Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

       Інститут молекулярної біології та генетики

РЕБЕЦЬ Юрій Васильович

УДК 575.224+577.21

Генетичні механізми регуляції біосинтезу

ландоміцину Е у  штамУ

Streptomyces globisporus 1912

03.00.22 – молекулярна генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, доцент

Федоренко Віктор Олександрович,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри генетики та біотехнології.

Офіційні опоненти:   доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Мацелюх Богдан Павлович,

Інститут мікробіології та вірусології

імені Д.К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу генетики мікроорганізмів;

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Кучук Микола Вікторович,

Інститут клітинної біології та генетичної

інженерії НАН України,

заступник завідувача відділу генетичної інженерії.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Міністерство освіти і науки України, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 25 жовтня 2005 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 23 вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук                                                                О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема пошуку нових антибіотичних речовин є однією з найактуальніших у сучасній біотехнології. В першу чергу це зумовлено поширенням явища множинної лікарської резистентності серед мікроорганізмів та ракових клітин. Перспективними в цьому плані є полікетиди, зокрема ті, що належать до групи ангуциклінів (Мацелюх і співав., 1998; Поліщук і співав., 1996; Henkel et al., 1990). Представниками цих природних сполук є ландоміцини – основні продукти вторинного метаболізму штамів S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912 (Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996). Ці антибіотики активні проти ряду ракових клітин, в тому числі карциноми Герена та аденоми простати (Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996). Окрім того, ландоміцини пригнічують ріст антрациклін-резистентних пухлин, що є їхньою унікальною властивістю (Panchuk et al., 2004). Значною перешкодою у вивченні цих антибіотиків є низький рівень їхньої продукції, обмеженість даних щодо мішеней дії ландоміцинів у клітинах та їхня висока загальна цитотоксичність. Це стимулює використання підходів комбінаторного біосинтезу для створення нових похідних, одержання штамів з високим рівнем продукції цих антибіотиків. Однак такі експерименти неможливі без розуміння регуляторних процесів, що контролюють продукцію ландоміцинів у S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912.

Висока вартість протипухлинних антибіотиків, у тому числі ландоміцинів, зумовлена, насамперед, низьким рівнем їхнього біосинтезу та нестабільністю штамів-продуцентів, отриманих в результаті багаторазових етапів індукованого мутагенезу. Окрім того, методи класичної селекції в багатьох випадках є неефективними щодо промислових штамів-надпродуцентів. Розуміння процесів генетичного контролю продукції антибіотиків у стрептоміцетів дозволить розробити нові підходи до раціонального отримання штамів з високим рівнем біосинтезу антибіотиків за рахунок маніпуляцій з окремими генами чи елементами регуляторних систем.

Регуляція біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів є об’єктом інтенсивних досліджень багатьох вчених. Відомі різноманітні регуляторні елементи та механізми, задіяні у контролі вторинного метаболізму в цих бактерій. Однак, існує мало даних стосовно регуляції продукції сполук групи ангуциклінів. Незрозумілим залишається питання про взаємозв’язок окремих регуляторних процесів між собою. Вивчення регуляції біосинтезу ландоміцинів сприятиме глибшому розумінню загальних аспектів генетичного контролю продукції антибіотиків та ангуциклінів зокрема. Окрім того, досі погано розроблені раціональні підходи до створення штамів із високим рівнем продукції антибіотиків, що базуються на знаннях про регуляцію вторинного метаболізму у актиноміцетів. Дані, отримані під час таких досліджень, можуть бути використані і щодо інших стрептоміцетів – продуцентів антибіотиків.

Перелічені проблеми є особливо актуальними для України, де відсутнє промислове виробництво антибіотиків та протипухлинних препаратів, зокрема.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії генетики, селекції та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків (НДЛ-45) при кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка у межах держбюджетних науково-дослідних тем Бг-12б “Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів протиракових антибіотиків” (2000-2002 рр., номер держреєстрації – 0197U018080) та Бг-117б „Генетичний контроль біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи” (2003-2005 рр., номер держреєстрації - 0197U011132). Ці дослідження також були підтримані індивідуальним міжнародним грантом DAAD.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення генетичних механізмів регуляції біосинтезу ландоміцинів. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) виявити, клонувати та секвенувати гени шлях-специфічних регуляторів, задіяних у контролі продукції ландоміцинів;

2) отримати та вивчити мутанти S. globisporus та S. cyanogenus із пошкодженнями у виявлених генах;

3) вивчити особливості експресії генів шлях-специфічних регуляторів біосинтезу ландоміцинів;

4) дослідити механізми функціонування білків, що кодуються клонованими генами;

5) встановити роль регуляторної bldA-тРНК у контролі біосинтезу ландоміцинів;

6) дослідити ділянки, що фланкують кластери генів біосинтезу ландоміцинів з метою пошуку нових регуляторних елементів, задіяних у контролі продукції антибіотиків у S. globisporus та S. cyanogenus;

7) розробити підходи отримання штамів з надпродукцією ландоміцинів на основі отриманих даних щодо регуляції їхнього біосинтезу.

Об’єктом дослідження є генетичні механізми регуляції біосинтезу ландоміцинів у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136. Предметом дослідження є гени, що регулюють продукцію ландоміцинів Е та А.

Методи дослідження – мікробіологічні (культивування штамів актиноміцетів та аналіз їхніх ознак), біохімічні (очищення, кількісний та якісний аналіз антибіотиків), генетичні (отримання та вивчення мутацій, генетична трансформація клітин Escherichia coli, кон’югаційні схрещування між E.coli та актиноміцетами), генно-інженерні (виділення та рестрикційний аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, гель-електрофорез ДНК, ДНК-ДНК гібридизація, полімеразна ланцюгова реакція, cеквенування ДНК, ПЛР-мутагенез), молекулярно-біологічні (експресія та очищення рекомбінантних білків, вивчення зміни електрофоретичної рухливості ДНК-білкових комплексів).

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті виконаної роботи вперше ідентифіковано гени, задіяні в регуляції експресії структурних генів біосинтезу ландоміцинів Е та А (lnd- та lan- генів). Виявлено та клоновано ген lndI шлях-специфічний активатор транскрипції lnd-генів (Rebets et al., 2003). Kлоновано ген lanI, що контролює продукцію ландоміцину А у S. cyanogenus S136 (Rebets et al., 2003). За допомогою молекулярно-біологічного аналізу мутантів із спрямованим руйнуванням генів lndI та lanI вперше показано, що їхні продукти діють як позитивні регулятори біосинтезу ландоміцинів. Продемонстровано філогенетичну спорідненість генів, що регулюють продукцію ангуциклінових полікетидних антибіотиків та їхню функціональну взаємозамінність (Rebets et al., 2003). Вивчено особливості транскрипції гена lndI та оперону lndEFABCD, що об’єднує ключові гени біосинтезу ландоміцину Е (Ostash et al. 2003a; Ostash et al. 2003б; Rebets et al., 2005). Охарактеризовано продукт гена lndI, як ДНК-зв’язувальний білок, що взаємодіє із промоторами структурних lnd-генів та промотором власного гена (Rebets et al., 2005). Це перший відомий випадок авторегуляторної функції у білків-регуляторів біосинтезу полікетидних антибіотиків у стрептоміцетів. Отримано дані щодо регуляції експресії досліджуваного гена на рівні використання мінорної bldA-тРНК. Створено гібридні гени шлях-специфічних регуляторів біосинтезу антибіотиків за рахунок комбінування ділянок lndI та lanI, що кодують різні функціональні домени. Локалізовано та клоновано ген протеїнази prx, продукт якого задіяний у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцину Е.

Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості використання вивчених генів для створення рекомбінантних штамів бактерій з підвищеним рівнем продукції ландоміцинів. Вперше розроблено спосіб отримання надпродуцентів ландоміцину на основі рекомбінантних штамів, що несуть клоновані гени lndI та prx. Отримані результати стали основою патенту на винахід „Спосіб отримання штамів Sreptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів” (Патент UA62200A). Окрім того, одержані дані можуть бути використані для розробки підходів гетерологічної експресії генів біосинтезу ландоміцинів та комбінаторного біосинтезу нових антибіотиків у штамах S. globisporus та S. cyanogenus з метою одержання нових антибіотичних речовин.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором самостійно підготовано огляд літератури та виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Зокрема, здобувачем клоновано та вивчено гени lndI та lanI, задіяні у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцинів Е та А, показано, що продукт гена lndI є ДНК-зя’зувальним білком, вивчено характер експресії гена lndI в часі та різних частинах колонії, створено гібридні гени регулятори на основі lndI та lanI, вивчено роль гена prx у біосинтезі ландоміцину Е. Розробку програми вирішення поставлених завдань, аналіз та обговорення одержаних результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д.б.н., доцентом В. О. Федоренком, а також к.б.н. Б.О. Осташем та к.б.н. А.М. Лужецьким, з якими автор має спільні публікації.

Для виявлення lnd-кластеру було використано бібліотеку генів S. globisporus 1912, створену співробітницею НДЛ-45 к.б.н. Ю.М. Демидчук та дані часткового секвенування гена lndI, виконаного аспіранткою кафедри генетики та біотехнології     К.О. Панькевич. В роботі з аналізу причин надсинтезу ландоміцину Е стрептоміцин-стійкими мутантами використано штам S. globisporus Smy622, отриманий співробітником НДЛ-45 м.н.с. О.М. Громиком. Секвенування lnd-генів та аналіз продукції ландоміцинів виконувались у співпраці з науковцями відділу функціональної біології університету м. Ов’єдо, Іспанія (проф. Х.А. Салас), Інституту дослідження природних сполук, Йєна, Німеччина (др. Г. Крюгель), відділу фармакології університету м. Фрайбург, Німеччина  (проф. А. Бехтольд) та відділом мікробіології університету м. Ніігата, Японія (проф. Т. Накамура).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з’їздах: Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики (Львів, 2000); Конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, 2001); 36 Загальнопольському симпозіумі „Aktywnosc drobnoustrojуw w rуznych srodowiskach” (Краків, Польща 2001); 6 та 7 Конференції молодих вчених “Біологія – наука XXI століття” (Пущино, Росія 2002, 2003); Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002); VAAM Workshop “Biologie bacteriellen Naturstoffproducenten” (Фрайбург, Німеччина 2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Наука. Освіта” (Київ, 2003); Міжнародній Вейглівській конференції „Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance” (Львів, 2003), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, 2003), 16 Мікробіологічному симпозіумі “ Advance of microbial science and control of infectious diseases” (Кіото, Японія 2003), 76 Конференції Японського біохімічного товариства (Йокогама, Японія 2003), 10 З’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); Установчому  з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); на звітних наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (2001-2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 35 наукових праць, у тому числі 7 статей в фахових наукових журналах, 1 патент України та тези 27 доповідей на конгресах, конференціях та з’їздах.

Структура та обсяг дисертаціії. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, списку використаних джерел (167 найменувань), додатків. Роботу викладено на 215 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 51 рисунком і 9 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використали штами Escherichia coli DH5б, ET12567 (pUB307), BL21(DE3) та 51 штам актиноміцетів, а також 75 плазмід. Вони отримані дисертантом та співпрацівниками з кафедри генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка, де виконувалась робота, а також люб’язно надані колегами з інших установ.

Трансформацію E. coli проводили згідно стандартної методики (Sambrook et al., 2001). Кон’югаційні схрещування між E. coli та штамами стрептоміцетів проводили згідно методики, описаної в роботі (Лужицький і співавт., 2000). Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення сумарної та плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі та елюювання фрагментів ДНК, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикції, фрагментом Кленова, лігування ДНК Т-4 ДНК-лігазою, ДНК-ДНК-гібридизацію, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), визначення послідовності нуклеотидів у ДНК, термінальне мічення ДНК флуоресцеїном) проводили згідно стандартних методик (Sambrook et al, 2001) та рекомендацій виробника відповідних ферментів. Аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей виконували за допомогою комп’ютерних програм DNAsis, GENETYX-MAC8, DNA-Star, BLASTP, CODONPREFERENCE, CLUSTAL W, SIGNALP. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми STATGRAPHICS та електронних таблиць Microsoft Excel.

Аналіз продукції антибіотиків проводили методами тонкошарової рідинної хроматографії (ТШХ) та високоефективної рідинної хроматографії, згідно методик (Henkel et al., 1990; Мацелюх і співавт., 1999).

Для експресії білків використовували векторні системи pET23c, що передбачає введення 6 залишків гістидину, та pTYB, яка передбачає одержання гібридного білка злитого з хітин-зв’язувальним доменом. Очищення білків проводили методами афінної хроматографії на Ni2+ чи хітиновому носії. Аналіз концентрації білка здійснювали за (Lawry, 1951) чи методом BCA (bicinchoninic acid). ДСН-ПАГЕ проводили відповідно до Laemmli (Sambrook et al, 2001). Визначення змін електрофоретичної рухливості фрагментів ДНК після інкубації з LndI білком (Mobility Shift Assay – MSA) проводили згідно стандартних методик  з використанням фрагментів ДНК, мічених флуоресцеїном (Taylor et al., 1994).

Аналіз експресії репортерного гена зеленого флуоресцентного білка (EGFP) та отриманих на його основі генетичних конструкцій здійснювали за рівнем флуоресценції міцелію згідно (Sun et al., 1999). Вивчення експресії гібридів LndI-EGFP проводили імунологічно з використанням анти-GFP-антитіл.

Результати досліджень.

1. Вивчення функції генів lndI та lanI у регуляції синтезу ландоміцинів. Проведено секвенування та подальший аналіз нуклеотидної послідовності кластеру генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер) S. globisporus 1912 у 5’-напрямі від гена lndE. В результаті було ідентифіковано три відкриті рамки зчитування. Одна з них, ORF1, відповідає раніше описаному гену lndI. Розмір кодуючої послідовності гена становить 783 п.н., та кодує білок з 261 амінокислотного залишку. Ймовірний продукт lndI виявляє високий ступінь гомології до білків-регуляторів біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів, що належать до SARP-родини. Аналіз нуклеотидної послідовності, що передує старт-кодону гена lndI виявив ймовірну промоторну послідовність, близьку до консенсусної (Bourn et al., 1996). Вона складається з -10 ділянки 5’-TAGTTT (положення 235-240 п.н), що передує старт кодону гена lndI на 48 п.н, та -35 послідовності 5’-TTGACA (211-216 п.н.). Аналіз 5’- ділянки від ідентифікованого промотора показав існування трьох гептамерних повторів з консенсусною послідовністю 5’-T1C2G3C4(G/C)5 (G/A)6(C/A)7-3’, які характерні для сайтів зв’язування транскрипційних факторів (Wietzorrek et al., 1997). Кластер генів біосинтезу ландоміцину А S. cyanogenus S136 було отримано з космідної бібліотеки генів цього штаму та секвеновано групою професора А. Бехтольда (Westrich et al., 1999). Аналіз нуклеотидної послідовності lan-кластеру виявив деякі відмінності від lnd-кластеру S. globisporus, зокрема в складі lan-кластеру не було знайдено гена, що кодує транскрипційний регулятор структурних генів біосинтезу. Нами проведено додаткове секвенування ділянки 4839 п.н. lan-кластеру S. cyanogenus S136 у 3’-напрямку від гена lanZ6, що виявило три відкриті рамки зчитування. Аналіз нуклеотидної послідовності однієї з них показав, що вона кодує ймовірний транскрипційний регулятор, гомологічний продукту гена lndI S. globisporus 1912. Даний ген, позначений нами як lanI, зі старт-кодоном GTG, кодує білок з 261 амінокислотних залишків.

Порівняння ймовірних продуктів генів lndI та lanI показав високий ступінь їхньої гомології між собою та до транскрипційних факторів прокаріотів. На основі аналізу ймовірної амінокислотної послідовності білків з послідовністю осморегулятора E. coli OmpR, для якого відомі елементи вторинної структури, було виявлено послідовності LndI та LanI, які ймовірно задіяні у розпізнаванні та зв’язуванні з ДНК мішенню та активації РНК-полімерази. Дані порівняння показали також, що регуляторні білки, які походять із кластерів генів біосинтезу ангуциклінових полікетидних антибіотиків становлять окрему від інших SARP регуляторів філогенетичну групу (рис.1).

Ген lndI було зруйновано в хромосомі штаму S. globisporus 1912 шляхом заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до канаміцину. Факт заміщення було підтверджено ДНК-ДНК гібридизацію. Одержаний мутантний штам S. globisporus I2-1 характеризувався повною відсутністю синтезу ландоміцину Е та його попередників (рис.2,3). Продукція антибіотика відновлювалась при введенні гена lndI у складі плазмід. Ген lanI також зруйновано у хромосомі штаму S. cyanogenus S136 шляхом заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до спектиноміцину. Одержаний мутант характеризувався подібним до S. globisporus I2-1 фенотипом.

Проведено комплементацію мутацій у генах lndI та lanI з використанням генів-регуляторів біосинтезу антибіотиків у різних штамів стрептоміцетів. В результаті було виявлено, що всі використані регулятори можна розділити на дві групи – ті,  які    відновлюють   продукцію   ландоміцинів,  та   такі,   що  відновлюють   синтез антрациклінових полікетидів у відповідних регуляторних мутантів S. coelicolor та S. argillaceus. Одержані дані показали близьку спорідненість та взаємну замінність регуляторів біосинтезу ангуциклінових антибіотиків jadR1, lanI та lndI, що підтверджує дані, отримані під час аналізу амінокислотних послідовностей відповідних білків.

При введені у штам S. globisporus 1912 додаткових копій гена lndI спостерігається зростання рівня продукції ландоміцину Е. У випадку використання плазміди pSI2-9 на основі інтегративного вектора, що дає 2-3 копії клонованого гена на геном, рівень продукції зростав у 11 разів, тоді як при введенні висококопійної плазміди pSOI1112 (200-300 копій на геном) штам продукував у 12 разів більше ландоміцину Е порівняно із вихідним.

Показано відсутність впливу високих концентрацій глюкози  на продукцію ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912. Найвищий рівень синтезу спостерігали на середовищах з 5% цього вуглеводу, тоді як на середовищах із 10% та 15% рівень продукції дещо зменшувався. У випадку штаму S. globisporus 1912 pSI2-9+ найвищий рівень синтезу ландоміцину Е спостерігався на середовищах з 15% глюкози. При цьому в екстрактах основну частину становив ландоміцин Е, тоді як його попередники були відсутні. Також виявлено, що штам S. globisporus 1912 є типовим нейтрофілом, який краще переносить лужні умови культивування, ніж кислі. Відповідний характер має і залежність продукції ландоміцину Е від значення рН середовища.

2. Вивчення ДНК-зв’язувальних властивостей білка LndI. Отримані дані вказують на те, що продукт гена lndІ задіяний у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцину Е. Відомо, що такі білки функціонують як фактори транскрипції і реалізують свою функцію через взаємодію з ДНК промоторів регульованих ними генів. З метою вивчення ДНК-зв’язувальних властивостей білка LndI було проведено експерименти з його титрування in vivo на промоторах генів lndI та lndE клонованих у складі висококопійних плазмід pSOH (містить РlndI) та pSOE (містить РlndE) у штамі S. globisporus 1912. Отримані рекомбінантні штами продукували на 20-60% менше ландоміцину Е порівняно із штамом дикого типу. Таке зменшення продукції, очевидно, зумовлене титруванням регуляторного білка на клонованих у складі плазмід фрагментах ДНК за рахунок конкуренції за зв’язування з відповідними промоторами у складі хромосоми.

Ген lndI було клоновано у вектори експресії у E. coli та очищено відповідний рекомбінантний білок методами афінної хроматографії (рис.4). Одержаний білок LndI було використано в експериментах із вивчення зміни електрофоретичної рухливості ДНК-фрагментів (MSA - mobility shift assay) промоторів генів lndI, lndE.

В результаті цих експериментів було виявлено, що електрофоретична рухливість мічених флуоресцеїном фрагментів ДНК, що відповідали промоторам генів lndI та lndE, різко змінюється після інкубації з очищеним білком LndI, порівняно із вільними фрагментами ДНК (рис.5). Очевидно, що це зумовлено активним формуванням ДНК-білкових комплексів між LndI та відповідними промоторами. Така зміна електрофоретичної рухливості має конкурентний характер і залежить від кількості немічених фрагментів ДНК, що додавали до інкубаційної суміші. Таким чином, дані титрування та МSА показали, що lndI кодує ДНК-зв’язувальний білок, який активно взаємодіє із промоторами структурних генів біосинтезу ландоміцину Е, зокрема промотором гена lndE, що забезпечує транскрипцію ключових генів біосинтезу антибіотика, які входять до складу lndEFABCD оперону. Окрім того, LndI взаємодіє із промотором власного гена.

3. Вивчення особливостей експресії генів біосинтезу ландоміцину Е у S. globisporus 1912. Промоторні ділянки генів lndI та lndE було клоновано у репортерний вектор pIJ8660 в орієнтації, при якій їхня активність забезпечувала транскрипцію гена зеленого флуоресцентного білка EGFP. Отримані плазміди, pIJ8660H та pIJ8660E відповідно, було перенесено у штам S. globisporus 1912 та активність відповідних промоторів вивчали за інтенсивністю зеленої флуоресценції міцелію. Виявлено, що ініціація транскрипції lndEFABCD оперону відбувається лише після 24 години росту культури, а її максимум припадає на 60 годину,що збігається з часом максимального нагромадження ландоміцину Е. Ініціація транскрипції гена lndI відбувалась на 12 годину росту штаму S. globisporus 1912 pIJ8660Н+ (рис.7). Інтенсивність флуоресценції міцелію досягає максимуму на 60 годину росту культури в період найвищого рівня продукції антибіотика. Після цього спостерігається зменшення синтезу EGFP, що відображає зменшення активності промотора гена lndI та продукції ландоміцину Е зокрема. Причиною цього є частковий автоліз культури після 60-72 годин росту, що було підтверджено фарбуванням пропідій-йоддидом. Використання плазмід pIJ8660H та pIJ8660E показало, що обидва промотори PlndI та PlndE є активними лише у субстратному міцелії, тоді як у повітряному міцелії та спорах досліджувані гени не експресуються (рис.6). Таким чином, існує чітка регуляція активності гена lndI та структурних генів не лише в часі, а й у різних частинах колонії S. globisporus 1912.

Отримані результати дозволяють виявити лише особливості роботи досліджуваних промоторів, але не показують характер експресії генів загалом. Тому було створено  злиття кодуючих ділянок генів lndI та EGFP. Така конструкція pIJlndI була перенесена у штам S. globisporus I2-1. При цьому спостерігалось часткове відновлення біосинтезу ландоміцину Е мутантним штамом, що свідчить про функціональну активність гібридного білка LndI-EGFP. Плазміду pIJlndI було перенесено у штам дикого типу  S. globisporus 1912 та  вивчено   експресію   даного гена. Гібрид було виявлено в сумарному лізаті клітин S. globisporus 1912 pIJlndI+ імунологічно, як білок, розміром 56 кДа. Використання  цієї  системи  показало, що

протягом перших 12-24 годин росту в клітинах відсутній продукт гена lndI-GEFP (рис.7). Слабка флуоресценція з’являлась на 24 годину росту культури і досягала максимуму інтенсивності між 48 та 60 годинами. Такий характер експресії гена lndI в загальному збігається з даними, отриманими при вивченні активності його промотора. Однак було виявлено існування певного лаг-періоду між ініціацією транскрипції гена lndI та трансляції його мРНК. Причиною цього може бути присутність в кодуючій ділянці гена lndI регуляторного лейцинового ТТА-кодону. Було створено мутантний алель гена, у якого цей кодон замінено на синонімічний СТС. Одержаний ген lndICTC було злито з кодуючою ділянкою гена EGFP та досліджено його експресію у S. globisporus 1912. Виявлено відсутність лаг-періоду між початком транскрипції гена lndICTC та трансляції його мРНК. Таким чином, очевидно, що експресія lndI регулюється на рівні трансляції за рахунок використання рідкісного ТТА кодону, що транслюється bldA- тРНК.

4. Створення гібридних генів регуляторів на основі lndI та lanI. Подібність нуклеотидних та амінокислотних послідовностей генів lndI та lanI та їхніх продуктів вказують на їхню близьку структурну та функціональну спорідненість. Окрім того, відомо, що S. cyanogenus характеризується підвищеним рівнем продукції ландоміцину А порівняно із S. globisporus 1912. Причини такого надсинтезу невідомі, проте однією з них можуть бути відмінності в амінокислотних послідовностях білків LanI та LndI. Найбільше відмінностей зосереджено у їхній N-кінцевій ділянці, тоді як С-кінцева ділянка є більш консервативною та відповідає за зв’язування з ДНК-мішені і активацію РНК-полімерази. Найбільше відмінностей між білками знайдено в ділянці б-петлі, яка розміщена між б2 та б3 спіралями. Саме ця структура, розміром 9 амінокислотних залишків, найбільш вірогідно, взаємодіє з РНК-полімеразою та активує її. Відповідні ділянки LndI та LanI відрізняються 5 амінокислотними залишками, що, ймовірно, відображається на ступені активації РНК-полімерази та, відповідно, на рівні продукції антибіотиків.

У центральній частині lndI та lanI було знайдено сайт розпізнавання рестриктазою PstI, що розщепляє кодуючі ділянки генів у ідентичних місцях, таким чином, що при об’єднанні 5’-частини lndI та 3’- послідовності lanI в даному сайті відбувається відновлення рамки зчитування. Використовуючи цю особливість було створено два нові регуляторні гени ladR1, продукт якого складається із сигнального домену LndI та регуляторного домену LanI, та ladR2, який кодує білок із сигнальним доменом LanI та регуляторним доменом LndI. Ще один варіант гібридного lndI/lanI було отримано методом ПЛР. ladI кодує білок LndI з його N-кінцевим сигнальним доменом та ділянкою регуляторного домену до б2 спіралі включно, у якого б-петля та наступні б3, в6 і в7 структури замінені на відповідні ділянки білка LanI. Одержані гени ladR1, ladR2 та ladI було клоновано у вектор експресії pKC1212E, таким чином, що в отриманих рекомбінантних плазмідах pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI, відповідно, їхня експресія забезпечується промотором гена стійкості до еритроміцину. pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI було перенесено у lndI– мутант S. globisporus I2-1. Однак у жодному з випадків відновлення біосинтезу антибіотика не спостерігалось. Таким чином, незважаючи на взаємну функціональну замінність білків LndI та LanI, гібриди, отримані в результаті комбінування їхніх доменів чи окремих фрагментів, які кодують ділянки активних центрів, призводять до утворення нефункціональних регуляторів, що не здатні відновлювати біосинтез ландоміцину Е у штамі S. globisporus I2-1.

5. Вивчення функції гена prx у регуляції продукції ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912. Під час секвенування 5’-фланкуючої послідовності lnd-кластера і аналізу отриманої нуклеотидної послідовності у 5’-напрямі від гена lndI на відстані 700 п.н. було виявлено ORF, названу згодом prx, розміром 1605 п.н. Ймовірним продуктом цього гена є білок з молекулярною масою 49,76 кДа, який складається із 534 амінокислотних залишків. Порівняння ймовірного продукту гена prx з білками із бази даних показали його високий ступінь гомології до білків імовірних протеїназ та ендопептидаз стрептоміцетів. У 5’ напрямі від prx було ідентифіковано ще одну ORF, яка кодує тимідилат-фосфотрансферазу, що, очевидно, задіяна у первинному метаболізмі S. globisporus 1912. Для дослідження функції гена prx було сконструйовано плазміду для його спрямованого руйнування pKC1139Ma. Дана конструкція на основі вектора pKC1139 з термочутливим репліконом містила мутантний алель гена prx з інерцією генної касети стійкості до спектиноміцину aadA. В результаті отримано штам S. globisporus Pro6, в якого ген prx було заміщено на його мутантний алель. Аналіз продукції ландоміцину Е показав, що мутантний штам синтезує у 5 разів менше ландоміцину Е, порівняно із штамом S. globisporus 1912. Біосинтез антибіотика відновлювався до рівня вихідного штаму при введенні у S. globisporus Pro6 інтактного гена prx у складі плазміди pKCX2. При збільшенні числа копій гена prx у штамі дикого типу за рахунок введення плазміди pKCX2 спостерігали значне зростання рівня продукції антибіотика порівняно із вихідним. Одержані дані дозволяють стверджувати, що продукт гена prx задіяний у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцину Е у S. globisporus 1912.

Таким чином, в результаті проведених досліджень було виявлено, клоновано та вивчено гени, що контролюють продукцію ландоміцинів Е та А у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136 на рівні шлях-специфічної регуляції структурних генів та пост-трансляційної модифікації ферментів, задіяних у біосинтезі цих антибіотиків. Одержані дані було використано для створення підходів до отримання штамів із підвищеною продукцією ландоміцинів за рахунок генно-інженерних маніпуляцій із ідентифікованими регуляторними генами. Однак багато питань щодо контролю біосинтезу ангуциклінових полікетидів залишаться незрозумілими. Невідомими є елементи глобального контролю вторинного метаболізму та морфологічної диференціації, їхня подібність до таких, що були виявлені та вивчені у продуцентів інших груп полікетидних антибіотиків. Однак, перш за все потребує відповіді питання про зв’язок між системами глобального контролю продукції антибіотиків та шлях-специфічних регуляторів, досі не виявлено білки та гени, що об’єднують ці два рівні, невідомими залишаються генетичні та молекулярні механізми їхньої взаємодії. Розв’язання цих питань дозволить більш глибше зрозуміти логіку експресії генів вторинного метаболізму стрептоміцетів, розробити нові, досконаліші методи одержання штамів-надпродуцентів біологічно-активних речовин, та в кінцевому результаті стане базою для подальшого створення нових антибіотичних речовин за рахунок генно-інженерних маніпуляцій.

Висновки

В результаті виконаної роботи показано, що біосинтез ландоміцинів у штамів S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136 регулюються на рівні експресії структурних генів шлях-специфічними транскрипційними факторами, що кодуються генами lndI та lanI. Важлива роль у контролі продукції цих антибіотиків належить bldA-тРНК та протеїназі, що кодується геном prx.

1. Виявлено, клоновано та секвеновано гени шлях-специфічних регуляторів біосинтезу ландоміцинів lndI та lanI, продукти яких гомологічні факторам транскрипції інших прокаріотичних організмів. Гени, що контролюють продукцію ангуциклінових полікетидних антибіотиків, становлять окрему групу в межах SARP-родини.

2. Спрямоване руйнування генів lndI та lanI призводить до повного припинення біосинтезу ландоміцинів у мутантних штамів S. globisporus та S. cyanogenus, відповідно. Продукція антибіотиків відновлюється після введення in trans генів lndI, lanI та jadR1, що свідчить про їхню близьку філогенетичну та функціональну спорідненість.

3. Показано, що lndI кодує ДНК-зв’язувальний білок, який взаємодіє із промоторами структурних генів біосинтезу ландоміцину Е та промотором власного гена.

4. Вивчено особливості часової та просторової регуляції експресії гена lndI. Показано, що ініціація транскрипції його промотора припадає на 12 годину росту, а максимум активності збігається із часом ефективного синтезу антибіотика. Виявлено існування лаг-періоду між початком транскрипції гена lndI та трансляції його мРНК. Він зумовлений присутністю у кодуючий послідовності гена мінорного ТТА-кодону, що транслюється регуляторною лейцил-bldA-тРНК.

5. Секвеновано ділянки ДНК, що фланкують lnd- та lan- кластери. У S. globisporus виявлено ген трансмембранної ендопептидази prx, руйнування якого призводить до зменшення рівня продукції ландоміцину Е, тоді як надекспресія стимулює надсинтез антибіотика. Ймовірно функцією продукту гена prx є пост-трансляційний процесинг білків зв’язаний з їхньою секрецією.

6. Розроблено спосіб отримання надпродуцентів ландоміцинів на основі рекомбінантних штамів, що несуть клоновані гени lndI та prx.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ за темою дисертації

1. Ostash B.O., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Rebets Yu.V., Fedorenko V.O.  Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin E biosynthesis // Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна.- 2001.-Вип.27.- С.106-112. Здобувач здійснив гібридизаційний скринінг колекції мутантів щодо делецій у lnd-кластері.
2. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Mik U., Basiliya L., Fedorenko V. Resistance of recombinant Streptomyces albus CEST114 and Streptomyces globisporus strains to landomycin E // Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна.-2003.-Вип.33.-С.47-54. Здобувач створив ряд рекомбінантніх плазмід, що несуть lnd-гени та провів їхню експресію у штамі, чутливому до ландоміцину Е.
3. Ostash B., Rebets Yu., Samborskiy M., Salas J.A., Fedorenko V. Sequencing and analysis of putative 3rd -4th ring cyclase gene lndF from Streptomyces globisporus 1912 landomycin E biosynthetic gene cluster //  Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна. -2003.-Вип.32.-С.89-94. Здобувач здійснив комп’ютерний аналіз та порівняння амінокислотної послідовності продукту гена lndF.
4. Ostash B., Rebets Yu., Yuskevich V., Luzhetskyy A., Tkachenko V., Fedorenko V. Targeted disruption of Streptomyces globisporus 1912 lndF and lndL cyclase genes involved in antitumor landomycin E biosynthesis // Folia Microbiologica.-2003.-Vol.48,N4.-P.484-488. Здобувач створив плазміди та здійснив спрямоване руйнування гена lndF.
5. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Braтa A., Mendez C., Salas J.A., Bechthold A., Fedorenko V. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-Vol.222.-P.149-153. Здобувач провів секвенування та аналіз послідовності генів lndI та lanІ, здійснив спрямоване руйнування гена lndI та аналіз одержаного мутанта.
6. Gromyko O., Rebets Yu., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuhara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it’s initial characterization// J. of Antibiotics.- 2004. -Vol.57,N6.- P.383-389. Здобувач здійснив клонування гена rpsL та аналіз його нуклеотидної послідовності, вивчення експресії гена lndI у штамі дикого типу та надпродуценті ландоміцину Е.
7. Rebets Yu., Ostash B., Luzhetskyy A., Kushnir S., Fukuhara M., Bechthold A., Nashimoto M., Nakamura T., Fedorenko V. DNA binding activity of LndI protein and temporal expression of the gene that upregulates landomycin E production in Streptomyces globisporus 1912// Microbiology.-2005.-Vol.151.-P.281-290. Здобувач здійснив експресію та очищення білка LndI, вивчення його ДНК-зв’язувальних властивостей та аналіз профілю експресії гена lndI у часі та різних частинах колонії S. globisporus.
8. Пат. UA62200A, МПК7C12N15/00/. Спосіб отримання штамів Sreptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Федоренко В.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М. – Заявл. 24.01.2003; Опубл.15.12.2003.-Бюл.№12.-10 с. Здобувач створив ряд плазмід для експресії гена lndI та вивчив властивості штамів S. globisporus, що несуть ці рекомбінантні плазміди.
9. Rebets Yu., Ostash B. Using of different vector systems for heterologous expression of genes for angucycline antibiotic landomycin E biosynthesis // Proc. Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology.- Kyiv (Ukraine).-2001. - P.119. Здобувач створив ряд плазмід для експресії генів біосинтезу ландоміцину Е.
10. Fedorenko V.O., Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Pankevich K.O., Gromyko O.M., Rebets Yu.V., Kruegel H. Genetic control of antitumor antibiotic landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 // Materialy ogolnopolskiego sympozjum microbiologicznego. Aktywnosc drobnoustrojow w roznych srodowiskach.- Krakow (Poland). - 2001. - P.17-18. Здобувач здійснив аналіз мутантів S. globisporus із пошкодженим біосинтезом ландоміцину Е.
11. Rebets Yu. Ostash B. Heterologous expression of landomicyn E biosynthesis genes in model strains of streptomycetes // Труды 6-ой Пущинской школы-конференции молодых учених. Биология – наука ХХI века. - Пущино (Россия).-2002-. С.308. Здобувач провів гетерологічну експресію генів біосинтезу ландоміцину Е у модельних штамах стрептоміцетів.
12. Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Юськевич В.Ю., Федоренко В.О. Гени Streptomyces globisporus 1912, які контролюють процеси циклізації полікетидного ланцюга ландоміцину Е // Укр. біохім. журнал. Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. - Чернівці (Україна).-2002.- Т.74,№4б.- С. 52. Здобувач дослідив функцію гена lndF у біосинтезі ландоміцину шляхом спрямованого руйнування.
13. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Bechthold A., Fedorenko V. Pathway-specific regulatory genes for landomycins E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136, a new member of SARP family // Proc. VAAM Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduczenten”.- Freiburg (Germany). – 2002. - P.28. Здобувач здійснив спрямовану інактивацію гена lndI та аналіз отриманого мутанта щодо біосинтезу ландоміцину Е.
14. Аравицкая А.В., Громыко А.Н., Ребец Ю.В., Осташ Б.Е., Лужецкий А.Н., Басилия Л.И., Бехтольд А., Федоренко В.А. Альтернативные системы интеграции рекомбинантных плазмид для генно-инженерного конструирования штаммов актиномицетов // Труды 7-ой Пущинской школы-конференции молодых учених. Биология – наука ХХI века. - Пущино (Россия).-2002.-С.86. Здобувач здійснив аналіз характеру інтеграції плазміди pWVB у геном ряду штамів стрептоміцетів.
15. Luzhetskyy A., Ostash B., Rebets Y., Gromyko O., Salas J.A., Bechtold A. Development of gene cloning system for streptomycetes – producers of landomycines // Materiaіy konferencyjne. II Krajowy Kongres Biotechnol. - Јуdџ (Poland).- 2003. - P.236. Здобувач проаналізував вплив інтеграції кількох векторних систем у геном S. globisporus на рівень продукції ландоміцину Е.
16. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Cloning and studying of landomycins biosynthesis regulatory genes lndI and lanI of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136 // Biochemistry (Japan). Proc. of 76th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society. -Yokohama (Japan). -2003.-Vol.75,N.8.-P.889. Здобувач дослідив роль генів lndI та lanI у регуляції біосинтезу ландоміцинів шляхом їх руйнування та експресії,очистив білок LndI та вивчив його ДНК-зв’язувальні властивості.
17. Rebets Y., Ostash B., Kobylyanskyy A., Mik U., Fukuhara M., Nakamura T., Fedorenko V.  Genetic control of resistance to antitumor antibiotic landomycin E in producing strain Streptomyces globisporus 1912 // Proc. of 16th Symposium on Microbial Science: Advance of Microbial Science and Control of Infectious Diseases. - Kyoto (Japan) -2003.- P.65-66. Здобувач створив ряд плазмід для експресії генів стійкості до ландоміцину Е, вивчив роль lndI у контролі аутостійкості штаму.
18. Ребець Ю., Осташ Б., Лужецький А., Хофмейстер Д., Брана А., Мендез К., Салас Х.А., Бехтольд А.,  Федоренко В. Гени, що контролюють біосинтез ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 //  Тези І-ої Всеукр. науково-практичної конф. студентів, аспірантів та молодих учених. Біотехнологія. Освіта. Наука.- Київ (Україна).-2003. - С.135. Здобувач дослідив роль генів lndI та lanI у регуляції біосинтезу ландоміцинів шляхом їх руйнування та експресії, вивчив ДНК-зв’язувальні властивості LndI, дослідив характер експресії гена lndI.
19. Ребець Ю., Мік У., Дутко Л.О., Осташ Б., Басілія Л., Федоренко В. Клонування та вивчення генів lndJ та lndW Streptomyces globisporus 1912, що кодують білки транспортери //   Тези І-ої Всеукр. науково-практичної конф. студентів, аспірантів та молодих учених. Біотехнологія. Освіта. Наука.- Київ (Україна).-2003. - С. 133-134. Здобувач клонував гени ймовірних детермінант стійкості до ландоміцину Е, сторив ряд плазмід для їхньої експресії.
20. Ostash B.O., Rebets Yu.V., Kobylyanskyj A., Fedorenko V.O. In search of antitumor landomycin E resistance determinants: disruption of Streptomyces globisporus 1912 lndW gene encoding ATP-binding protein // Proc. International Weigl conference. Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance.- L’viv (Ukraine).-2003.- P.125. Здобувач провів аналіз нуклеотидної та амінокислотних послідовностей гена lndW та його продукту.
21. Rebets Yu., Ostash B., Kobylyanskyj A., Mik U., Fedorenko V.O. Studying of Streptomyces globisporus 1912 lndW gene encoding putative ATP-binding protein // Proc. Conf. for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine.- Kiev (Ukraine).-2003.-P.279. Здобувач сторив плазміди та провів спрямоване руйнування гена lndW, дослідив властивості одержаного мутанта.
22. Samborskyy M., Ostash B., Rebets Yu., Fedorenko V. The regulatory elements controlling the expression of genes for landomycin E and  landomycin A biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136 // Proc. Conf. for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine.- Kiev (Ukraine).-2003.-P.123. Здобувач здійснив аналіз нуклеотидних послідовностей lnd- та lan-кластерів щодо ймовірних регуляторних послідовностей у їхньому складі.
23. Rebets Yu., Ostash B., Dutko L., Fedorenko V. Pathway-specific regulation of landomycins production // Proc. Conf. for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine.- Kiev (Ukraine).-2003.-P.56. Здобувач здійснив аналіз нуклеотидних послідовностей lndI та lanI, провів їх руйнування та вивчення  мутантів.
24. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Lizhetskyy A., Kushnir S., Fukuhara M., Bechtold A., Nakamura T., Fedorenko V. Temporal expression and DNA binding capacity of Streptomyces globisporus 1912 LndI protein involved in regulation of landomycin E production // Здобувач очистив білок LndI та вивчив його ДНК-зв’язувальні властивості, дослідив характер експресії гена lndI.
25. Kozarevsa I., Ostash B., Rebets Yu., Fedorenko V. Interrelationship of landomycin biosynthesis and it’s transport in Streptomyces globisporus // Матеріали установчого з’їзду Укр. т-ва клітинної біол. - Львів (Україна).-2004.-С.105. Здобувач провів аналіз нуклеотидної та амінокислотних послідовностей гена lndW та його продукту, здійснив спрямоване руйнування гена та аналіз відповідного мутатна.
26. Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Козаревська І.С., Громико О.М., Кобилянський А.М., Дутко Л.О., Мік У.Я., Федоренко В.О. Регуляція біосинтезу ландоміцинів та гени стійкості до них у Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей Х з’їзду Т-ва мікробіологів України. - Одеса (Україна).-2004.- С.320. Здобувач очистив білок LndI та вивчив його ДНК-зв’язувальні властивості, дослідив характер експресії гена lndI у часі та різних частинах колонії, провів гетерологічну експресію ймовірних генів стійкості до ландоміцину.
27. Дутко Л.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Федоренко В.О. Ген prx1, що імовірно задіяний у регуляцію біосинтезу ландоміцину Е в Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей Х з’їзду  Т-ва мікробіологів України. - Одеса (Україна).-2004.- С.330. Здобувач проаналізував нуклеотидну послідовность гена prx та провів його спрямоване руйнування .
28. Ребець Ю.В., Фукухара М., Накамура Т., Федоренко В.О. Роль гена лейцил-тРНК у регуляції продукції ландоміцинів штамом Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей Х з’їзду  Т-ва мікробіологів України. - Одеса (Україна).-2004.- С.322. Здобувач створив конструкції із злитими кодуючими ділянками генів lndI та EGFP, дослідив роль регуляторного кодону ТТА у експресії гена lndI.
29. Громико О.М., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Федоренко В.О. Підходи до конструювання штамів з підвищеним синтезом протипухлинних антибіотиків // Тези доповідей Х з’їзду  Т-ва мікробіологів України. - Одеса (Україна).-2004.- С.329. Здобувач здійснив клонування гена rpsL та аналіз його нуклеотидної послідовності, вивчення експресії lndI у штамі дикого типу та надпродуценті.
30. Федоренко В.О., Осташ Б.О., Ребець Ю.В., Лужецький А.М., Кириченко Н.В., Козаревська І.С., Самбір М.В. Генетичні та генно-інженерні підходи до конструювання актиноміцетів – продуцентів антибіотиків // Тези Наук.конф. “Генетика в современном обществе”. - Харків (Україна). -2004.-С.46. Здобувач дослідив експресію гена lndI у штамі дикого типу та надпродуценті ландоміцину, вивчив властивості рекомбінантних штамів, що несуть додаткові копії гена lndI.
31. Dutko L.O., Rebets U.V., Ostash B.O., Fedoreno V.O. Gene prx that is involved in the regulation of landomycin E biosynthesis in the strain Streptomyces globisporus 1912 // Тезисы II Междунар. Науч. Конф. студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 140-летию Одесского национального университета им. И.И. Мечникова. Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация. - Одесса (Украина). - 2005.- С.120. Здобувач проаналізував нуклеотидну послідовность гена prx, створив плазміди для його експресії.
32. Єфременкова О.В., Ребець Ю.В., Федоренко В.О. Клонування та вивчення гена lndY у штамі Streptomyces globisporus 1912 // Тезисы II Междунар. Науч. Конф. студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 140-летию Одесского национального университета им. И.И. Мечникова. Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация. - Одесса (Украина). - 2005.- С.121. Здобувач клонував ген lndY та проаналізував його нуклеотидну послідовность.
33. Rebets yu.V., Fukuhara M., Nakamura T., Fedorenko V.O. gene shuffling for landomycins E and A regulatory proteins LndI and LanI // Тезисы II Междунар. Науч. Конф. студентов, аспирантов и молодых учёных, посвящённой 140-летию Одесского национального университета им. И.И. Мечникова. Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация. - Одесса (Украина). - 2005.- С.165. Здобувач створив ряд гібридів на основі генів lndI та lanI і провів їх експресію у регуляторних мутантах стрептоміцетів.
34. Єфременкова О.В., Ребець Ю.В., Федоренко В.О. Вплив умов інкубації на продукцію вторинних метаболітів штамом Steptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей Першої Міжнар. Конф. Студентів та аспірантів. Молодь і поступ біології. - Львів (Україна). - 2005.-С.120. Здобувач дослідив вплив умов середовища інкубації на ріст та продукцію ландоміцину Е штамом S.globisporus та його похідних із клонованим геном lndI.
35. Дутко Л.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Бехтольд А., Федоренко В.О. Регуляція біосинтезу ландоміцину А у штамі Streptomyces cyanogenus S136 за участю шлях-специфічного регуляторного гена lanI // Тези доповідей Першої Міжнар. Конф. Студентів та аспірантів. Молодь і поступ біології. - Львів (Україна). - 2005.-С.109-110. Здобувач створив рекомбінантні плазміди та провів спрямоване руйнування гена lanI, дослідив властивості мутанта щодо продукції ландоміцину А.

АнотаціЯ

Ребець Ю.В. Генетичні механізми регуляції біосинтезу ландоміцину Е у штаму Streptomyces globisporus 1912. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

Вивчено деякі аспекти регуляції продукції ландоміцинів Е та А у штамів S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136. Клоновано гени lndI та lanI, задіяні у контролі біосинтезу антибіотиків на рівні активації експресії структурних генів. Руйнування цих генів призводить до повного припинення продукції ландоміцинів. Показано, що регулятори біосинтезу ангуциклінів формують окрему філогенетичну групу SARP-родини. Дослідження білка LndI виявили, що він активно взаємодіє з промотором гена lndE та промотором власного гена, активуючи їхню експресію. З використанням репортерного гена зеленого флуоресцентного білка досліджено експресію генів lndI та lndE у часі та різних частинах колонії. Показано, що лаг-період між ініціацією транскрипції lndI та трансляції його мРНК зумовлений присутністю в кодуючому районі регуляторного лейцинового ТТА-кодону, що транслюється bldA-тРНК. У складі lnd-кластеру клоновано ген prx, що кодує протеїназу. Виявлено, що його продукт задіяний у регуляції продукції ландоміцину Е, ймовірно, на рівні пост-трансляційної модифікації ферментів біосинтезу.

Ключові слова: Streptomyces, полікетидні антибіотики, ландоміцин, регуляція біосинтезу, транскрипційні фактори, транскрипція, трансляція, експресія, зелений флуоресцентний білок.

АННОТАЦИЯ

Ребець Ю.В. Генетические механизмы регуляции биосинтеза ландомицина Е в штамме Streptomyces globisporus 1912. – Рукопись.

Дисертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

Изучены некоторые аспекты регуляции продукции поликетидных антибиотиков ландомицинов Е и А у S. globisporus 1912 и S. cyanogenus S136. Клонировано гены lndI та lanI, задействованные в контроле биосинтеза антибиотиков на уровне активации структурных генов.  Нокаут єтих генов ведёт к полному отсутствию продукции ландомицинов. Показано, что регуляторы биосинтеза ангуциклинов формируют отдельную филогенетическую группу SARP-семьи. Установлено, что LndI активно взаимодействует с промотором гена lndE и промотором собственного гена, активируя их экспрессию. С использованием репортерного гена зелёного флуоресцентного протеина исследовано экспрессию генов lndI и lndE во времени и разных частях колонии. Показано, что лаг-период между инициацией транскрипции lndI и трансляции его мРНК обусловлен присутствием в кодирующем районе гена регуляторного лейцинового ТТА-кодона, что считывается bldA-тРНК. Клонирован ген prx, кодирующий протеиназу/эндопептидазу в составе lnd-кластера. Показано, что продукт гена prx задействован в позитивной регуляции биосинтеза ландомицина Е, возможно на уровне пост-трансляционной модификации ферментов биосинтеза.

Ключевые слова: Streptomyces, поликетидные антибиотики, ландомицин, регуляция биосинтеза, факторы транскрипции, транскрипция, трансляция, экспрессия, зелёный флуоресцентный протеин.

SUMMARY

Rebets Yu.V. Genetic mechanisms of landomycin E biosynthesis regulation in Streptomyces globisporus 1912. – Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, speciality 03.00.22 – molecular genetics. – Institute of molecular biology and genetic National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2005.

Some features of polyketide antibiotics landomycins E and A biosynthesis regulations in S. globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 strains respectively were studied. These two compounds are extremely active against cancer cells, especially against some types of carcinomas. Genes lndI and lanI were cloned from the respective biosynthesis gene clusters of studied strains and showed to be involved in antibiotics biosynthesis control at the level of activation of structural genes expression. Identified genes have been disrupted within the chromosomes of studied strains. In both cases obtained mutants were characterized by the complete fail of landomycins production. Such effect is typical for mutations in regulatory genes. Opposite – overexpression of lndI gene in the wild type strain lead to the increase of antibiotics biosynthesis up to 10-11 times. Respective mutant strains were complemented via introduction of both lndI and lanI showing the interchangeability of regulators in their ability to restore the landomycins production. As a result of amino acid sequences comparison and further complementation experiments of respective regulatory mutants it was shown, that regulatory genes involved in angucycline polyketides biosynthesis control are forming the distinct phylogenetic group of regulators within the SARP-family. This group significantly differs from proteins, controlling production of other poliketyde antibiotics such as anthacyclines of semiquinones by their structural and functional features. Hovewer regulatory gene jadR1 from angucycline antobiotic jadomycin B biosynthesis  gene cluster was able to restore landomycin A production but not landomycin E.

Experiments on regulatory proteins titration on the lndI and lndE genes promoter regions cloned into high copy number plasmids and introduced into S. globisporus 1912 showed significant decrease in landomycin E production. This indicates that some DNA-binding protein is actively interacting with the studied promoters and in such way an activation of transcription of respective genes within the chromosome is repressed. This results in decrease in the level of antibiotics biosynthesis. lndI gene have been cloned into expression vector and overexpresed in E. coli cells. Respective protein was purified via affinity chromatography by two different methods with His and chitin binding domain tags and used in following experiments. Investigations of purified LndI protein showed it’s binding to the lndE gene promoter region and to the promoter of its own gene, activating or enhancing their transcription respectively. The binding strongly depends on amount of protein and specific unlabeled DNA, added to the reaction mixture. In such way, to our knowledge, LndI is a first example of polyketides biosynthesis regulator with autoregulatory function.

To study the temporal and spatial pattern of lndI gene expression the reporter gene coding for enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used. Promoter regions of lndI and lndE genes were cloned into pIJ8660 vector in such way to perform transcription of promoterless reporter gene. With the use of obtained system it was shown that initiation of lndI gene transcription occurred at 12 hours of growth in liquid media, and reached maximum at the time of the most active landomycin E accumulation, corresponding to 48-60 hours of culture growth. The following decraese in antibiotics production is caused by the partial autolisis of micelia that was conducted by the propidium iodide staining. Additionally, both regulatory and structural genes are not expressed within the aerial mycelia and spores and are active only in substrate mycelia. This data shows that lndI gene and landomycin biosynthesis structural genes expression is strictly controled both temporaly and spatialy. The streptomycin resistance gene rpsL coding for small ribosomal protein 6 was cloned from wild type and antibiotic overproducing strains of S. globisporus and respective mutation was locilized. Using EGFP reporter gene it was shown that the overproducing phenotype of the mutant is partially caused by the increase of lndI regulatory gene expression. Additionally introduction of lndI gene cloned into integrative plasmid vector into mutant strain lead to increases in landomycin E production.

To study both processes of lndI transcription and translation coupled its fusion to EGFP gene coding region was created via PCR strategy. With the use of such hybrid we found, that some lag-period exists between lndI gene transcription initiation and starting of its mRNA translation. This pause is caused by the presence of rare for streptomycetes leucil TTA codon transcribed by bldA-tRNA within the coding region of lndI gene. Exchange of this codon on synonymous CTC lead to the bldA independent expression of lndI. Beside this wild type lndI gene is not active in bldA– mutant of S. coelicolor why the CTC variant is effectively expressed. This indicate that lndI gene mRNA can not be miss-translated as it was shown for a huge amount of streptomycetes genes containing regulatory TTA codon.

Gene prx coding for proteinase/endopeptidase was cloned from lnd-gene cluster and studied. The prx gene was disrupted within the chromosome of S. globisporus 1912 strain. The respective mutant was characterized by significant decrease in landomycin E production but not the complete loss. Such phenotype is restored by the introduction of the prx gene but not the lndI gene, indicating the different levels of action of these regulatory elements. Introduction of additional copies of the gene into wild type strain lead to increase of antibiotics production up to 2-3 times. This data shows that prx gene product is involved in positive regulation of landomycin E production, possibly at the level of post-translational modification of biosynthesis enzymes. The most expected candidate on the role of Prx action is putative dehydratase encoded by the lndV gene. Computational analysis shown presence of processing signal within the LndV amino acid sequence.

Keywords: Streptomyces, polyketide antibiotics, landomycin, biosynthesis regulation, transcriptional factors, transcription, translation, expression, green fluorescent protein.