 – 0,9 % розчин хлористого натрію і 6 – МПБ, попередньо оброблені протягом 30 хв. барботуванням озоно-кисневою сумішшю з концентрацією озону 6,8 мг/л при температурі 200С.
| 
