|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
ПОЛІШКО ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА
УДК 579.222.6
ВПЛИВ ТРАНСПОРТУ ФАГОВОЇ ДНК
НА СТРУКТУРНО – ФУНКЦІОНАЛЬНІ ПОКАЗНИКИ БАКТЕРІАЛЬНОЇ КЛІТИНИ
03.00.07 –мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ - 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Вінніков Альберт Іванович, Дніпропетровський національний університет, завідувач кафедри мікробіології і вірусології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів
доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології і імунології
Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, м. Київ
Захист відбудеться “19” грудня 2001 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)
Автореферат дисертації розіслано "_19_" листопада 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема стійкості до антибіотиків є актуальною як для теоретичної, так і для практичної мікробіології та медицини. Незважаючи на велику кількість досліджень у даній галузі, проблема ще не вирішена, тому що необхідне глибоке вивчення і розуміння механізмів виникнення і передачі антибіотикостійкості в популяціях мікроорганізмів. Відкриття і впровадження нових антибіотиків цілковито не вирішує проблему. Необхідні дослідження, пов`язані з пошуком і підбором факторів, які б знижували антибіотикостійкість, що у свою чергу створить нові можливості в раціональній терапії інфекційних захворювань. Особливу значимість це має стосовно патогенних штамів стафілокока, одного з основних збудників внутрішньолікарняної інфекції.
Як відомо, існують біохімічні механізми і генетичні фактори антибіотикостійкості. Виникнення стійкості до антибіотиків зв'язують або з мутаційними процесами, або з процесами генетичної рекомбінації. Установлено, що у стафілококів провідним процесом передачі генетичних детермінант антибіотикостійкості у природних умовах є загальна і специфічна трансдукція (Зуєва, 1980). Необхідно відзначити, що істотною стадією процесів генетичної рекомбінації є транспорт ДНК через цитоплазматичну мембрану бактеріальної клітини. Для пояснення механізму такого транспорту висувається кілька гіпотез. Найбільш доказовою вважається концепція Грінюса про векторальний переніс ДНК по градієнту електрохімічного потенціалу іонів водню при рівній участі двох компонентів протонрушійної сили: трансмембранної різниці електричних потенціалів і градієнта протонів. У той же час існують і інші припущення, наприклад про участь лише градієнта протонів у забезпеченні транслокації ДНК.
Що стосується стафілококів, то можна відзначити лише одиничні роботи, присвячені з'ясуванню механізмів і рушійних сил транслокації нуклеїнових кислот усередину клітин, і тому проблема вимагає глибокого системного вивчення.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Представлені дослідження є частиною роботи, проведеної на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету в рамках програми НДР держбюджетної теми 01-11-97 “Дослідження особливостей метаболічних процесів мікроорганізмів і розробка технічних умов виробництва нових біологічно активних препаратів”, що координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти і науки України.
Мета і задачі досліджень
Метою нашої роботи було вивчення процесів, що відбуваються на мембранах лізогенних штамів стафілококів у ході транспорту фагової ДНК. Для досягнення мети необхідно було виконати такі завдання:
- вивчити основні параметри системи енергозабезпечення у досліджуваних лізогенних штамах стафілококів;
- визначити взаємозв'язок процесів транспорту фагової ДНК та енергетичної системи досліджуваних штамів стафілококів;
- дослідити зміни структурно - функціональних показників мембранного апарату стафілококів у ході фагової інфекції.
Об'єктом дослідження були штами Staphylococcus aureus, що містять плазміди стійкості до тетрацикліну і хлорамфеніколу, із музею культур кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету та з колекції Інституту мікробіології і епідеміології ім. Гамалеї РАМН. У роботі також використаний стафілококовий бактеріофаг 52А з Міжнародного набору бактеріофагів.
Предметом досліджень були процеси, що відбуваються в мембранному апараті лізогенних штамів стафілококів у ході транслокації фагової ДНК усередину клітини.
Матеріали і методи досліджень. У роботі застосований ряд мікробіологічних і біохімічних методів досліджень, зокрема методи ідентифікації досліджуваних штамів стафілококів, одержання препаратів суспензії “спочиваючих” клітин, мембранних везикул, концентрованої суспензії бактеріофагів, визначення ефективності фаголізису. Енергетичні процеси і транспорт іонів вивчали на цілих клітинах та мембранних везикулах із застосуванням методу синтетичних проникаючих зондів, іон-селективних електродів і полярографічного методу. Внутрішньоклітинну концентрацію АТФ визначали методом Хемплінга, усі дані перераховувались на 1 мг білка. Отримані результати піддавалися статистичній обробці.
Наукова новизна одержаних результатів. Установлено, що лізогенні по фагу 52А штами стафілококів NT-1 (Tcr) і NC-1 (Cmr) утворюють у ході роботи дихального ланцюга і Н+–АТФази трансмембранну різницю електрохімічних потенціалів з орієнтацією електричного поля “мінус” усередині клітини і “плюс” усередині мембранних везикул стафілококів. Утворення АТФ відбувається ензиматичним шляхом у ході окисного і субстратного фосфорилування і при неензиматичній генерації  при “іонному” фосфорилуванні.
Уперше показано, що транспорт фагової ДНК у клітини лізогенних штамів стафілокока залежить від енергії електрохімічного потенціалу іонів водню і внутрішньоклітинного пула АТФ.
Уперше встановлено, що у досліджуваних лізогенних штамах стафілокока транспорт ДНК залежить в основному від енергії трансмембранної різниці електричних потенціалів і, меншою мірою, від градієнта протонів.
Отримано експериментальне підтвердження, що транспорт фагової ДНК приводить до зміни мембранних ферментних систем: зняття трансмембранної різниці електричних потенціалів, роз'єднання окислювання і фосфорилування, підвищення проникності мембрани для протонів і ряду одновалентних катіонів.
Уперше встановлено, що в ході транслокації ДНК відбувається індукція потоків іонів водню, калію, натрію. Установлено, що динаміка транслокації фагової ДНК подібна динаміці транспорту канал-формуючого антибіотика граміцидину, що свідчить про формування каналу для транспорту ДНК через цитоплазматичну мембрану усередину клітини.
Практична значимість. Результати проведених досліджень можуть бути підставою для цілеспрямованого пошуку з'єднань, здатних вибірково пригнічувати транслокацію фагової ДНК у ході процесів трансдукції у стафілококів. Це один з напрямків підвищення ефективності антибіотикотерапії інфекційних захворювань стафілококової етіології, оскільки створює можливості для зниження ймовірності поширення генетичних детермінант стійкості до антибіотиків у популяціях стафілококів у природних умовах.
Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету під керівництвом доктора біологічних наук, професора А.І. Віннікова. Дослідження, проведені здобувачем при виконанні дисертаційної роботи, є продовженням тема-тики, яка виконується співробітниками кафедри мікробіології та вірусології ДНУ.
Експерименти по вивченню компонентів протонрушійної сили та електрогенних характеристик мембран стафілококів були виконані на кафедрі клітинної фізіології та імунології Московського державного університету за консультативною допомогою професора кафедри, доктора біологічних наук В.Д. Самуілова.
Особистий внесок автора у дисертаційну роботу полягав у визначенні методичних підходів та проведенні експериментальних досліджень, у статистичній обробці даних, аналізі та узгодженні отриманих результатів і в порівнянні їх з літературними матеріалами, у підготовці публікацій за результатами досліджень і їх представленні на наукових конференціях. Крім того, разом із науковим керівником проведено аналіз результатів, їх узагальнення та інтерпретацію.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на X Міжнародному Біофізичному конгресі (Ванкувер, Канада, 1990), Міжнародній науковій конференції “Мембранна біоенергетика” (Москва, 1994), науково-практичній конференції Дніпропетровського держуніверситету за підсумками науково-дослідної роботи в 1996 р, (Дніпропетровськ, 1996), VII Українському Біохімічному з'їзді (Київ, 1997), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), II Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 1998), V Міжнародній конференції “Альянс Франсез” (Дніпропетровськ, 1998),
I Міжнародній конференції “Наука й освіта-98” Дніпропетровськ, 1998).
Матеріали дисертації також увійшли до ряду навчальних програм загальних і спеціальних курсів кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету: “мікробіологія”, “вірусологія”, “біотехнологія”, “медична мікробіологія”, “фізико-хімічні методи досліджень”, “антибіотики”, “прикладна ензимологія”.
За темою дисертації опубліковано 10 наукових праць.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 150 сторінках машинописного тексту і складається з розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення” (включає три розділи власних досліджень), “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 225 посилань (з них 155 іноземних авторів). Роботу доповнюють 10 таблиць і 25 рисунків.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з 3 підрозділів, які містять сучасну інформацію про енергетичний обмін у стафілококів, зокрема аналіз катаболічних процесів, склад дихального ланцюга, особливості процесів трансформації енергії. Також розглядається хеміосмотична концепція транспорту нуклеїнових кислот у мікроорганізмів у процесах генетичної рекомбінації: трансформації, кон'югації, трансдукції. Здійснено аналіз біохімічних і генетичних механізмів стійкості бактерій до антибіотиків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктами досліджень були культури лізогенних штамів Staphylococcus aureus: NT–1 (Tcr) і NC–1 (Cmr), що містять фаг 52А як профаг і плазміди стійкості, відповідно до тетрацикліну і хлорамфеніколу. Штами отримані з музею культур кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету і з колекції НДІ мікробіології і епідеміології ім. Гамалеї РАМН.
Застосований стафілококовий бактеріофаг 52А належить до сіркогрупи В, фагогрупи (літичної групи) I, морфогрупи 2.1, входить до складу Міжнародного набору бактеріофагів; серійні препарати отримані з НДІМЕ ім. Гамалеї РАМН.
Вивчення обмінних процесів проводилося на цілих клітинах стафілококів і фракції мембранних везикул.
Для культивування стафілококів використовували рідкі і тверді поживні середовища: бульйон Хоттінгера, м‘ясопептонний бульйон, м‘ясопептонний агар. При роботі з фагами до складу середовищ уводили СаСl2 у кінцевій концентрації 0,04 М. У ряді експериментів застосовували спеціальний фаговий буфер.
Клітини стафілококів вирощували до кінця логарифмічної фази росту при 37°С у стаціонарних умовах, потім клітини відокремлювали центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин, двічі промивали і ресуспендували в буферному розчині.
Безклітинний гомогенат одержували в результаті ультразвукової обробки. Фракцію мембранних везикул отримували диференційним центрифугуванням. Інтенсивність дихання вивчалася полярографічним методом із застосуванням закритого платинового електрода Кларка.
Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів вивчали за методом Liberman, Skulachev (1970) із застосуванням синтетичних проникаючих іонів: тетрафенілфосфонію (ТРР+) і тетрафенілборату (ТБ-). Калібрування величини, що реєструвалася, проводили за поглинанням іонів відповідно до рівняння Нернста.
При вивченні величини компонентів протонрушійної сили Δψ і ΔрН на цілих клітинах стафілококів як зонди використовували іони ТРР+ і саліцилової кислоти (SAL-) та електроди, селективні по цих іонах, виготовлені в лабораторії Грінюса (1986). Інкубаційне середовище містило 40 мМ трис-НCl буфер чи 40 мМ МЕS буфер, залежно від мети експерименту. Розрахунок величин трансмембранної різниці електричних потенціалів (Δψ) і градієнта концентрації протонів (ΔрН) проводили згідно з рівняннями, запропонованими Грінюсом (1986), на підставі даних по розподілу ТРР+ і SAL– відповідно.
Інтенсивність флуоресценції АНС– вимірювали на флуориметрі Hitachi MPF-4 і спектрофотометрі Specord M-40.
Градієнтний потік К+ на цитоплазматичній мембрані клітин створювали додаванням валіноміцину, градієнт рН – внесенням у середовище НСl або трис- лугу. Транспорт К+, Na+ і Н+ у стафілококах вимірювали з застосуванням відповідних селективних електродів фірми Крітур. Вимірювальна схема включала іономер ЭВ-74 і самопис КСП-4 з вбудованою схемою компенсації.
Для визначення кількості АТФ, синтезованого при формуванні трансмембранного потенціалу чи градієнта рН, проводили екстракцію клітин 30%-ю трихлороцтовою кислотою за методом Коля і співавт. (1967). Кількість АТФ в екстрактах визначали за методом Хемплінга (1970) з використанням додаткової ферментативної системи, що містить гексокіназу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу. Кількість АТФ розраховували за кількістю вимірюваного при 340 нм відновленого NАДФН. Концентрацію АТФ виражали в молярних одиницях, беручи за основу при розрахунках кількість внутрішньоклітинної води для стафілокока 1,55 мкл на 1 мг сухої ваги клітин, установленої Niven, Hamilton (1972).
Концентрації внесених субстратів, інгібіторів дихального ланцюга, протонофорних роз‘єднувачів та іонофорних антибіотиків наводяться в підписах до рисунків і таблиць.
Для вивчення транспорту фагової ДНК накопичення стафілококових фагів проводили шляхом їх розмноження на чутливих клітинах стафілококів при інкубуванні фагів у рідкому середовищі чи в м'якому 0,7% агарі методом агарових шарів за Граціа. Концентрування фагової суспензії проводили центрифугуванням при 5000 і 10000g. Стерилізацію фаголізатів здійснювали шляхом фільтрування через міліпорові фільтри (діаметр шпар 0,30 і 0,45 мкм).
Ефективність фагової інфекції оцінювали методом Граціа за кількістю негативних колоній, що утворилися на індикаторному газоні з клітин, у які проникла фагова ДНК. Множинність інфікування складала 0,1. Експериментально було встановлено, що час адсорбції дорівнював 5 хв, за цей період адсорбується 95% фагів.
У дослідах по вивченню впливу інгібіторів, роз‘єднувачів та іонофорних антибіотиків на ефективність фагової інфекції зазначені з'єднання вносилися: за 10 хвилин до інфікування; у момент інфікування; після періоду адсорбції, що складав 5 хвилин.
Застосовували такі інгібітори: інгібітор ланцюга переносу електронів – ціанистий калій (KCN) – 10-3М; інгібітор Н+-АТФази N1N1– дициклогексилкарбо-диїмід (ДЦКД) – 10-4М; протонофорний роз‘єднувач m-хлоркарбонілцианідфенілгідразон (ХКФ) – 10-5М; інгібітори перетворення глюкози катаболічним шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса фторид натрію (NaF) і монойодацетат (CH2ICOOH), інгібітор синтезу АТФ арсенат натрію (Na3AsО4) у концентраціях
10-3М.
У контрольних дослідах вивчали вплив застосовуваних речовин на інфекційну активність фагових часток і життєздатність клітин. Час інкубації з досліджуваними з'єднаннями фагів і клітин дорівнював часу контакту в досліджених пробах. Після цього визначали інфекційний титр фагів і кількість колоній стафілококів.
У дослідах по вивченню впливу фагів на процеси трансформації енергії суспензії фагів вносили безпосередньо у вимірювальні комірки.
На рисунках наводяться усереднені дані декількох визначень. Статистичну обробку результатів 3 - 5 експериментів проводили із застосуванням t-розподілу Стьюдента на 5%-ному рівні значимості (з коефіцієнтом надійності 0,95).
У дослідженнях використовувалися реактиви “Reanal” (Угорщина), “Sigma” (США), “Serva” (Німеччина), виробництва Росії та України.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1.Джерела конвертованої енергії у досліджуваних штамах стафілококів
З метою оцінки основних етапів трансформації енергії у досліджуваних штамах було проведено визначення основних генераторів і величин протонрушійної сили і її компонентів (ΔΨ і ΔрН), а також динаміка змін концентрації внутрішньоклітинної АТФ у ході “іонного” фосфорилування. Для реєстрації генерації протонрушійної сили був застосований метод виміру флуоресценції 8-аніліно-1-нафталінсульфонату (АНС-) на цілих клітинах і фракції мембранних везикул.
Слід зазначити, що квантовий вихід флуоресценції АНС– є сумарним проявом дії трансмембранного потенціалу (Δψ) і мембранного градієнта протонів ΔрН.
Інтенсивність флуоресценції АНС– інтактних клітин падає при наведенні різниці електрохімічних потенціалів під час додавання глюкози і зростає при знятті потенціалу поля під впливом ХКФ і КСN (рис.1).
Зворотна картина спостерігається в експериментах з використанням мембранних везикул. Орієнтація поля на мембранних везикулах “плюс” усередині приводить до того, що внесення субстратів НАДН+ і малату викликає наведення протонного електрохімічного потенціалу, що проявляється в підвищенні квантового виходу флуоресценції АНС–. У випадку внесення ХКФ чи КСN квантовий вихід флуоресценції падає, що вказує на дисипацію трансмембранної різниці електрохімічних потенціалів (рис. 2).
Рис.1. Залежність виходу флуоресценції АНС– від наведення різниці протонного електрохімічного потенціалу в інтактних клітинах стафілокока шт. NC-1 (Cmr)
Інкубаційне середовище: 50 мМ трис-сульфата, рН 7,4; 5 мМ MgSO4; 0,1 мМ АНС– і 3,0 мг клітин на 1 мл.
Додатки: 10 мМ глюкоза; 10-5 М ХКФ; 1 мМ КСN.
Для підтвердження отриманих даних були проведені експерименти по визначенню трансмембранної різниці електричних потенціалів. Визначення генерації трансмембранної різниці потенціалів ΔΨ проводили на цілих клітинах з використанням проникного катіона тетрафенілфосфонію (ТРР+) і мембранних везикулах із застосуванням проникного аніона тетрафенілборату (ТБ-).
Інтактні клітини стафілокока поглинають катіони ТРР+, що свідчить про орієнтацію трансмембранної різниці потенціалів “–” усередині клітини. На енергозалежний характер транспорту ТРР+ указує прискорення поглинання катіона при додаванні субстрату – глюкози. Зворотний вихід із клітини катіонів спостерігається при дії специфічних інгібіторів: протонофорного роз‘єднувача ХКФ, інгібітора Н+-АТФази – ДЦКД і інгібітора дихального ланцюга – КСN. Спостерігалося також незначне поглинання аніонів ТБ- у концентраціях, приблизно в 10 разів менших, ніж поглинання катіонів ТРР+. На відміну від цього мембранні везикули поглинають аніони ТБ-, що вказує на напрямок поляризації трансмембранного електричного поля: “+” усередині мембранних везикул і “-” зовні. Додавання субстрату НАДН+ приводить до поглинання додаткової порції аніонів ТБ-. Вихід із мембранних везикул аніонів пов'язаний з деенергізацією мембранних везикул. Цей процес відбувається при додаванні інгібітора дихального ланцюга КСN і протонофорного роз‘єднувача ХКФ. Додавання АТФ запускає в хід Н+-АТФазний комплекс, що приводить до поглинання ТБ-, а внесення інгібітора ДЦКД – до виходу аніонів з мембранних везикул.
Рис.2. Залежність виходу флуоресценції АНС– від наведення різниці протонного електрохімічного потенціалу в мембранних везикулах стафілокока, шт. NC-1 (Cmr)
Середовище інкубації: 50 мМ трис-сульфата, рН 7,4; 5 мМ MgSO4; 0,1 мМ АНС– і 2,5 мг білка мембранних везикул.
Додатки: 1 мМ НАДН+; 5 мМ малат; 10 мкМ ХКФ; 1 мМ КСN.
Крім того, відзначено поглинання мембранними везикулами катіонів ТРР+ у концентраціях, на порядок нижчих, ніж це відбувалося з аніонами ТБ-.
Таким чином, флуоресценція АНС- і трансмембранний електрофорез проникних іонів ТРР+ і ТБ- показали, що присутні два генератори трансмембранної різниці електричних потенціалів: Н+-АТФаза і дихальний ланцюг. Трансгідрогеназний комплекс не виявлений. Орієнтація електричного поля “мінус” усередині клітин і “плюс” усередині мембранних везикул.
У вивчених штамах стафілококів синтез АТФ також можливий і в ході “іонного” фосфорилування. Це було встановлено експериментами, при яких на мембрані клітин створювалися іонні градієнти. В одному випадку - градієнт іонів К+ з наступним додаванням валіноміцину, що викликає градієнтний потік іонів К+ із клітини і приводить до генерації ΔΨ, що потім трансформується в енергію АТФ. Приріст АТФ у цьому випадку складав 0,245 мМ за 30 сек. Далі створювали градієнтний потік ΔрН. Це приводило до синтезу АТФ: 0,1 мМ за 30 сек.
Визначена величина генерованої ΔΨ і градієнта протонів у сумі складових протонрушійної сили на мембрані у досліджуваних штамах.
На рис.3 представлений вимір трансмембранної різниці електричних потенціалів за допомогою ТРР+- селективного електрода. При внесенні визначеної кількості ТРР+ у середовище відбувається перерозподіл іонів і встановлення рівноважних концентрацій. Внесення клітин стафілококів зумовлювало поглинання іонів ТРР+. Додавання граміцидину спричиняло утворення каналів і швидкий вихід іонів ТРР+ у середовище.
Рис.3. Вимірювання трансмембранної різниці електричних потенціалів за допомогою ТРР+ - селективного електрода у клітин стафілококів шт. NC-1 (Cmr)
Середовище інкубації: 40 мМ трис-НCl буфер, рН 7,0; 3 мМ MgCl2. Додатки: 1 мкМ ТРР+; 3,0 мг по сухій вазі інтактні клітини (1) і прокип’ячені (2). Δa – зміна показників ТРР+ – електрода при калібруванні, Δb – різниця показників ТРР+ – електрода, коли клітини знаходятся у нативному енергізованому стані та після неспецифічного поглинання ТРР+ клітинами, інактивованими у ході кип’ятіння.
Таким чином, спостерігалося утворення на мембрані клітин градієнта протонів “-” усередині, “+” зовні.
У такий спосіб визначали електричну складову протонрушійної сили - ΔΨ, а ΔрН визначали за тією ж схемою із застосуванням іона SAL- і селективного по ньому електрода. Розрахунок величин ΔΨ і ΔрН проводили відповідно до рівняння Нернста в модифікації, що відповідає умовам експерименту (Грінюс, 1986).
При визначенні величини компонентів протонрушійної сили (Δр): трансмембранної різниці електричних потенціалів і градієнта протонів при різних значеннях рН середовища інкубації, установлено, що величина Δψ зростає від 102 до 157 мВ, а величина ΔрН зменшується від 89 до 37 мВ при збільшенні рН середовища інкубації від 5,0 до 8,0. Сумарне значення протонрушійної сили залишається незмінним у межах 191-194 мВ у діапазоні рН 5-8, що відповідає основним постулатам теорії Мітчелла.
Таким чином, очевидно, що у вивчених лізогенних штамах стафілококів присутні генератори протонрушійної сили – дихальний ланцюг і Н+-АТФаза, крім того, можливе наведення ΔΨ і ΔрН, а потім синтез АТФ неензиматичним шляхом створення іонних градієнтів.
2. Взаємозв'язок процесів енергозабезпечення і транслокації фагової ДНК
у лізогенних штамах стафілококів
| 
