|
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА
ГОНЧАРУК Оксана Петрівна
УДК 636.4:591.391.2
ВПЛИВ РІЗНИХ КУЛЬТУРАЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ НА МЕЙОТИЧНЕ ДОЗРІВАННЯ ООЦИТ-КУМУЛЮСНИХ КОМПЛЕКСІВ СВИНОМАТОК З НАСТУПНИМ ЇХ ЗАПЛІДНЕННЯМ IN VITRO
03.00.20 - біотехнологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
ХАРКІВ– 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук
Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ГУЗЕВАТИЙ Олег Євгенович, Українська академія аграрних наук (м. Київ), завідувач Сектора агробіотехнології
Офіційні опоненти:
доктор сільськогосподарських наук, доцент ШЕРЕМЕТА Віктор Іванович, Національний аграрний університет (м. Київ), завідувач кафедри генетики тварин та біотехнології
кандидат біологічних наук, доцент ТКАЧЕНКО Сергій Васильович, Білоцерківський державний аграрний університет, вчений секретар
Провідна установа:
Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, м. Львів
Захист дисертації відбудеться "___" _______2001 року о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі
Автореферат розісланий "____" ________ 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Проніна В.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В свинарстві, як і в інших галузях тваринництва, в умовах інтенсифікації та індустріалізації галузі ведеться пошук нових ефективних методів створення, розведення і збереження цінних в генетичному відношенні тварин. Сучасний рівень розвитку біотехнології відкрив привабливі можливості розробки оригінальних шляхів отримання племінних особин. Визнаним шляхом прискорення селекційного процесу є метод трансплантації ембріонів (Квасницкий А.В. и др., 1988; Ruane J., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989; Яблонский В.А., 1989; Seidel G., 1991; Бугров А.Д., 1995, 1997; Мартиненко Н.А. та ін., 1995, 1998; Осташко Ф.І., 1995; Шаловило С.Г., 1996; Шеремета В.І., 1997, 1999). Найскладнішою і ключовою ланкою при використанні біотехнологічних методів у свинарстві є отримання необхідної кількості повноцінних ембріонів на різних стадіях їх розвитку. При традиційних способах відтворення з всього величезного фонду яйцеклітин свиноматок (в яєчниках знаходяться десятки тисяч ооцитів) використовується лише мінімальна частина загального запасу, а переважна більшість клітин залишається в яєчниках, підлягає атрезії і у відтворенні участі не бере. Розробка і вирішення проблеми дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів, запліднення in vitro яйцеклітин та раннього ембріонального розвитку дозволить не тільки отримувати необхідну кількість зародків свиней, а й в більш повній мірі використовувати потенційний запас гамет самиць, що закладений в яєчниках. Безумовно, що вже на сучасному етапі технологія in vitro отримання зародків інтенсивно використовується як дешеве й зручне джерело ембріонів для одержання клонованих і трансгенних сільськогосподарських тварин (Безуглий М.Д., 1995; Wilmut J. et al., 1997; Зубець М.В. та ін., 1997, 1999). Однак, отримання біологічно повноцінних ембріонів свиноматок методом запліднення in vitro дозрілих поза організмом яйцеклітин поки що, на жаль, є винятком, а ніж правилом, тому метод потребує вдосконалення (Yoshida M.et al., 1993; Nagai T. et al.,1994; Abeydeera L.R. et al., 1998, 1999).
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася у лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин Інституту розведення і генетики тварин УААН як складова наукової теми: "Розробити методи культивування ооцитів сільськогосподарських тварин, умови для заморожування ооцитів корів і створити ооцито-та ембріобанк великої рогатої худоби" (номер державної реєстрації 0196 UO 16325).
Мета і завдання досліджень. Метою досліджень була розробка оптимальних варіантів отримання біологічно повноцінних, придатних до запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок. Відповідно до мети визначалися наступні завдання:
- Дослідити залежність кількості і якості ооцит-кумулюсних комплексів, результатів їх культивування in vitro від способу отримання гамет самиць з яєчників свиноматок.
2. З'ясувати строки мейотичного дозрівання до метафази-2 ооцит-кумулюсних
комплексів свиноматок та динаміку зміни фаз мейозу при їх культивуванні.
3. Встановити ефективність використання різних поживних середовищ для
дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок.
4. Вивчити ефект використання клітин гранульози у поживному середовищі на етапі дозрівання поза організмом гамет свиноматок.
- Оцінити повноцінність дозрівання яйцеклітин свиноматок в різних поживних середовищах шляхом їх запліднення in vitro.
Об’єкт дослідження: яєчники, ооцит-кумулюсні комплекси і яйцеклітини свиноматок, ембріони свиней, що були отримані in vitro.
Предмет дослідження: ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцит-кумулюсних компплексів свиноматок у різних культуральних середовищах, розвиток зигот свиней після запліднення in vitro.
При виконанні роботи використовували біотехнологічні (дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів, запліднення in vitro яйцеклітин, культивування зигот і зародків), морфологічні (оцінка яєчників, ооцитів, яйцеклітин, сперматозоїдів та ембріонів за морфологічними показниками) і цитогенетичні (аналіз мейотичного дозрівання гамет самиць та дроблення зародків) методи досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. Проведений порівняльний аналіз використання різних поживних середовищ при дозріванні і заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок. Визначені терміни культивування, що необхідні ооцит-кумулюсним комплексам свиноматок для дозрівання поза організмом до різних стадій мейозу. Встановлені особливості мейотичного дозрівання гамет свиноматок у культуральному середовищі поповненому клітинами гранульози. Виявлена залежність кількості і якості ооцитів свиноматок від способу отримання їх з яєчників забитих тварин. Встановлений позитивний вплив використання змішаної сперми від різних кнурів при заплідненні in vitro яйцеклітин свиноматок.
Практичне значення одержаних результатів. Дослідження виявили можливість дозрівання поза організмом в різних поживних середовищах ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок з наступним їх заплідненням in vitro і отриманням ембріонів. Результати динаміки дозрівання гамет свиноматок дозволяють визначати стан хромосомного апарату клітин в любий проміжок часу культивування. Одержані результати мають цінність для поглиблення знання механізму і строків дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок і можуть бути використані в роботі біотехнологічних центрів і лабораторій, що займаються питаннями культивування і запліднення in vitro ооцитів ссавців.
Особистий внесок здобувача. Експериментальна робота, аналіз літератури, інтерпритація одержаних результатів, їх статистична обробка виконані автором особисто. Вибір напрямку та опрацювання методики досліджень проведені разом з науковим керівником. Із спільних досліджень використано свою частину роботи.
Апробація результатів дисертації. Одержані в експериментах наукові матеріали доповідалися і обговорювалися на щорічних засіданнях лабораторії генофонду порід сільськогосподарських тварин і аспірантських сесіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (1995-1998 рр.), на конференціях: "Региональная конференция молодых ученых и специалистов".- Оренбург, 1997; "Интенсификация производства продукции животноводства в Республике Беларусь".-Жодино, 1998; Международной конференции молодых ученых "Творческое развитие научного наследия академика М.Ф.Иванова".- Аскания Нова, 1998; Третьей международной конференции “Актуальные проблемы биологии в животноводстве”.- Боровск, 2000.
Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 9 друкованих працях.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту, включає 16 таблиць та 17 рисунків. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалу і методики досліджень, результатів досліджень і їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Список літературних джерел включає 307 найменувань, в тому числі 161 іноземних авторів.
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Досліди проводили на фолікулярних ооцитах, одержаних з яєчників свиноматок порід велика біла, українська степова біла і ландрас. Загальна схема досліджень наведена на рис.1. Яєчники в лабораторію привозили не пізніше 1,5-2,5 годин після забою тварин у термосі з фізіологічним розчином (0,9% NaCl) та антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину) при температурі 32-380С. В лабораторії яєчники двічі промивали свіжоприготовленим фізіологічним розчином. Ооцити отримували з яєчників двома шляхами: пункцією антральних фолікулів або надрізаючи лезом видимі антральні фолікули. Вимивали середовищем Дюльбекко з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") і антибіотиками, виловлювали пастерівською пипеткою та оцінювали за морфологічними ознаками під контролем мікроскопу МБС-9. Для культивування використовували ооцити з щільним або частково розпушеним кумулюсом, гомогенною та тонкозернистою ооплазмою.
Процедуру дозрівання проводили в чотирьохлункових планшетах ("Costor") протягом 45 годин у накритих вазеліновим маслом краплях поживного середовища з 10% попередньо інактивованої (560С, 30 хв.) фетальної сироватки корів ("Sera Lab."), 50 мкг/мл гентаміцину ("Reanal") з додатками гормональних [2,5 мкг/мл фолікулостимулюючого гормону ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадіолу ("Serva"), 2,5 МОд/мл лютеінизуючого гормону ("Serva")] та енергетичних [2,0 мМ пірувату натрію ("Sigma") і 2,92 мМ лактату кальцію ("Sigma")] компонентів об'ємом 200 мкл на 20 клітин при температурі 38,50С та 5% CO2 у повітрі. В експериментах використовували 4 типи поживних середовищ: DMEM ("Sigma", кат. N D5648), M-199 ("Sigma", кат. N M2520), DME/Ham-F-12 ("Sigma", кат. N D8900), Ham-F-10 ("Sigma", кат. N N1387).
Гранульозу отримували з рідини фолікулів діаметром 2-5 мм. Фолікулярну рідину уміщували в центрифужні пробірки з культуральним середовищем, двічі центрифугували (3000 об/хв, 10 хв), кількість клітин гранульози визначали шляхом підрахування їх в гематоцитометрі, оцінку життєздатності перед постановкою на культивування проводили за допомогою вітального барвника – 0,4% трипанового
синього ("Serva").
Для запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок використовували свіжоотриману сперму кнурів породи велика біла. Підготовку сперми до запліднення проводили за схемою, що запропонували Nagai T. et al. (1988).
Капацитацію сперматозоїдів здійснювали гепарином (100 од/мл) за методикою Parrish J.J. et al. (1988). Спільне інкубування яйцеклітин і сперматозоїдів проводили в термостаті при температурі 38,50С, 5% СО2 у повітрі, в краплях середовища Fert.-TALP. Після 10-18 годин спільного інкубування яйцеклітини і зиготи відмивали від прилиплої сперми і переносили в краплі середовища СDM для подальшого культивування протягом 72 годин.
На різних етапах культивування проводили цитогенетичний аналіз ооцитів і ембріонів. Цитогенетичні препарати готували за методом Tarkowski A.K. (1966) або Ushijima M. et al. (1988), забарвлювали 10% розчином Гімза ("Fluka") і досліджували під мікроскопом.
Вірогідність результатів досліджень обраховували за допомогою використання критеріїв Ст’юдента та Пірсона – “Хі-квадрат” (Плохінський М.О., 1969; Лакін Г.Ф., 1990)
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ
Дослідження деяких морфологічних параметрів яєчників свиноматок, різних способів отримання з них ооцитів. Сучасні методи біотехнології, такі, як трансплантація ембріонів, їх клонування та кріоконсервація, визначення статі зародків, отримання трансгенних ембріонів, дають змогу значно прискорити процес відтворення і зберегти цінний генетичний матеріал сільськогосподарських тварин, у тому числі й свиней. З'ясування певних закономірностей й розробка надійних методів прижиттєвої оцінки яєчників, фолікулів та ооцитів дозволить підвищити ефективність робіт з одержання ембріонів в умовах in vitro.
Проведеним аналізом п'яти морфологічних параметрів яєчників свиноматок (табл.1) та кількісного і якісного складу ооцитів, отриманих з яєчників свиноматок різними методами (табл.2) встановлено, що немає статистично вірогідної різниці (Р>0,05) між лівими і правими яєчниками свиноматок за такими показниками: довжина (32,8±5,3 проти 32,1±5,2 мм), ширина (23,6±4,5 проти 22,8±4,5 мм), товщина (16,6±3,6 проти 15,4±3,8 мм), об'єм (5,9±2,5 проти 6,3±2,8 мл), маса (6,5±2,8 проти 6,5±2,9 г). Також виявлено, що немає статистично вірогідної різниці за загальною кількістю ооцитів та за кількістю морфологічно нормальних клітин придатних для культивування (68,4% і 45,4% від загальної кількості, отриманих з лівих яєчників відповідно пункцією та надрізом антральних фолікулів проти 67,7% і 48,3% - з правих). Однак, незважаючи на те, що метод пункції антральних фолікулів дозволяє отримувати вірогідно більше (Р<0,01) в процентному відношенні морфологічно якісних, придатних для культивування ооцит-кумулюсних комплексів (67,7-68,4%) порівняно з іншим методом отримання (45,4-48,3%), все ж таки метод
Таблиця 1
Морфологічні параметри яєчників свиноматок
Таблиця 2
Кількісний і якісний склад ооцитів, отриманих з яєчників свиноматок
a:b; c:d – P < 0,001
отримання ооцитів свиноматок шляхом надрізу антральних фолікулів більш перспективний на наш погляд, тому що дозволяє отримувати вірогідно більшу (Р<0,001) загальну кількість ооцитів з яєчника (73,1-76,4 проти 17,7-19,8) та кількість ооцит-кумулюсних комплексів придатних для культивування (33,2-36,9 проти 12,1-13,4).
Використання різних поживних середовищ при культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. В значній мірі життєздатність ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок при їх культивуванні in vitro залежить від ефективного підбору культурального середовища. Різноманітні штучні поживні середовища, які вчені мають в своєму розпорядженні й використовують в своїх дослідах, не змодельовані відповідно з in vivo умовами розвитку яйцеклітин, тому в клітинах відбуваються значні зміни в процесі їх дозрівання in vitro. Сучасні методи культивування ооцит-кумулюсних комплексів сільськогосподарських тварин, в тому числі й свиноматок, передбачають використання дуже широкого спектру поживних середовищ: Menezo, SOF, M-199, RPMI, BWW та інших (Funahashi H., Day B., 1993; Nagai T., Takahashi M., 1996).
В своїх експериментах з культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок використовували 4-и типи поживних середовищ: DMEM, M-199, Ham-F-10, DME/Ham-F-12. Аналіз результатів досліджень, як свідчать дані таблиці 3,
Таблиця 3
Дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок
у різних поживних середовищах
a:b, e:f– P< 0,05; a:c, d:f– P<0,001
виявив різний рівень дозрівання до метафази-2 мейозу ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок у поживних середовищах М-199, Ham-F-10, DME/Ham-F-12 і DMEM (відповідно 66,1; 60,3; 56,2 і 43,8%). Крім того, при культивуванні гамет свиноматок у середовищах М-199 і Ham-F-10 спостерігали меншу кількість клітин з дегенерацією хромосомного матеріалу порівняно з середовищами DME/Ham-F-12 та DMEM (відповідно 14,3 і 12,1% проти 23,3 і 29,7%).
Динаміка дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Одним з важливих моментів при проведенні експериментів з запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок є точне знання строків їх дозрівання до метафази-2 мейозу. Перезрівання клітин, рівно як і недозрівання, значно зменшує їх здатність до запліднення. На тривалість мейотичного дозрівання може впливати наявність у культуральному середовищі гормональних і енергетичних компонентів, сироватки та різних біологічно активних речовин і сполучень, їх концентрація та строк контакту з клітинами, що в кінцевому рахунку прискорює або заповільнює процес дозрівання. В зв’язку з цим виникає необхідність встановлення строків дозрівання гамет свиноматок, динаміки цього процесу у кожному конкретному випадку (експериментальному варіанті) на фоні контролю. В своїх дослідженнях ми вивчали динаміку зміни стадій мейозу ооцит-кумулюсними комплексами свиноматок через кожні 3 години при їх культивуванні у середовищі М-199 протягом 51 години (табл.4).
В ооцитах, що були отримані з яєчників свиноматок та оцінені за морфологічними ознаками (0 годин культивування), переважна більшість ядер (83,3%) знаходяться на диплотені мейозу. В міру їх культивування через 30 годин всі клітини поновлювали мейотичне дозрівання, яке, як відомо, у ссавців блокується на стадії диплотени. За результатами наших даних можливо визначати термін культивування, що необхідний гаметам свиноматок для дозрівання в цих умовах до тієї чи іншої стадії мейозу. Так, через 30 годин культивування 68,2% клітин знаходяться на стадіях діакінез і метафаза-1. При подальшому збільшенні терміну культивування гамет свиноматок кількість клітин на стадіях діакінез і метафаза-1 починає зменшуватись за рахунок переходу ядер клітин в наступні стадії мейозу -–анафазу і телофазу. Через 42-45 годин культивування більшість клітин (відповідно 58,3 і 62,1%) завершує своє дозрівання і знаходяться на метафазі-2 мейозу. Подальше збільшення терміну культивування до 51 години не призводить до збільшення кількості дозрілих до метафази-2 яйцеклітин, але значно збільшується на заключних етапах дозрівання кількість клітин з порушеннями хромосомного матеріалу (27,3 і 35,3 проти 20,7% відповідно після 48, 51 і 45 годин культивування), мабуть за рахунок перезрівання яйцеклітин.
Таким чином, нами встановлено, що для проведення дослідів з запліднення in vitro яйцеклітин свиноматок необхідно попереднє культивування ооцит-кумулюсних комплексів протягом 42-45 годин, коли переважна більшість клітин знаходиться на стадіях телофази і метафази-2 мейозу, так як в подальшому спостерігається “старіння” (перезрівання) яйцеклітин і їх загибель.
Таблиця 4
Динаміка дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок
a : b – P < 0,05
Спільне культивування ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок і клітин гранульози. В багатьох лабораторіях світу клітини гранульози використовують для подолання блоку дроблення при культивуванні передімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин. Встановлено, що додавання до культурального середовища гранульозних клітин позитивно впливає на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів, однак спільне культивування ооцитів корів з клітинами гранульози часто супроводжується збільшенням кількості гамет з дегенерованими хромосомами. Причиною цього явища може бути порушення гормонального балансу, тому що метод культивування не дає можливості враховувати кількість гранульозних клітин, що оточують ооцит, які як і ті, що додають до культурального середовища є продуцентами стероїдних гормонів (Кузьмина Т.И., 1993; Позднякова Т.Э., 1994).
Дані наших дослідів з вивчення впливу додавання у культуральне середовище М-199 клітин гранульози на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок наведені в таблиці 5.
Нами виявлено незначне заповільнення мейотичного дозрівання клітин до метафази-2 після 44-х годинного культивування (39/74, 52,7% і 37/56, 66,1% відповідно в дослідній і контрольній групах). Збільшення терміну культивування до 48-и годин призводить до збільшення кількості дозрілих яйцеклітин (25/37, 67,6%) в дослідній групі і зменшення кількості клітин з хромосомними порушеннями (4/37, 10,8% проти 11/56, 19,6% в контрольній групі).
Таблиця 5
Вплив клітин гранульози на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок
a:b, c:d- P<0,001
Таким чином, результати експериментів свідчать, що культивування ооцит-кумулюсних комплексів в середовищі М-199, поповненому клітинами гранульози, забезпечує більш оптимальні умови для дозрівання гамет свиноматок.
В наступних наших дослідах використовували різні концентрації клітин гранульози в культуральному середовищі для вивчення характеру їх впливу на мейотичне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок. Дані наведені в таблиці 6.
При культивуванні ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок в середовищі М-199 поповненому клітинами гранульози в концентрації 1х106 клітин/мл і 3х106 клітин/мл (групи А і Б) протягом 48 годин стадії метафази-2 мейозу досягали відповідно 25/37, 67,6% і 47/62, 75,8% клітин. Кількість клітин з дегенерацією хромосомного матеріалу в цих експериментальних групах становила відповідно 4/37, 10,8% і 7/62, 11,3%.
Збільшення концентрації гранульозних клітин у середовищі М-199 до 6х106 клітин/мл і 9х106 клітин/мл (групи В і Г) призвело до того, що завершили мейотичне дозрівання відповідно лише 36/69, 52,2% і 27/56, 48,2% клітин, в той час як значно збільшилась кількість клітин (відповідно 19/69, 27,5% і 18/56, 32,1%) з хромосомними порушеннями порівняно з групами А і Б.
Таблиця 6
Використання різних концентрацій клітин гранульози у середовищі М-199 для дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів свиноматок
|
