|
НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ
Стрижельчик Ніна Георгіївна
УДК 575.224.4/.6:[576.8+595.773.4+599.32]:578.083.5
ГЕНЕТИЧНІ особливості мутагенезу, індукованого новими ІММОБІЛІЗОВАНИМИ сполуками
03.00.15 – генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Виявлення причинного зв’язку індукованих мутацій з появою злоякісних новоутворень, вроджених вад розвитку та спадкових хвороб обумовили необхідність пошуку ефективних засобів захисту людини від мутагенних впливів (М.П. Дубінін, 1999; М.П. Бочков, 1996; 1997; IARC, 1993; І.Р. Бариляк, 2001; 2003). Профілактика канцерогенезу або його інгібування реальні лише на початкових стадіях цього процесу. Вплив у передініціаційний період спрямований на недопущення канцерогенних агентів у клітину і, таким чином, на захист генетичних структур (Т.Д. Кужир, 1995; 1999). Одним з підходів до рішення цієї проблеми є іммобілізація мутагенних препаратів на полімерних матрицях. Іммобілізація з точки зору мутагенного процесу є фактором, модифікуючим мутагенну дію цих речовин (В.С. Міхеєв і співавт., 1993).
Особливе місце у життєдіяльності людини займають такі широко розповсюджені речовини як харчові добавки, багато з яких виявилися сильними канцерогенами (А.Д. Дурнєв, 1998; 2001).
Актуальним вважається як створення й впровадження у харчову промисловість нових безпечних харчових добавок, так і розробка інформативних схем і своєчасне тестування новостворених і вже існуючих харчових добавок на мутагенність. Ряд авторів вважають одним із найбільш перспективних напрямів у галузі пошуку нових безпечних барвників іммобілізацію різноманітних хромофорів на полімерних матрицях (Б.Ю. Ясницький, 1985). Однак насторожує той факт, що при створенні іммобілізованих барвників у ролі хромофору використані канцерогенні барвники. Неминуче виникає питання щодо універсальності захисного ефекту іммобілізації та правомірності його широкого застосування у різних галузях. З іншого боку, аналіз мутагенності нових іммобілізованих барвників надає інформацію про рівень генетичної небезпеки їх застосування як харчових добавок і є необхідною умовою при вирішенні питання щодо їх впровадження у практику. Виникає необхідність комплексної оцінки впливу іммобілізованих барвників на основні стадії мутагенезу/канцерогенезу: метаболізм, створення аддуктів ДНК-мутаген, репарація пошкоджень ДНК, експресія пошкоджень.
Важливим є також виявлення хімічних речовин, здатних модифікувати мутагенну дію саме іммобілізованих барвників. У зв’язку з тим, що мутагенний ефект антрахінонових барвників обумовлений вільно-радикальними процесами, особливий інтерес викликає вивчення впливу на мутагенний ефект іммобілізованих барвників антиоксидантів, що широко використовуються як харчові добавки.
Актуальність таких досліджень полягає в їх спрямованості на рішення таких задач, як охорона геному та первинна профілактика раку.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження здійснювали у руслі кардинального напряму робіт кафедри генетики і цитології ХНУ в межах теми “Вивчення мутагенної активності нових допоміжних фармацевтичних речовин”, номер державної реєстрації 01.9.10046278.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення можливості інгібування мутагенної дії канцерогенних азо- й антрахінонових барвників шляхом їх іммобілізації на полімерних матрицях, оцінка інформативності схеми, яка включає використання чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці) для тестування харчових добавок на мутагенність (на прикладі іммобілізованих барвників і гелєутворюючих речовин) та пошук модифікаторів мутагенної дії іммобілізованих барвників.
Для досягнення мети досліджень були поставлені наступні задачі:
1. Вивчити на індикаторних бактеріях в умовах з метаболічною активацією in vitro мутагенні і модифікуючі властивості нових іммобілізованих барвників та гелєутворюючих речовин.
2. Оцінити в системі in vitro на культурі лімфоцитів людини та в системі in vivo на клітинах кісткового мозку мишей закономірності цитогенетичного ефекту нових іммобілізованих харчових добавок.
3. Вивчити особливості мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук у статевих клітинах комах і ссавців залежно від дози, часу дії та стадії сперматогенезу.
4. Дослідити залежність мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук від наявності канцерогенних угруповань азо- й антрахінонової структури у ролі хромофору.
5. Оцінити рівень генетичної небезпеки для людини нових іммобілізованих барвників та гелєутворюючих речовин.
6. Проаналізувати інформативність окремих тест-об’єктів і всієї схеми тестування в цілому для оцінки мутагенності харчових добавок.
7. Дослідити сумісну дію азо- й антрахінонових барвників з модифікаторами хімічного мутагенезу.
Об’єктом дослідження є індукований мутагенез та його патогенетичні наслідки.
Предметом дослідження є модифікація мутагеної дії хімічних канцерогенів.
Методи дослідження: в основу методичного підходу в роботі покладена схема, яка включає поетапне використання в системах in vitro й in vivo чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці).
Наукова новизна отриманих результатів
– Вперше проведено дослідження інформативності поетапної схеми тестування, яка включає чотири тест-об’єкти (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці) для оцінки харчових добавок на мутагенність.
– Визначена залежність мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук від наявності канцерогенних угруповань азо- й антрахінонової структури.
– Одержані якісні та кількісні характеристики цитогенетичного ефекту іммобілізованих барвників у системах in vitro й in vivo.
– Визначені особливості мутагенного ефекту нових іммобілізованих харчових добавок у статевих клітинах комах і ссавців.
– Встановлено, що іммобілізація проціонових канцерогенних барвників азо- й антрахінонової структури на полімерних матрицях не спроможна обмежити їх метаболізм і, таким чином, інгібувати індукцію мутагенного ефекту.
– Виявлена мутагенна активність іммобілізованих барвників – червоного крохмалю 5 СХ, червоної целюлози 5 СХ, червоного желатину 5 СХ та синього желатину ЧХ. Одержані результати надають інформацію про нові сполуки-мутагени.
–Установлено рівень генетичної небезпеки нових іммобілізованих барвників для людини.
– Показана спроможність деяких антиоксидантів та речовин, які мають мембранотропні властивості, модифікувати мутагенний ефект іммобілізованих барвників.
Практичне значення отриманих результатів. Одержані в процесі виконання роботи результати мають теоретичне і практичне значення для генетики, онкології, гігієни, харчової токсикології та фармакології.
Дані про наявність мутагенної активності у нових іммобілізованих барвників – червоного крохмалю 5 СХ, червоної целюлози 5 СХ, червоного желатину 5 СХ і синього желатину КХ – у рамках доклінічних випробувань були використані у ДНЦЛЗ при вирішені питання про можливість (або неможливість) упровадження цих барвників у харчову промисловість.
Дані дослідження потенційної мутагенної активності натрій-карбоксиметилкрохмалю (у рамках доклінічних випробувань) представлені у Фармкомітет МОЗ України. Натрій-карбоксиметилкрохмаль дозволений до застосування як допоміжна фармацевтична речовина (протокол № 8 від 27.11.1994 р.).
Результати оцінки потенційної мутагенної активності натрій-карбоксиметилцелюлози використані у Державному науковому центрі лікарських засобів (ДНЦЛЗ) при впровадженні її у фармацевтичну промисловість.
У зв’язку з відсутністю на сьогодні розроблених методичних і методологічних підходів до оцінки харчових добавок на мутагенність у процесі виконання роботи запропонована та апробована інформативна схема тестування, яка включає поетапне використання чотирьох тест-об’єктів – мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці. Показана висока інформативність та адаптованість нової схеми тестування до об’єктів дослідження.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено планування і організацію наукової роботи, розроблена (та апробована) інформативна схема тестування харчових добавок на мутагенність.
Автором безпосередньо проведені експериментальні дослідження ефекту іммобілізації на різних тест-об’єктах (мікроорганізмах, культурі клітин, комахах, ссавцях), визначено рівень генетичної небезпеки іммобілізованих барвників для людини, проведена статистична обробка, інтерпретація і теоретичне обґрунтування одержаних результатів. Автором дисертаційної роботи особисто сформульовані основні положення і висновки роботи, проведено апробацію та впровадження одержаних результатів.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою дисертації були апробовані на: Всесоюзній конференції з генетики комах (Москва, 1991); VI з’їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Полтава, 1992); науково-практичній конференції „Лікарські засоби України” (Харків, 1992); Першому (третьому) Російському з’їзді медичних генетиків (Москва, 1994); I Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України “Актуальні питання морфології” (Івано-Франківськ, 1994); науковій конференції, присвяченій 180-річчю від дня народження заслуженого професора Харківського університету Л.С. Ценковського (Харків, 2002), VIII Міжнародній науковій екологічній конференції ”Актуальні проблеми збереження стійкості живих систем” (Бєлград, 2004), науковій конференції “Генетика в сучасному суспільстві” (Харків, 2004), наукових семінарах відділу генетики НДІ біології ХНУ імені В.Н. Каразіна (Харків, 2004, 2005).
Публікації. Основні положення дисертації викладені у 30 наукових працях, в тому числі у 21 статті у наукових журналах (з них фахових – 20), 8 збірниках тез доповідей на міжнародних та національних конференціях і з’їздах, а також в одному депонованому рукописі.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків, і списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації складає 200 сторінок, містить 28 таблиць і 34 рисунки. Список використаних джерел включає 331 найменування.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, визначені наукова новизна та практична цінність одержаних результатів.
Перший розділ містить аналітичний огляд даних літератури щодо сучасних уявлень про мутагенність/канцерогенність харчових добавок (в тому числі і барвників) та можливість модифікації мутагенного ефекту цих речовин.
Другий розділ дисертації присвячений характеристиці тест-об’єктів, методів дослідження та хімічних сполук, які досліджуються у роботі.
Основними тест-об’єктами досліджень були: мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці. Дослідження в тесті Еймса проводили на штамах Salmonella typhimurium ТА 98 і ТА 100. Для досліджень в культурі лімфоцитів людини використовували венозну кров практично здорових донорів чоловічої статі. У дослідах на Drosophila melanogaster використані лінії дикого типу Canton-S, D-32 та лінія Меллер-5. Цитогенетичні дослідження в системі in vivo провадили на мишах лінії C57BL/6. При оцінці ефектів у статевих клітинах обробці піддавали самців мишей F1 CBA × C57 BL/6.
Методи. В роботі застосована батарея тестів. У дослідах in vitro – тест Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців (B.N. Ames, 1975) та облік хромосомних
аберацій у культурі лімфоцитів периферійної крові людини (D.A. Hungerford, 1965). У дослідах in vivo – облік рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій (РЗСЛМ), облік домінантних летальних мутацій (ДЛМ) у дрозофіли (М.М. Тихомирова, 1990) та облік хромосомних аберацій (ХА) у клітинах кісткового мозку мишей (C.E. Ford et al., 1956) і облік домінантних летальних мутацій у зародкових клітинах мишей (А.М. Малашенко, 1978).
Хімічні речовини. У роботі досліджено: чотири іммобілізованих барвники – червоний крохмаль 5 СХ (ЧК), червона целюлоза 5 СХ (ЧЦ), червоний желатин 5 СХ (ЧЖ) та синій желатин ЧХ (СЖ), при створенні яких у ролі хромофору використано канцерогенні органічні барвники (азобарвник яскраво-червоний 5 СХ і антрахіноновий барвник яскраво-блакитний ЧХ), а в ролі матриць – натуральні полімери (крохмаль, целюлоза, желатин) та дві гелєутворюючі речовини (ГУР) – натрій-карбоксиметилкрохмаль (Na-КМК) і натрій-карбоксиметилцелюлоза (Na-КМЦ), які не містять канцерогенних угруповань.
Використані еталонні мутагени: 2-нітрофлуорен (20 мкг/чашку), 2-амінонітрофлуорен (40 мкг/чашку) та нітрозометилсечовина (НММ) (100 мкг/чашку) і (0,25%). В якості модифікаторів застосовані: аскорбінова кислота (0,1 %) та іонол (10-5 М).
Статистичний аналіз отриманих результатів проводили за допомогою критерію χ2 та критерію Стьюдента t (Е.В. Гублер і співавт., 1973; Г.Ф. Лакін, 1980). Здійснювали кореляційний аналіз залежності мутагенного єфекту ІБ від дози (використовували спеціальні програми Microsoft Word, Microsoft Excel).
У третьому розділі наведено результати вивчення мутагенних та модифікуючих властивостей нових іммобілізованих сполук у тесті Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців. Практично всі відомі схеми тестування включають тест Еймса (B.N. Ames, 1975; Л.М. Фонштейн, 1987, 1988, О.М. Дуган, 1998).
В роботі за допомогою тесту Еймса в умовах метаболічної активації in vitro фракцією S-9 печінки щурів з кофакторами встановлено, що Nа-КМК та Nа-КМЦ у концентраціях 0,1–1000,0 мкг/чашку не є мутагенами для Salmonella typhimurium штамів ТА 98 і ТА 100. Не виявлена модифікаційна (комутагенна) активність Nа-КМК та Nа-КМЦ у концентрації 100 мкг/чашку у відношенні мутагенного ефекту, що індукований стандартним мутагеном 2-нітрофлуореном (20 мкг/чашку) в клітинах штаму ТА 98 (рис. 1).
Згідно з одержаними у роботі результатами, азо- та антрахінонові ІБ (ЧК, ЧЦ, ЧЖ і СЖ) у концентраціях 0,1–1000,0 мкг/чашку також не виявляють мутагенної активності в умовах як без, так і з метаболічною активацією фракцією S-9 печінки щурів. Ці результати вказують на те, що утворення мутагенних похідних (на початковій стадії біотрансформації ІБ) не пов’язане з системою мікросомального окиснення і не моделюється при активації in vitro.
Однак в умовах хімічно індукованого мутагенезу ІБ (ЧК і ЧЦ) у концентрації 10 мкг/чашку виявляють модифікуючу (комутагенну) активність – достовірно підвищують частоту генних мутацій, індукованих стандартним мутагеном 2-нітрофлуореном у концентрації 20 мкг/чашку в клітинах штаму ТА 98 (рис. 2).
Таким чином, у результаті проведених експериментальних досліджень встановлено, що канцерогенні барвники азо- й антрахінонової структури,іммобілізовані на полімерних матрицях, не виявляють мутагенної активності в тесті Еймса як в умовах без метаболічної активації, так і з метаболічною
активацією фракцією S-9 печінки щурів, однак проявляють комутагенну активність щодо мутагенів прямої дії (стандартного мутагену 2-нітрофлуорену).
Четвертий розділ присвячений вивченню цитогенетичного ефекту іммобілізованих барвників у культурі лімфоцитів периферійної крові людини в системі in vitro. Відомо, що канцерогени здатні метаболізуватися в клітинах, які культивуються поза організмом (IARC, 1980; D. Govani et al., 1982).
На підставі проведених експериментальних досліджень встановлена спроможність канцерогених барвників, іммобілізованих на полімерних матрицях, дозозалежним чином індукувати цитогенетичний ефект в культурі лімфоцитів периферійної крові людини (табл. 1). Виявлена висока позитивна кореляційна залежність між частотою виникнення аберантних метафаз та концентрацією ІБ – “доза-ефект”. Коефіцієнт кореляційної залежності складає: rЧК = + 0,803; rЧЦ = + 0,812; rЧЖ = + 0,846; rСЖ = + 0,811. Збільшення частоти ХА відбувається, головним чином, за рахунок одиночних та парних фрагментів. З інших типів аберацій спостерігали аберації обмінного типу та дицентричні хромосоми.
Встановлені на різних тест-об’єктах у дослідах in vitro суперечливі результати (негативні в тесті Еймса та позитивні в культурі лімфоцитів людини), обумовлені тим, що спектри метаболітів канцерогенів, які активуються субклітинними фракціями, не ідентичні тим, що утворюються при метаболічній активації цих речовин у цільній клітині (JARC, 1980). Згідно з даними літератури, барвники спроможні активуватися не тільки мікросомальними оксидазами, але й іншими ферментами (ядерними ферментами) (Г.А. Белицький, 1981).
Таблиця 1
Частота і типи хромосомних аберацій в культурі лімфоцитів людини, індукованих канцерогенними барвниками, іммобілізованими на різних полімерних матрицях
Примітка. * P<0,01 (у порівнянні з контролем).
Таким чином, у ході проведених експериментальних досліджень встановлена здатність ІБ (незалежно від характеру полімерної матриці) дозозалежним чином індукувати цитогенетичний ефект у культурі лімфоцитів людини.
У п’ятому розділі наведена оцінка мутагенних властивостей нових іммобілізованих сполук в дослідах на Drosophila melanogaster. На дрозофілі можна вивчати весь спектр генетичних змін як у соматичних, так і в статевих клітинах (K.K. Patrnalk et al, 1992; Г.І. Мендельсон і співавт., 1990).
Згідно з одержаними у роботі результами, ІБ при обробці дорослих самців (концентрація 500 мг/мл) індукують достовірне підвищення частоти РЗСЛМ у зрілих сперматозоїдах дрозофіли лінії Canton-S порівняно з контролем (рис. 3).
Рис. 3. Частота РЗСЛМ у Drosophila melanogaster при впливі ІБ:
1 – контроль; 2 – іммобілізовані барвники (ЧК, ЧЦ, ЧЖ, СЖ); 3 – ПК (НММ).
За допомогою методу обліку ДЛМ виявлена залежність мутагенної дії нових іммобілізованих сполук від особливостей їх хімічної будови – наявності канцерогенних угруповань. Дані, представлені на рис. 4 і 5, свідчать про те, що при обробці дорослих самців лінії Canton-S Na-КМК і Na-КМЦ не є мутагенними для статевих клітин дрозофіли. Однак, створені на тих же полімерних матрицях за допомогою активних канцерогенних азо- та антрахінонових барвників ІБ (ЧК, ЧЦ, ЧЖ та СЖ) достовірно підвищують (у концентрації 500 мг/мл) частоту ДЛМ у зрілих сперматозоїдах дрозофіли
Відомо, що ДЛМ реалізуються на різних стадіях онтогенезу дрозофіли – як на ембріональній, так і на постембріональній. Згідно з одержаними результатами, при аналізі самців лінії Д-32, вирощених на середовищах, що містять різні концентрації ІБ (0,3; 0,4; 0,6%), виявлено дозозалежний мутагенний ефект. Встановлена висока позитивна кореляційна залежність між величиною концентрації ІБ і частотою ембріональної летальності (rЧК = +0,846, rЧЦ = +0,849, rЧЖ = +0,879, rСЖ = +0,855), постембріональної летальності (rЧК = +0,827,
Реалізація ДЛМ на ембріональній та постембріональній стадіях онтогенезу в результаті призводить до дозозалежного зниження плодючості дрозофіли за кількістю лялечок та імаго. Встановлена висока негативна кореляційна залежність між величиною сумарної летальності та показниками виходу імаго (rЧК = – 0,913, rЧЦ = – 0,867, rЧЖ = – 0,803, rСЖ = – 0,885).
Таким чином, на підставі проведених експериментальних досліджень встановлено, що канцерогенні барвники, іммобілізовані на різних полімерних матрицях, здатні індукувати РЗСЛМ та ДЛМ як при обробці дорослих самців, так і личинок дрозофіли. Виявлена висока позитивна кореляційна залежність мутагенного ефекту від концентрації ІБ. Показана негативна залежність плодючості дрозофіли за кількістю імаго від величини сумарної летальності.
Здатність ІБ індукувати мутагенний ефект у дрозофіли обумовлена тим, що ферменти дрозофіли, які метаболізують проканцерогени, мають значну подібність до ферментів ссавців. Згідно з даними літератури, цитохром Р-450 та багато інших монооксигеназних активностей виявлені у мікросомальній фракції клітин як личинок, так і дорослих мух (A. Zijlstra, 1987; В.А. Сидоренко, 2000).
Шостий розділ присвячений вивченню ефекту іммобілізації в системі in vivo на ссавцях. Найбільш передбачливі можливості мають тести з використанням соматичних та статевих клітин у дослідах in vivo (М.П. Бочков і співавт., 1975, І.Р. Бариляк і співавт., 2000).
У відповідності з одержаними в роботі результатами встановлена різна чутливість соматичних і статевих клітин до дії ІБ.
Як видно з табл. 2, при пероральному введенні в дозах 0,5 та 1,0 г/кг ІБ не
Таблиця 2
Частота хромосомних аберацій у клітинах кісткового мозку мишей С57ВL/6 за впливу різних доз іммобілізованих барвників
викликають достовірного підвищення частоти метафаз з абераціями в клітинах кісткового мозку мишей лінії С57ВL/6. Основним типом ХА як у контрольних, так і в дослідних групах тварин, є одиночні фрагменти. Одержані результати узгоджуються з даними літератури, які вказують на низьку чутливість клітин кісткового мозку до мутагенної дії азосполук (A.D. Tates et al., 1980; F. A. Angelosanto, 1995; А.Д. Дурнєв, 1998).
Слід відзначити, що ушкоджуюча дія деяких мутагенів/канцерогенів відрізняється високою видовою та тканинною специфічністю.
У зв’язку з цим, оцінку мутагенної дії ІБ проводили також за допомогою методу обліку ДЛМ у зародкових клітинах мишей F1 CВА × С57 ВL/6 при пероральному введенні в дозах 0,5 та 1,0 г/кг протягом 10 днів. Аналізували постмейотичні стадії сперматогенезу (табл. 3). При введенні дози 1,0 г/кг відзначено зниження кількості живих та підвищення кількості мертвих ембріонів на 1 вагітну самку.
Таблиця 3
Частота ДЛМ у зародкових клітинах мишей F1 CВА × С57 ВL/6, індукованих канцерогенними барвниками, іммобілізованими на різних полімерних матрицях
Згідно з одержаними у роботі експериментальними даними, в дозі 1,0 г/кг ІБ індукують достовірне підвищення частоти ДЛМ на постмейотичних стадіях сперматогенезу у порівнянні з контролем. Найбільші зміни виявлені на стадії зрілих сперміїв.
Таким чином, у результаті досліджень на ссавцях у системі in vivo встановлено, що статеві клітини більш чутливі до впливу барвників азо- й антрахінонової структури порівняно з соматичними.
Водночас результати експериментальних досліджень свідчать про те, що Na-КМК і Na-КМЦ (які не містять канцерогенних угруповань) в дозах, що в 10 та 100 разів перевищують рекомендовану добову дозу (для харчової промисловості), не індукують цитогенетичний ефект у клітинах кісткового мозку мишей лінії С57 ВL/6 при однократному пероральному введенні як у дозі 6 мг/кг (експозиція 24 год.), так і 60 мг/кг (експозиція 6, 24 і 48 год.). Ці речовини у дозі 60 мг/кг не викликають достовірного підвищення частоти ДЛМ на постмейотичних стадіях сперматогенезу при однократному введенні самцям мишей F1 CВА × С57 ВL/6.
Здатність ІБ індукувати мутагенний ефект у ссавців обумовлена тим, що, потрапляючи в організм, іммобілізовані барвники (як і неіммобілізовані) зазнають складних біохімічних перетворень під впливом ферментів мікрофлори кишечника (Д.Б. Парк, 1973; Г.М. Шатров і співавт., 1996). Продукти бактеріального розщеплення барвників (анілін та інші) спроможні всмоктуватися в кров та підлягати подальшому метаболізму (Г.Б. Плисс, 1991; Т. Г. С’яксте і співавт., 1991). Основним шляхом метаболізму похідних канцерогенних барвників є N-гідроксилювання мікросомальним цитохромом Р-450 (T. Kimura et al., 1985; Б.Л. Рубенчик, 1990; V. Cheung, 1994; Л.Ф. Глущенко, 2000).
Не виявлено достовірного зниження мутагенної активності ІБ при зміні полімерних матриць (крохмаль, целюлоза, желатин).
У сьомому розділі викладено аналіз інформативності окремих тест-об’єктів та всієї схеми тестування в цілому при оцінюванні харчових добавок на мутагенність та визначенні рівня їх генетичної небезпеки для людини. Запропонована й апробована в роботі поетапна схема тестування дозволила встановити, що досліджувані іммобілізовані сполуки виявляють різну генетичну активність, залежну як від їх специфічності, так і від специфічності тест-об’єкта, на якому проводяться дослідження.
За результатами тестування досліджувані речовини можна розділити на дві групи: 1) немутагенні сполуки; 2) сполуки, які проявляють достовірну мутагенну активність, але не в у всіх тестах.
До першої групи речовин слід віднести нові гелєутворюючі речовини, що не містять канцерогенних угруповань, – Na-КМК та Na-КМЦ. Ці речовини не викликають мутагенного ефекту як у системі in vitro, так і in vivo.
До другої групи речовин належать нові іммобілізовані барвники (ЧК, ЧЦ, ЧЖ та СЖ), які створені на тих же полімерних матрицях, що і ГУР (крохмаль, целюлоза, желатин), але які містять канцерогенні угруповання азо- й антрахінонової структури у ролі хромофору. Ці речовини виявили мутагенну активність на трьох тест-об’єктах (табл. 4). Одержані нами результати (згідно з сучасними уявленнями щодо механізмів канцерогенного ефекту) обумовлені наявністю в структурі ІБ конденсованих бензольних кілець. Очевидно, основною помилкою дослідників, які створювали ІБ, є використаня у ролі хромофору барвників з канцерогенною активністю. Надія на те, що хімічне зв’язування з високомолекулярною полімерною матрицею відверне біодеструкцію барвника, і продукти бактеріального розщеплення не потраплять в кров і не включаться до подальшого метаболізму, не виправдалася.
З іншого боку, велике значення для оцінки мутагенності проканцерогенів має вибір тест-об’єктів, чутливість яких визначається характером метаболічної активації, що обумовлена видовими, тканинними та функціональними особливостями (Б.Л. Рубенчик, 1990).
Таблиця 4
Аналіз інформативності окремих тест-об’єктів при оцінці нових іммобілізованих харчових добавок на мутагенність
Примітки:
1. + – наявність мутагенного ефекту;
2. * – P<0,01 (у порівнянні з контролем).
Порівняльний аналіз показав, що максимально виражений рівень мутагенного ефекту ІБ у різних тестах був різним і коливався від 0 до 2 балів. У тесті Еймса відзначена відсутність мутагенного ефекту (бал 0). При аналізі цитогенетичної активності ІБ установлено слабкий ефект у культурі лімфоцитів людини (бал 1). Найвищий рівень мутагенного ефекту (середній ефект) відзначено в тестах з обліку: ДЛМ у зародкових клітинах мишей та РЗСЛМ і ДЛМ у дрозофіли (бал 2). Дози, за яких відбувалися достовірні зміни більш ніж в 15 разів перевищують рекомендовані добові дози ІБ для харчової промисловості. За рівнем генетичної небезпеки для людини ІБ відносяться до категорії “слабкий мутаген”.
Суперечливі результати тестування на мутагенність з використанням різних тест-систем обумовлені їх різною спроможністю до активації проканцерогенів, яка, в свою чергу, обумовлена наявністю і неоднаковою інтенсивністю функціонування ряду ферментних систем.
Таким чином, запропонована та апробована в роботі схема оцінки харчових добавок на мутагенність, яка включає поетапне використання в системах in vitro та in vivo чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці), відрізняється високою інформативністю та адаптованістю щодо об’єктів тестування (табл. 8).
Рис. 8. Схема тестування харчових добавок на мутагенність
| 
