Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Тимченко Наталія Миколаївна

УДК 612.014.46.111.11:57.043

ВПЛИВ ТЕМПЕРАТУРИ ТА СКЛАДУ СЕРЕДОВИЩА НА ФЕТАЛЬНИЙ ГЕМОГЛОБІН І ГЕМОГЛОБІН ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ

03. 00. 19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини

Національної академії наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Моісеєв Віктор Олексійович,

                                     Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної

                                     академії наук України, головний науковий співробітник

                                     відділу кріобіофізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович,

                                    Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства

                                    аграрної політики України, завідувач кафедри хімії і біохімії;

                                    кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович,

                                    Харківський національний університет МОН України,

                                    доцент кафедри біологічної і медичної фізики.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет Міністерства охорони

                                    здоров’я України, кафедра біохімії, м. Харків.

Захист відбудеться 22.06. 2004 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за

адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий 21.05. 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Член-кореспондент НАН України                                                                     Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

       Актуальність теми. Результати кріобіологічних досліджень мають величезне значення для практичного застосування в різних галузях народного господарства. Дані експериментів в області кріобіології дозволили визначити, зокрема, роль білків в кріопошкодженні біологічних систем різного рівня організації. Тепер ще залишаються актуальними питання консервації клітин кордової крові - еритроцитів. Основним білком еритроцитів є гемоглобін. Широке застосування методів низькотемпературного зберігання біологічних об’єктів потребує більш глибокого вивчення механізмів впливу факторів низькотемпературного консервування на молекулярному рівні.

Будова молекули гемоглобіну змінюється у процесі онтогенеза, але, незалежно від типу і періоду синтезу, більшість молекул гемоглобіну мають по два однакових поліпептидних ланцюга. Ембріональні гемоглобіни присутні на протязі перших двох місяців гестації. В останній ембріональний період життя після двох місяців гестації відбувається переважно синтез γ-ланцюгів, внаслідок чого переважає фетальний гемоглобін (гемоглобін F) (Карлсон Б., 1983). Структурно-функціональні особливості фетального гемоглобіну не так широко вивчені, як гемоглобіну А. Особливістю фетального гемоглобіну є те, що він в порівнянні з гемоглобіном А в фізіологічних умовах володіє підвищеною спорідненістю до кисню. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну завдяки вираженому антигипоксичному ефекту в експериментальних дослідженнях (Антоненко В.Т., 1979, 1980) обумовили необхідність тривалого зберігання гемоглобінів кордової крові.

Раніше досліджувалось пошкодження білків при заморожуванні (Білоус А.М., Луговий В.І., Лемешко В.В., 1976) і в теперішній час ця тема залишається актульною (Koseki T., 1990; Anchordoquy T.J., Carpenter J.F., 1996; Cao E., Foster P.R., 2003). Також були досліджені механізми кріопошкоджень білків, які мають четвертичну структуру. Визначено, що в результаті заморожування-відтавання відбувається дисоціація молекул білків і подальша рекомбінація. Гіперконцентрація електролітів, яка виникає у розчині при виморожуванні води, є основною причиною структурної перебудови молекули. При заморожуванні діє пошкоджуючий білки фактор – дегидратація поліпептидних ланцюгів, порушується конформаційний стан білка, зростає ступінь міжмолекулярних контактів, при цьому створюються умови для швидкого окислення SH-груп і створення S-S зв’язків, внаслідок чого втрачаються специфічні властивості білка. При застосуванні кріопротекторів можна запобігти процесу утрати властивостей біомакромолекул при охолодженні. Разом з тим не вивчені механізми пошкодження фетального гемоглобіну при заморожуванні-відтаванні. Саме тому дослідження структурно-функціональних властивостей фетального гемоглобіну при впливі пошкоджуючих факторів в процесі заморожування–відтавання, при взаємодії його з кріопротекторами, являються на даний час актуальними. Значимість невирішених проблем обумовила вибір теми, її актуальність й цільову спрямованість дисертаційного дослідження.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіофізики в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 69 “Дослідження впливу температури на структурний стан мембрани і цитозолю, а також на проникненість для електролітів і неелектролітів еритроцитів людини на різних стадіях розвитку і при деяких патологіях”, шифр – 2.2.6.69, № держреєстрації 0201U005152; № 99 “Дослідження впливу низьких температур і складу середовища на деякі елементи фетоплацентарного комплексу людини (клітини і плазма кордової крові, тканини плаценти та їх екстракти)”, шифр – 2.2.6.99, № держреєстраії 0100U003482.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначити, як впливає заморожування–відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

       Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Провести вивчення впливу заморожування–відтавання на конформаційний стан гемоглобінів A і F.
2. Дослідити вплив заморожування-відтавання на функціональний стан гемоглобінів А і F.
3. Визначити характер впливу розчинів NaCl і KCl концентраціями 0,5-3,5М на конформаційний стан фетального гемоглобіну.
4. З‘ясувати, чи впливають кріопротектори гліцерин і 1,2-пропандіол в області концентрацій 10-40% на конформацію гемоглобіну А і фетального гемоглобіну при заморожуванні-відтаванні.

Об‘єкт дослідження. Конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

Предмет дослідження. Структурно-функціональні зміни гемоглобінів A і F, викликані заморожуванням–відтаванням та впливом на них складу середовища (сольових розчинів і кріопротекторів).

Методи дослідження. Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії, гель-хроматографії, сольвентно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії, температурно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії в діапазоні температур +10÷+380С  досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального гемоглобіну. Ультрафіолетовою диференціальною спектрофотометрією вивчався характер впливу заморожування-відтавання і складу розчинника, методом гель-хроматографії досліджувався вплив складу розчинника,  сольвентно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією вивчався вплив заморожування–відтавання і кріопротекторів на конформаційний стан гемоглобіну А і фетального гемоглобіну. Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в діапазоні температур +10÷+380С досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального гемоглобіну до і після заморожування–відтавання. Диференціальною скануючою калориметрією визначали температури денатурації білків. Спектрофотометрією вивчали зв’язування гемоглобінами А і F органічного барвника бромтимолового синього. Спектрофотометрично кількісно визначали наявність окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів А і F.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше експериментально встановлено, що після заморожування–відтавання спостерігається збільшення вмісту метгемоглобінів у розчинах гемоглобінів A і F. Показано, що для молекули фетального гемоглобіну розпад на дімери відбувається при менших концентраціях натрію хлориду і калію хлориду, ніж для гемоглобіну А. Визначено, що фетальний гемоглобін функціонально менш стійкий, ніж гемоглобін А, до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М і подальшого заморожування–відтавання в присутності цих концентрацій солей. Вперше встановлено, що 1,2-пропандіол змінює конформацію фетального гемоглобіну після заморожування-відтавання, тоді як у випадку гемоглобіну А такого впливу не виявлено. Показано, що фетальний гемоглобін менше агрегує в присутності поліетиленгліколя-1500 в порівнянні з гемоглобіном А. Визначені числові значення параметрів зв’язування фетальним гемоглобіном органічного барвника бромтимолового синього, які вказують на те, що у фетального гемоглобіну в порівнянні з гемоглобіном А менше доступних гідрофобних областей на поверхні молекули.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі дані будуть використані при вивченні механізму дії заморожування–відтавання на конформаційний і функціональний стан гемоглобіну F. Вони також можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в тому, що його стійкість до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні менше, ніж у гемоглобіну А.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував дані літератури за темою дослідження. Автором разом з науковим керівником були визначені мета та завдання роботи, сформульовані остаточні висновки. Автором особисто одержані результати експериментальних досліджень та проведено їх статистичну обробку, зроблено попередні висновки. В статтях, опублікованих спільно з Розановою К.Д. та іншими співавторами, були використані результати, самостійно отримані здобувачем. У роботі, опублікованій сумісно з Онищенко О.В., автор готував зразки для експериментів, обробляв та аналізував одержані результати.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (м. Харків, 2001); Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (м. Харків, 2001); V з’їзді білоруського суспільного об’єднання фотобіологів і біофізиків „Молекулярні, мембранні і клітинні основи функціонування біосистем (м. Мінськ, 2002); 14-й зустрічі European Association for Red Cell Research (м. Роскофф, Франція, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в провідних фахових наукових журналах і 4 тез доповідей на міжнародних і національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Матеріали викладені на 114 сторінках друкованого тексту і містять: введення, огляд літератури (1 розділ), матеріали, методи і методика досліджень (2 розділ), результати досліджень і їх обговорення (3-6 розділ), заключення, висновки. Матеріали дисертації проілюстровані 30 рисунками й 7 таблицями. Список літератури складається з 136 джерел і викладений на 15 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводились в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Використовували оксигемоглобін А людини (НbА), виділений з свіжої донорської крові і очищений методом гель-хроматографії; фетальний гемоглобін (HbF), виділений з кордової крові за допомогою денатурації гемоглобіну А і осадження його сульфатом амонію, і очищення методом гель-хроматографії. Метгемоглобіни А і F одержували шляхом окислення оксигемоглобінів А і F надміром 1М ферецианіду калію і очищення одержаних розчинів на хроматографічній колонці.

Ліпосоми формували з фосфатидилхоліну (ФХ) і кардіоліпіну (КЛ) у ваговому співвідношенні ФХ:КЛ=4:1, грубу дисперсію опрацьовували 10 хв ультразвуком за допомогою ультразвукового диспергатора на частоті 22кГц. Заморожування розчинів гемоглобінів А і F  проводили у фізіологічному розчині з середньою швидкістю 200С/хв до температури рідкого азоту. Відтавання здійснювали на водяній бані при +200С. Вміст оксиформ HbA і HbF в гемолізатах перед виділенням гемоглобінів складав 902%. Розчини бромтимолового синього (БТС) готували на 0,05М Na–фосфатному буфері, рН 7,2. Час контакту HbA і HbF з БТС складав 20 хв. Спектри поглинання розчинів HbA і HbF, БТС, зразків HbA+БТС, HbF+БТС записували на спектрофотометрі “РYЕ UNICAM 8000” (Великобританія). Концентрації HbA і HbF в зразках визначені спектрофотометрично і склали 0,81,4×10-5М і 1,21,5×10-5М, відповідно; концентрації БТС – 530*10-6М.

Сольвентно-пертурбаційна диференціальна спектрофотометрія в ультрафіолетовій області застосовувалась для дослідження конформаційного стану молекул гемоглобіну А і фетального гемоглобіну при взаємодії цих білків з розчинами кріопротекторів.

Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в ультрафіолетовій області оцінювали конформацію білків при дослідженні впливу температури в інтервалі +10÷+38°С на фетальний гемоглобін і гемоглобін А до і після заморожування-відтавання.

Метод гель-хроматографії застосовувався для оцінки агрегатного стану білків в розчинах солей концентраціями 0,5-3,5М. Для характеристики конформаційного стану білка використовували перші похідні спектрів поглинання гемоглобінів А і F в ультрафіолетовій області. Спектрофотометрично кількісно визначали вміст окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів А і F.

Диференціальною скануючою калориметрією визначали температуру денатурації білків за величиною температури у максимумі термограм, що реєструються. Кінетичні залежності процесів зв’язування окси- і метгемоглобінів А і F з ліпосомами одержували, реєструючи зміну оптичної щільності білок-ліпідних сумішів у максимумі смуги Соре. Результати експериментів оброблені статистично з врахуванням коефіцієнтів Стьюдента для n≥5 при довірливій імовірності Р=0,95.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив заморожування–відтавання на розчини гемоглобіну A і фетального гемоглобіну. Вивчення вмісту різних форм гемоглобіну у розчинах білків показали, що після заморожування–відтавання спостерігається збільшення вмісту метгемоглобіну. Одержані результати свідчать про те, що в процесі заморожування–відтавання утворюються умови, які сприяють окисленню заліза в білках. Оскільки в розчині присутній тільки NaCl, можливо, такі умови утворюються при концентруванні солі в процесі вимерзання води. Проведені дослідження в розчинах NaCl концентраціями 0,5-3,5М підтверджують наші припущення.

Заморожування–відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін в молекулах цих білків. Після заморожування-відтавання білків відбувається зміщення максимуму спектра поглинання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в короткохвильову область. Це свідчить про збільшення доступності розчиннику поглинаючих хромофорів, в даному випадку, тирозинових амінокислотних залишків, так як зміни в формі першої похідної спектрів поглинання (ІПСП) відбуваються в області 277 нм, яка відповідає поглинанню тирозинових амінокислотних залишків, що розташовуються в полярних областях. Таким чином, заморожування-відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін, які торкаються переважно полярних областей білкових глобул.

Досліджено вплив температури в діапазоні +100С÷+380С на гемоглобін А і фетальний гемоглобін до і після заморожування-відтавання. При цьому використовували методи температурно-пертурбаційної спектрофотометрії і аналізу ІПСП. Залежність інтенсивності в максимумі температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм (температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання  при +100С, від температури для розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну має S-образний вид. На цій залежності для гемоглобіну А існують злами: перший в області температур +250С÷+270С і другий в області температур +330С÷+350С. Для фетального гемоглобіну подібні злами спостерігаються при менших температурах: перший в області температур +200С÷+230С, другий в області температур +270С÷+300С. Ця S-образна залежність, можливо, зв’язана з наявністю конформаційних змін в молекулі гемоглобіну А в області температур +250С÷+350С, а фетального гемоглобіну – в області температур +200С÷+300С. Для розчинів гемоглобіну А при +100С і +180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С – відрізняються. Також для розчинів фетального гемоглобіну при +100С і +180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С - відрізяються. Це свідчить про те, що молекули гемоглобінів А і F мають  різний конформаційний стан при +100С і +360С. При дослідженні впливу температур в області +100С÷+380С  на конформаційний стан гемоглобінів А і F виявлено, що після заморожування-відтавання розчинів цих білків відбувається згладжування зламів на залежностях інтенсивності в максимумі температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм (температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання при +100С, від температури. Це свідчить про те, що згладжуються, стають менше помітними за результатами експерименту температурозалежні конформаційні зміни в білкових молекулах.

       Методом диференціальної скануючої калориметрії була визначена температура плавлення фетального гемоглобіну +620С. Це не суперечить літературним даним про те, що HbF менш температуростійкий у порівнянні з HbA.

       Методом диференціальної скануючої калориметрії досліджено вплив заморожування-відтавання на температуру денатурації гемоглобіну і за максимумами термограм визначено, що температура денатурації HbF в фізіологічному розчині зменшилась.

       Таким чином, заморожування-відтавання розчину гемоглобіну F приводить до невеликого зниження термостійкості і згладжування температурозалежних конформаційних змін. Крім того, в процесі заморожування гемоглобіну А і фетального гемоглобіну утворюються умови, які сприяють окисленню заліза в гемоглобіні, котрі, можливо, викликані концентрованим сольовим розчином. Тому для подальшого розкриття цих механізмів нами було вивчено питання з’ясування характеру впливу сольових розчинів на білки, що вивчаються.

       Вплив розчинів солей концентраціями 0,5-3,5М і заморожування–відтавання на стан гемоглобінів А і F. Наведені результати експериментального дослідження впливу розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М, заморожування–відтавання на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F за допомогою методів ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії, гель-хроматографії та кількісного визначення окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів.

       За допомогою методу ультрафіолетової спектрофотометрії одержані ІПСП, які характеризують конформаційний стан гемоглобінів А і F в фізіологічному розчині і з різними концентраціями натрію хлориду. На ІПСП гемоглобіну F максимум в області 277 нм (відповідний поглинанню тирозинових залишків білків) є більш виражений в порівнянні з гемоглобіном А. Це підтверджує відомий факт про більший вміст тирозину в фетальному гемоглобіні в порівнянні з гемоглобіном А. Форми ІПСП HbA і HbF, починаючи з 0,5М натрію хлориду, практично не змінюються до певних концентрацій натрію хлориду, після яких в області 277 нм приймають інший вигляд, теж в свою чергу незмінний при подальшому збільшенні концентрації солі. Концентрації натрію хлориду, після яких відбуваються зміни в формі ІПСП в області 277 нм для гемоглобіну А – 2÷2,5М, для гемоглобіну F – 1,5÷2М натрію хлориду.

Методом ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії одержані залежності ΔЕ/Е від концентрації натрію хлориду в розчині для гемоглобіну А і фетального гемоглобіну (рис. 1). Злам на цих залежностях пов’язаний з розпадом тетрамерів гемоглобінів А і F на димери. Як видно з рис. 1, дисоціація фетального гемоглобіну відбувається при більш низьких концентраціях натрію хлориду.

Рис. 1. Залежність інтенсивності в максимумі диференціальних спектрів при 277 нм гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в присутності розчинів NaCl концентраціями 0,5-3,5М (порівняння з поглинанням відповідного білка в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання відповідного білка в фізіологічному розчині, від концентрації NaCl.

       Одержано розподіл гемоглобінів А і F за молекулярними масами в розчинах з різною концентрацією натрію хлориду методом гель-хроматографії. Встановлено, що положення максимумів на кривих фракціонування розчинів як гемоглобіну А, так і гемоглобіну F в 1,5М натрію хлориду відповідає одній і тій же фракції з молекулярною масою 64 кД. При фракціонуванні розчинів гемоглобіну А і F в 1,9М натрію хлориду положення максимумів для гемоглобіну А не змінюється, в той час як для гемоглобіну F зсувається й відповідає фракції з молекулярною масою 36 кД (рис.2).

Рис. 2. Криві фракціонування розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в присутності 1,5M и 1,9M натрію хлориду. (Е577 - інтенсивність спектра поглинання при 577 нм розчинів гемоглобінів).

       Таким чином, можемо зробити висновки, що фетальний гемоглобін є менш стійкий до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М, оскільки для нього відбуваються зміни конформації, а також з‘являються фракції зі значно меншою молекулярною масою – при менших концентраціях солі. Можливо, це пов’язано з відомим фактом меншого вмісту двох реактивних SH-груп в фетальному гемоглобіні (в порівнянні з гемоглобіном А), які підтримують четвертичну структуру цих білків.

       Після заморожування-відтавання білків в розчинах солей (гемоглобіну А в 1,5М NaCl, фетального гемоглобіну в 1М NaCl), менших за концентрацією, ніж ті, що викликають дисоціацію білкової молекули на димери до заморожування-відтавання, спостерігається зміщення “ноля” ІПСП (максимуму спектра поглинання) в короткохвильову область. Це свідчить про збільшення доступності розчиннику поглинаючих хромофорів. Для фетального гемоглобіну збільшення доступності   розчиннику  поглинаючих хромофорів після заморожування-відтавання відбувається

при менших концентраціях солі, ніж для гемоглобіну А.

       Кількісне визначення окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів після заморожування–відтавання гемоглобінів А і F з різними концентраціями натрію хлориду показало, що після заморожування–відтавання гемоглобінів А і F в розчинах солі, які не викликають дисоціацію цих білків, збільшується вміст дезоксигемоглобінів і зменшується вміст оксигемоглобінів, а в розчинах, які приводять до дисоціації гемоглобінів А і F, підвищується вміст метгемоглобіну за рахунок зменшення кількості оксигемоглобіну. Для гемоглобіну F збільшення вмісту метформи починається при менших концентраціях натрію хлориду. Можемо зробити висновок, що фетальний гемоглобін є менш стійкий до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М і подальшого заморожування-відтавання в присутності цих концентрацій солі.

       Вплив гліцерину, 1,2-пропандіолу і поліетиленгліколю-1500 на стан гемоглобінів А і F при заморожуванні–відтаванні. За допомогою методу сольвентно-пертурбаційної спектрофотометрії досліджено вплив гліцерину, 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), поліетиленгліколю-1500 (ПЕГ-1500) на конформаційний стан HbA і HbF при заморожуванні–відтаванні.

       Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм розчинів HbA і HbF з гліцерином (порівняння з поглинанням відповідного білка в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання відповідного білка в фізіологічному розчині, від концентрації гліцерину має лінійний характер. Структура (положення “ноля” й негативних максимумів) ІПСП цих розчинів не змінюється. Це означає, що за допомогою методу сольветно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії не фіксуються зміни конформації білків при збільшенні концентрації гліцерину до 40%. Після заморожування–відтавання конформаційний стан HbA і HbF також не змінюється.

       Залежність ΔЕ/Е від концентрації 1,2-ПД для розчинів HbA і HbF з 1,2-ПД має лінійний характер     (рис. 3, 4).     Це     означає,     що     за   допомогою   методу   сольветно-пертурбаційної

диференціальної спектрофотометрії не фіксуються зміни конформації білків при збільшенні концентрації 1,2-ПД до 40%. Після заморожування-відтавання розчинів HbA з 1,2-ПД конформаційний стан білка залишився незмінним (рис.3). Для розчинів HbF з 1,2-ПД заморожування–відтавання привело до зменшення кута нахилу цієї залежності, що, можливо, свідчить про меншу доступність розчиннику хромофорів HbF в середовищі з 1,2-ПД після заморожування–відтавання (рис.4).

В   присутності   в   розчинах   гемоглобіну   ПЕГ-1500  спостерігається  агрегація білків, що

утруднює структурні дослідження. Порівняльне вивчення впливу ПЕГ-1500 на конформаційний стан HbA і HbF показало, що в присутності ПЕГ-1500 гемоглобін А більше агрегує, ніж гемоглобін F, це видно з даних по світлорозсіюванню (табл.).

       Також була досліджена температура денатурації фетального гемоглобіну в розчинах, що містять 1,2-ПД та гліцерин до й після заморожування–відтавання за допомогою адіабатичного скануючого мікрокалориметра ДАСМ-4. Для цього знімали термограми розчинів фетального гемоглобіну на фізіологічному розчині (0,15М NaCl) з добавками гліцерину або 1,2-ПД в кількості до      30      мас%.   З   одержаних   термограм    знаходили    температуру    денатурації  HbF. Після

заморожування–відтавання   й   подальшого   досліджування   методом диференціальної скануючої

Рис. 3. Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційного диференціального спектра при 286 нм розчинів HbA з 1,2-ПД (порівняння з поглинанням HbA в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання HbA в фізіологічному розчині, від концентрації 1,2-ПД: 1 – до, 2 – після заморожування-відтавання.

калориметрії одержані дані про те, що температура плавлення фетального гемоглобіну в фізіологічному розчині зменшується. При додаванні до розчину 1,2-ПД на термограмах реєструється зниження температури денатурації, в той час як при додаванні гліцерину суттєвих відмін в температурах денатурації HbF не реєструється.

       Таким чином, гліцерин не змінює конформацію HbA і HbF до і після заморожування-відтавання.   1,2-ПД   також   не  змінює конформацію HbA і HbF до заморожування-відтавання, а

після заморожування-відтавання конформаційний стан фетального гемоглобіну змінюється, в той час як гемоглобіну А залишається незмінним.

       Взаємодія фетального гемоглобіну з органічним барвником бромтимоловим синім і з ліпосомами. Одним з методів вивчення розподілу по білковій макромолекулі полярних і неполярних груп є взаємодія органічних фарбників з білками. Перед тим, як досліджувати взаємодію HbA і HbF з ліпосомами, ми вивчали доступні фарбнику гідрофобні області HbF, так як відомо, що білки взаємодіють з ліпосомами, як і з БТС, зокрема, за допомогою гідрофобних зв’язків.   Проведено   дослідження   зв’язування   фетальним   гемоглобіном органічного барвника

бромтимолового   синього.  Використовували  розчини HbA і HbF в 0,05М Na–фосфатному буфері,

Рис. 4. Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційного диференціального спектра при 286 нм розчинів HbF з 1,2-ПД (порівняння з поглинанням HbF в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання HbF в фізіологічному розчині, від концентрації 1,2-ПД: 1 – до, 2 – після заморожування-відтавання.

Таблиця

Світлорозсіювання розчинів HbA и HbF в присутності ПЕГ-1500

рН 7,2.

Зв’язування БТС гемоглобіном приводить до зменшення інтенсивності спектра поглинання при 615 нм. Визначали параметри зв’язування фарбника оксигемоглобінами А і F (число місць зв’язування органічного фарбника БТС білком та константу дисоціації комплексу білок-фарбник). Концентрація вільного БТС в  розчині  є  більшою  при  зв’язуванні  БТС гемоглобіном F, ніж гемоглобіном А. Число місць сорбції БТС гемоглобіном F виявилось менше, ніж гемоглобіном А. Константа дисоціації комплексу білок-фарбник менше для фетального гемоглобіну в порівнянні з гемоглобіном А. Це указує на більш міцне зв’язування фарбника фетальним гемоглобіном, ніж гемоглобіном А.

З літератури відомо, що в -ланцюзі фетального гемоглобіну міститься менше гідрофобних амінокислотних залишків, ніж в -ланцюзі гемоглобіну А. Але залишалось невідомим, в якому білку на поверхні менше доступних фарбнику гідрофобних центрів. Через те, що зв’язування аніонного барвника з білком при рНрІ здійснюється шляхом гідрофобних взаємодій, менше сорбування БТС на поверхні молекули HвF в порівнянні з HвA при рН 7,2 говорить про те, що доступних гідрофобних центрів на поверхні молекули фетального гемоглобіну менше, ніж на поверхні гемоглобіну А.

Відомо, що гемоглобін взаємодіє з еритроцитарними й штучними мембранами. Достатньо докладно вивчено взаємодії гемоглобіну А з модельними ліпосомальними мембранами. Раніше були зроблені спроби практичного застосування ліпосом зі зв’язаним гемоглобіном А. У відношенні фетального гемоглобіну подібні роботи практично відсутні. З наших експериментів по зв’язуванню гемоглобінами А і F бромтимолового синього стало відомо, що кількість доступних фарбнику гідрофобних областей на поверхні цих білків різна. Представляло інтерес визначити, чи є різниця між гемоглобінами А і F у зв’язуванні з ліпосомами, так як відомо, що взаємодія білків з ними здійснюється також і за допомогою гідрофобних зв’язків.

       Нами була досліджена кінетика взаємодії оксиHbA і оксиHbF з модельними ліпосомальними мембранами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну за визначенням змін інтенсивності поглинання гемоглобіну у смузі Cope (414 нм).

Характер залежності зміни інтенсивності спектра поглинання у смузі Соре від часу для оксигемоглобіну А відповідає даним літератури. Для оксигемоглобіну F не виявлено значних відмін від оксигемоглобіну А. Вважається, що взаємодія гемоглобіну з ліпідами включає адсорбцію гемоглобіну на поверхні ліпідних везикул, вбудування фрагмента білкової молекули в біслой, зміну конформації білка. Є дані про те, що комплексоутворення зумовлене електростатичною взаємодією гемоглобіну з полярними головками КЛ та ФХ, а також зв’язане з проникненням (вбудуванням) білків у внутрішню область ліпідного біслою і з гідрофобною взаємодією гемоглобіну з ліпідами. Крім того, відомо, що при взаємодії окси- і метгемоглобіну з ліпідами в модельних і природних мембранах ці форми гемоглобіну приймають участь в ініціації процесу перекисного окислення ліпідів. Індукція перекисного окислення ліпідів у модельних системах супроводжується перетворенням оксигемоглобіну в метформу.

Як нами виявлено, кількість доступних гідрофобних областей на поверхні гемоглобіну А і фетального гемоглобіну різна. Не спостерігається відміна між гемоглобінами А і F в кінетиці зв’язування з ліпосомами, яке здійснюється також і за допомогою гідрофобних взаємодій.

Заморожування-відтавання оксигемоглобінів А і F практично не вплинуло на взаємодію цих білків з ліпосомами.

Показано, що оксиHbA з меншою швидкістю вбудовується в ліпосомальні мембрани в порівнянні з метHbA. Тому нами була вивчена кінетика взаємодії метHbA і метHbF з модельними ліпосомами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну за зменшенням інтенсивності поглинання гемоглобіну у смузі Cope (405 нм).

Характер залежності зміни інтенсивності спектра поглинання метHbA у смузі Соре від часу відповідає літературним даним, для метHbF не виявлено значних відмінностей від метHbA.

Можна зробити висновок, що оксиформи фетального гемоглобіну й гемоглобіну А практично однаково взаємодіють з ліпосомами ФХ:КЛ, а також нема відмінностей у процесі утворення комплексу з ліпосомальними мембранами метформ гемоглобінів А і F. Заморожування–відтавання оксигемоглобіну А і оксигемоглобіну F практично не впливає на кінетику процесу взаємодії з ліпосомами, що вивчаються.

ВИСНОВКИ

1. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну в експериментальних дослідженнях обумовили необхідність тривалого зберігання еритроцитів і гемоглобінів кордової крові. Практично не вивчений вплив факторів низькотемпературного консервування на гемоглобін F. У зв’язку з цим в роботі було визначено, як впливає заморожування-відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.
2. Заморожування-відтавання гемоглобінів А і F приводить до зміни конформації цих білків, що показано методом ультрафіолетової спектрофотометрії, і до зміни функціонального стану гемоглобінів А і F - підвищення вмісту метгемоглобіну.
3. Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії і гель-хроматографії показано, що фетальний гемоглобін є менш стійким до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М – дисоціація цього білка починається при менших концентраціях солі у порівнянні з гемоглобіном А.
4. Методом сольвентно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії встановлено, що гліцерин і 1,2-ПД в області концентрацій 10÷40% не впливають на конформацію фетального гемоглобіну до заморожування-відтавання. В присутності 10% и 40% розчинів ПЕГ-1500 відбувається агрегація макромолекул, причому фетальний гемоглобін агрегує в меншій мірі, ніж гемоглобін А.
5. Визначено, що заморожування-відтавання в присутності 10÷40% розчинів гліцерину дозволяє зберегти конформацію гемоглобіну А і фетального гемоглобіну незмінною. Розчини 1,2-ПД концентрацією 10÷40% дозволяють зберегти незмінною конформацію гемоглобіну А при заморожуванні-відтаванні, в той час як гемоглобін F зазнає конформаційних змін.
6. Кінетика взаємодії фетального гемоглобіну з модельними ліпосомальними мембранами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну, не відрізняється від кінетики взаємодії гемоглобіну А з мембранами. Заморожування-відтавання не впливає на неї.
7. Одержані в роботі результати можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в меншій стійкості, в порівнянні з гемоглобіном А, до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Изучение влияния концентрированных растворов натрия хлорида на состояние фетального гемоглобина и гемоглобина А // Біофізичний вісник. –2001.-№2 (9).-С.64-66. (Дисертантом виконані експерименти з порівняльного вивчення впливу розчинів хлориду натрію на гемоглобіни А і F, проведена статистична обробка даних та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для дослідження, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).
2. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В. Спектральные свойства фетального гемоглобина после замораживания-оттаивания в растворах глицерина и 1,2-пропандиола // Проблемы криобиологии.-2001.-№4.-С.73-74. (Дисертантом виконані експерименти з вивчення конформації гемоглобінів А і F після заморожування-відтавання в розчинах гліцерину і 1,2-ПД, статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз диференціальних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну з кріопротекторами; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).
3. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В., Леонов Б.Н. Аутоокисление гемоглобинов А и F после замораживания-оттаивания // Проблемы криобиологии.-2002.-№4.–С.68-71.(Дисертантом виконані експерименти з вивчення впливу заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів А і F, проведена статистична обробка даних і проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Леоновим Б.М. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах).
4. Тимченко Н.Н. Влияние заморажиания-оттаивания на конформацию фетального гемоглобина и взаимодействие его с липосомами // Проблемы криобиологии. – 2003. - № 2. – С. 104-108.
5. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Сравнительное изучение влияния замораживания-оттаивания на гемоглобины А и F // Проблемы криобиологии. Тезисы докладов Всеукраинской научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины”.–2001.-№3.-С.20. (Дисертантом виконане порівняльне вивчення впливу заморожування-відтавання в розчинах, що містять різні концентрації хлориду натрію, на гемоглобіни А і F; статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для досліджень, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).
6. Онищенко Е.В., Тимченко Н.Н. Влияние низких температур, глицерина и 1,2-пропандиола на термоденатурацию фетального гемоглобина// Проблемы криобиологии. Тезисы докладов конференции молодых ученых ИПКиК НАН Украины.-2002.-№1.-С. 113-114. (Дисертантом приготовлені зразки для експериментів та оброблені і проаналізовані отримані результати; Оніщенко О.В. виконані експерименти з дослідження впливу низьких температур, гліцерину і 1,2-пропандіолу на термоденатурацію фетального гемоглобіну).
7. Морозова Т.Ф., Дюбко Т.С., Тимченко Н.Н. Температурная лабильность белковой части и гема гемоглобина человека после охлаждения до температуры -196ºС // Материалы V съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем”.-Минск, Беларусь.-2002.-С.Т-82. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконане теоретичне узагальнення експериментального матеріалу; Дюбко Т.С. виконано розрахунок вмісту різних форм гемоглобіну в розчині і аналіз перших похідних спектрів поглинання гемоглобіну).
8. Morozova T.F., Rozanova E.D., Dyubko T.S., Timchenko N.N. Low temperature influence on donor blood hemoglobin // 14th Meeting of the European Association for Red Cell Research. – Roskoff, France. – 2003. – P. 8. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Розановою К.Д, виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчині; Дюбко Т.С. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну).

АНОТАЦІЇ

       Тимченко Н.М. Вплив температури та складу середовища на фетальний гемоглобін і гемоглобін донорської крові. – Рукопис.

       Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

       Дисертація присвячена дослідженню впливу температури, розчинів солей, кріопротекторів на гемоглобін А і фетальний гемоглобін, а також вивченню взаємодії цих білків з модельними ліпосомальними мембранами. Методом спектрофотометрії було показано, що заморожування-відтавання приводить до збільшення вмісту метформ гемоглобінів. Розчини солей приводять до розпаду гемоглобіну F на димери при менших концентраціях солей, ніж для гемоглобіну А. При низькомпературному впливі на гемоглобіни А і F 1,2-пропандіол змінює конформацію фетального гемоглобіну і не впливає на гемоглобін А. Виявлено, що заморожування-відтавання оксигемоглобінів А і F не впливає на кінетику взаємодії з ліпосомальними мембранами, сформованими з кардіоліпіну та фосфатидилхоліну.

Ключові слова: гемоглобіни А і F, конформаційний стан, диференціальна УФ-спектрофотометрія, кріопротектори, ліпосоми, заморожування-відтавання.

Тимченко Н.Н. Влияние температуры и состава среды на фетальный гемоглобин и гемоглобин донорской крови. – Рукопись.

       Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

       Диссертация посвящена исследованию влияния температуры, растворов солей, криопротекторов на гемоглобин А и фетальный гемоглобин, а также изучению взаимодействия этих белков с модельными липосомальными мембранами. Методом спектрофотометрии было показано, что замораживание-оттаивание приводит к конформационным изменениям в молекулах гемоглобинов А и F и к увеличению содержания метформ гемоглобинов. Растворы солей приводят к распаду гемоглобина F на димеры при меньших концентрациях солей, чем для гемоглобина А. При изучении влияния криопротекторов на состояние гемоглобина А и фетального гемоглобина методом спектрофотометрии обнаружено, что глицерин не изменяет конформацию фетального гемоглобина ни до, ни после замораживания-оттаивания. 1,2-пропандиол до замораживания-оттаивания не изменяет конформацию гемоглобина А и фетального гемоглобина; после замораживания-оттаивания в случае гемоглобина А конформационное состояние остается прежним, а для фетального гемоглобина среда с этим криопротектором оказывает действие таким образом, что хромофоры молекулы становятся меньше доступны растворителю по сравнению с доступностью растворителю до замораживания-оттаивания. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии обнаружено, что после замораживания-оттаивания температура плавления фетального гемоглобина в присутствии глицерина изменяется, а при наличии в растворе 1,2-пропандиола происходит уменьшение температур плавления. Определено, что замораживание-оттаивание оксигемоглобинов А и F не влияет на кинетику взаимодействия с липосомальными мембранами, сформированными из кардиолипина и фосфатидилхолина.

Ключевые слова: гемоглобины А и F, конформационное состояние, дифференциальная УФ-спектрофотометрия, криопротекторы, липосомы, замораживание-оттаивание.