|
Харківський національний університет
ім. В.Н.Каразіна
КАВОК НАТАЛІЯ СЕРГІЇВНА
УДК 577.175.44+577.125
Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів
на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н.Карабіна Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук
Бабенко Наталія Олексіївна,
Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна,
завідувач відділу фізіології онтогенезу НДІ біології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Каліман Павло Авксентійович,
Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна,
завідувач кафедри біохімії;
доктор біологічних наук
Бондаренко Тетяна Петрівна,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії та фармакології
нейрогуморальних систем.
Провідна установа: Інститут геронтології АМН України
(лабораторія регуляції метаболізму,
сектор біології старіння), м. Київ.
Захист відбудеться “17” квітня 2002 р. о 15 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету
ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий “05” березня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Уявлення про функціональну роль ліпідів як структурних компонентів біомембран суттєво змінилося за відносно короткий проміжок часу (останні 10-15 років). На цей час більшість дослідників розглядають ліпіди як попередники біоактивних молекул, що утворюються при стимуляції рецепторів клітинної поверхні та функціонують в якості вторинних месенджерів [Liscovitch, Cantley, 1994; Divecha, Irvine, 1995; Topham, Prescott, 1999].
Відомо, що гормони щитовидної залози мають виражений ліпотропний ефект і регулюють різні ланки ліпідного обміну [Hulbert, 2000]. Однак дані щодо участі ліпідних вторинних месенджерів у реалізації ефектів тиреоїдних гормонів на клітини – мішені практично відсутні.
Дія тиреоїдних гормонів переважно опосередкована ядерними рецепторами [Чин, Йен, 2000]. Однак на цей час виявлений цілий ряд негеномних ефектів йодотиронинів, які знайдені на рівні плазматичної мембрани та різних субклітинних структур. До них належать: посилення транспорту іонів (Ca2+, Na+), глюкози, модуляція активності деяких протеїнкіназ, регуляція полімеризації актина [Davis, Davis, 1996]. Є докази наявності специфічних сайтів, які зв'язують тироксин і трийодотиронін на поверхні плазматичних мембран клітин-мішеней [Кахарова, 1991]. Вважають, що мембранна рецепція відіграє важливу роль у транспортуванні та обміні тиреоїдних гормонів, а також у реалізації їх швидких ефектів [Lin et al, 1999; Дейвис, Дейвис, 2000].
Незважаючи на те, що деякі ефекти тироксину на обмін ліпідів виявляються при безпосередній дії на клітини печінки та на субклітинні структури, до цього часу є лише непрямі докази активації при цьому у клітинах фосфоліпаз С (ФЛС) і Д (ФЛД), а також участі в реалізації дії тиреоїдних гормонів ліпідних вторинних месенджерів, таких як діацилгліцерол (ДАГ) і фосфатидна кислота (ФК) [Бабенко и др., 1991; Бабенко, Кавок, 1995; Красильникова, Бабенко , 1996]. Це питання практично не вивчене у віковому аспекті. Разом з тим відомо, що зміна чутливості клітин до регуляторного впливу в старості може бути пов'язана з перебудовами ліпідного складу мембран [Кульчицький та ін., 2001] та зі зрушеннями на початкових етапах сигнальної трансдукції, зокрема, з порушенням процесу генерації вторинних посередників [Serra et al, 1996].
З'ясування питання відносно участі тиреоїдних гормонів у регуляції утворення ліпідних месенджерів ДАГ і ФК в клітинах печінки дасть змогу виявити нові сторони в молекулярному механізмі дії йодотиронінів, а також сприятиме більш глибокому розумінню причин, які призводять до змін у характері клітинної відповіді на гормональний сигнал при старінні.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках комплексних НДР держбюджетних тем відділу фізіології онтогенезу НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна: “Дослідження закономірностей проходження гормонального сигналу до тканин-цілей при моделюванні несприятливих факторів довкілля” (шифр 11-16-97, № ДР 0197U008189), “Вікові особливості розвитку порушень функції залоз внутрішньої секреції і реалізації гормонального сигналу в тканинах-цілях” (шифр 11-16-00, № ДР 0100U003318), яка входила до координаційного плану №16 Міністерства освіти і науки України.
Мета і задачі дослідження. Робота присвячена з'ясуванню вікових особливостей метаболізму гліцероліпідів печінки на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів. У відповідності з метою були поставлені такі задачі:
1. Вивчити динаміку ліпідних перетворень у клітинах печінки на ранньому етапі дії тиреоїдних гормонів на організм тварин різного віку.
2. Вивчити динаміку, шляхи та джерела утворення ДАГ при активації клітин печінки щурів тиреоїдними гормонами.
3. Виявити закономірності вікових змін у регуляції тиреоїдними гормонами утворення ДАГ у клітинах печінки.
Об'єкт дослідження. Молекулярні механізми дії тиреоїдних гормонів.
Предмет дослідження. Динаміка та характер перебудов ліпідів печінки щурів різного віку на ранніх етапах дії тиреоїдних гормонів.
Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що короткочасна дія L-тироксину на організм щурів супроводжується значними перебудовами вмісту ліпідів печінки, причому, характер індукованих гормоном змін ліпідного спектру клітин печінки залежить від віку тварин.
Встановлено, що під впливом L-тироксину в клітинах печінки 3-місячних щурів відбувається накопичення ліпідних вторинних месенджерів –ДАГ. Процес накопичення ДАГ має двофазний характер, а фосфоліпідними попередниками ДАГ, утвореного при дії L-тироксину на клітини, можуть бути фосфатидилетаноламін (ФЕА) і фосфатидилхолін (ФХ). Ефект гормону на акумуляцію ліпідних вторинних месенджерів є швидким, короткотерміновим, специфічним і дозозалежним. Встановлено, що в процес залучена ФЛД. Відсутність подібного ефекту L-тироксину в клітинах печінки старих, 24-місячних щурів, відображує, ймовірно, вікові порушення у механізмах передачі сигналу і є однією з причин зниження чутливості клітин до дії тиреоїдних гормонів в старості.
Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Робота має значення для фундаментальних досліджень ролі ліпідів у реалізації дії регуляторних сигналів.
Отримані дані про утворення під впливом тироксину ліпідних вторинних посередників-ДАГ дозволяють глибше зрозуміти молекулярний механізм короткочасних ефектів гормонів щитовидної залози в клітинах-мішенях.
Виявлені у роботі вікові особливості реакції клітин печінки на короткотермінові впливи тиреоїдних гормонів розвивають уявлення про важливу роль початкових етапів сигнальної трансдукції у формуванні адекватної клітинної відповіді. Враховуючи, що тиреоїдні гормони активують метаболізм сигнальних ліпідів в клітинах печінки та здатні швидко модулювати дію певних агоністів (наприклад, агоністів a1-адренорецепторів) [Daza et al, 1998] або інтерферону-гамма [Lin et al., 1999], отримані в роботі дані важливо враховувати при застосуванні тиреоїдних гормонів у клініці при їх сумісному призначенні з іншими гормонами та біоактивними сполуками.
Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, вибір об'єкту та методів дослідження проведено спільно з науковим керівником. Автор самостійно провів аналіз наукової літератури за даною проблемою. Експериментальні дослідження проведені автором самостійно на базі НДІ біології ХНУ, а також у співпраці з співробітниками Харківського державного медичного університету та Інституту цитології і генетики СВ РАН (м. Новосибірськ, Росія). Інтерпретація отриманих даних проведена спільно з науковим керівником.
Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 1994), міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996), конференції молодих учених біологічного факультету і науково-дослідного інституту біології (Харків, 1996), 2-му Європейському конгресі з біогеронтології “From molecules to humans” (Saint Petersburg, Russia, 2000).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт (5 статей і 8 тез).
Обсяг та структура дисертації. Матеріали викладено на 138 сторінках друкованого тексту і містять: вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, заключення, висновки, список використаних джерел.
Матеріали дисертації проілюстровано 17 рисунками і 16 таблицями. Список літератури складається з 275 джерел.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В експериментах використовували 3- і 24-місячних щурів-самців інтактних та яким було введено тироксин (200 мкг/100 г ваги) за 15, 30, 60, 120 хвилин до забою; контролем у цьому випадку були тварини, яким вводили у відповідній кількості фізіологічний розчин. Пригнічення функції щитовидної залози в окремих експериментах визивали внутрішньо-черевинним введенням 1 мг 1-метил-2-меркаптоімідазолу (мерказолілу) на 100 г ваги тварині (протягом 16 днів). При вивченні дії тироксину в умовах in vitro вміст гормону в середовищі інкубації становив від 0,1 нМ до 1,0 мкМ , контрольні проби інкубували в присутності розчинника тироксину – NaOH у відповідних концентраціях.
Печінку наркотизованих діетиловим ефіром тварин перфузували 0,9%-вим розчином NaCl, суспензію тканини отримували продавленням печінки через перфоровану платівку з діаметром отворів 0,3 мм. В експериментах з перфузованою печінкою за основу була взята модель, запропонована Hummerich and Soboll (1989). Гепатоцити виділяли за методом Hoek et al., (1987) та Канаевой и др. (1975). Нативність клітин оцінювали за допомогою трипанового синього. Кількість життєдіяльних клітин становила 90-95% від їх загальної кількості.
Включення мітки до ліпідів печінки щурів здійснювали шляхом внутрішньо-черевинного введення [14С]СН3СООNa згідно зі схемою, яка була розроблена Кейтсом (1975). Преінкубацію суспензії тканини печінки [14С]олеїновою кислотою протягом 90 хвилин проводили, як описано нижче, в умовах, використаних для мічення ліпідів гепатоцитів. У окремих експериментах [U-14С]глюкозу, [14С]олеїнову кислоту або гліцеролтри–(9,10(n)-[3Н]олеат) додавали до середовища інкубації суспензії тканини печінки безпосередньо перед внесенням тироксину в кількості 2 мкКі/мл, 0,2 мкКі/мл, 0,1 мкКі/мл, відповідно.
Свіжовиділені гепатоцити мітили шляхом інкубації клітин (107 клітин у 1 мл) протягом 90 хвилин або 3 годин у середовищі Ігла, рН 7,5, яке містило [14C] олеїнову кислоту (1 мкКі/мл), 25 мМ Hepes, 200 мМ глутамін, пеніцилін (61 мг/л), стрептоміцин (100 мг/л), 10% ембріональну бичачу сироватку, при 37 0С в атмосфері О2(95%) – СО2(5%). В окремих випадках використовували [3H]пальмітинову або [14C]лінолеву кислоти (5 мкКі/мл). При введенні мітки до складу ліпідів гепатоцитів в умовах тривалої інкубації (24 години) до середовища інкубації, яке містило [14С]пальмітинову кислоту (6,0 мкКі/мл) або [14С]олеїнову кислоту (2,5 мкКі/мл) додатково вносили дексаметазон (4 мг/мл), інсулін (20 од/л), гентаміцин (13 мг/мл). Концентрація гепатоцитів у цьому випадку складала 3 х 106 клітин на 1 мл. Інкубацію проводили при 37 0С в атмосфері повітря (95%) – СО2(5%).
Після включення мітки гепатоцити витримували в середовищі без ембріональної сироватки протягом 1 год., потім клітини відмивали буфером Кребс-Хенселейта, рН 7,4, який містив 20 мМ Hepes, 2 мМ CaCl2, 0,2%-вий альбумін сироватки бика і розводили перед початком експерименту в тому ж буфері до концентрації 3х106 клітин на 1 мл.
Про активацію фосфоліпази Д у клітинах печінки судили по утворенню фосфатидилетанолу, за реакцією трансфосфатидилювання етанолу [Billah, Anthes, 1990; Kumada et al., 1993]. До складу інкубаційної суміші входили відповідно до умов експерименту такі компоненти: 300 мМ етанол, 1 мМ неоміцин, 300мкМ пропранолол, 50мкМ Н7, 20 мкМ ТМВ-8, які вносили за 15 хвилин перед додаванням L-тироксину або його розчинника. Концентрація L-тироксину в інкубаційній суміші становила від 0,1 нМ до 1,0 мкМ. Реакцію зупиняли додаванням охолодженого метанолу.
Ліпіди з клітин і суспензії тканини печінки екстрагували за методом Bligh, Dyer (1959). Розділення ліпідів на фракції проводили методом тонкошарової хроматографії в шарі силікагелю Woelm в системах розчинників: гексан-диетиловий ефір-оцтова кислота (73:25:2, за об'ємом) для діацилгліцеролів, триацилгліцеролу, жирних кислот, холестеролу, фосфоліпідів; хлороформ-метанол-оцтова кислота-вода (25:15:4:2, за об'ємом) для фосфатидилхоліну, сфінгомієліну, фосфатидилінозиту, фосфатидилетаноламіну; етилацетат-ізооктан-оцтова кислота-вода (130:20:30:100, за об'ємом) для фосфатидилетанолу. Ліпіди проявляли в парах йоду. Радіоактивність мічених ліпідів визначали в сцинтиляторі ЖС-8 за допомогою лічильника радіоактивності БЕТА. Кількісний вміст ліпідів визначали за методом March, Weinstein (1966).
Активність протеїнкінази С (ПКС) вимірювали після часткового очищення ферменту хроматографією на DEAE целюлозі і визначали за перенесенням 32Р з [?-32Р] АТР на гістон H1 у присутності фосфатидилсерину та іонів Са2+ (0,2 мМ) (Kikawa et al., 1982; Сидоркина и др. 1988). Активність ферменту виражали в пмоль фосфату, перенесеного з [?-32Р ] АТР на гістон НІ за 1 хвилину. Вміст білка визначали за методами Bradford (1976) або Lowry et al. (1951). Обробку експериментальних даних виконували за допомогою методів варіаційної статистики [Урбах, 1964].
У роботі використовували [?-32Р] АТР, питома активність >1000 Кі/ммоль; натрій оцтовокислий – 114С (10–50 мКі/ммоль) (ВПО “Изотоп”); тритон Х-100, сахарозу, EGTA, Hepes, трипановий синій (“Sevra”, Німеччина); 8-(диетиламіно)октил 3,4,5-триметоксибензоат (ТМВ-8); EDTA, фенілметилсульфонілфторид (PNSF) (“Fluka”, Швейцарія); неоміцин, пропранолол, 1-(5-ізокуінолінсульфоніл)-2-метилпиперазин (H7) (“Sigma”, США); АТР (динатрієва сіль); L-тироксин (“Reanal”, Угорщина); фосфоцелюлозний папір Р-81, DEAE-целюлозу DE-52 (“Whatman”, Великобританія); силікагель (“Woelm”, Німеччина); [14С]олеїнову кислоту (58 мКі/ммоль); [3Н]пальмітинову кислоту (54 Кі/ммоль), [14С]лінолеву кислоту (59 мКі/ммоль), гліцеролтри(9,10(n)-[3Н]олеат) (1Кі/ммоль), [14С]пальмітинову кислоту (60 мКі/ммоль) (“Amersham”, Великобританія); [U-14С]глюкозу (0,1–1 мКі/ммоль) (“Hemapol”, Чехия).
ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вікові особливості метаболізму ліпідів печінки щурів на ранньому
етапі дії на організм тиреоїдних гормонів.
З використанням методу попереднього мічення ліпідів печінки [14С] ацетатом натрію було показано, що введення в організм 3-місячних щурів екзогенного тироксину стимулює обмін ліпідів печінки, що супроводжується коливаннями вмісту загальних ліпідів та співвідношення їх окремих фракцій. Встановлено, що накопичення загальних 14С-ліпідів при дії гормону по 15-й хвилині експерименту відбувається за рахунок підвищення рівня 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу. Аналіз окремих фосфоліпідних фракцій виявив, що під дією гормону відбувається різке зростання як абсолютного, так і відносного вмісту 14С-сфінгомієліну та 14С-фосфатидилінозиту (рис. 1). Підвищення рівня досліджених фосфоліпідних фракцій є короткочасним, за винятком більш подовженого накопичення 14С-сфінгомієліну, яке спостерігається як по 15 хвилині, так і по 30 хвилині дії тироксину на організм 3-місячних щурів. Ефект гормону на утворення загальних фосфоліпідів і триацилгліцеролів із різних мічених попередників відтворюється також за умов його дії in vitro. Посилення синтезу фосфоліпідів і триацилгліцеролів спостерігається у перші 15 хвилин дії тироксину на суспензію тканини печінки та ізольовані гепатоцити 3-місячних щурів (табл. 1, табл. 2). Враховуючи ці дані, а також результати попередніх досліджень [Бабенко, Кавок, 1995; Красильникова, Бабенко, 1996], можна припустити, що посилення синтезу гліцероліпідів є однією з причин підвищення рівня цих сполук у печінці через 15 хвилин після одноразової ін'єкції тваринам тироксину.
Той факт, що під дією гормону відбувається швидке одночасне збільшення вмісту загальних 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу – основних компонентів ліпопротеїнів - дозволяє зробити припущення про підсилення за даних експериментальних умов процесів утворення та/або захвату печінкою із крові ліпопротеїнів. Не виключається, що швидке зростання вмісту 14С-холестеролу є результатом активації його синтезу під впливом тироксину із тих 14С-попередників, що містяться у печінці. Збільшення вмісту 14С-фосфоліпідів, 14С-триацилгліцеролів і 14С-холестеролу є короткочасним процесом, і в подальшому (по 30-тій хвилині експерименту) виявляється різке падіння рівня даних ліпідних фракцій, що супроводжується відповідним зниженням вмісту загальних 14С-ліпідів в печінці піддослідних тварин. Такі координовані зміни вмісту даних ліпідних фракцій можуть відбуватися, ймовірно, внаслідок викиду пула готових ліпопротеїнів печінки до крові, що згідно з роботою Калімана та ін. (1997) може бути одним із показників перемикання метаболізму на утилізацію ліпідів.
При більш тривалій дії тиреоїдних гормонів на організм 3-місячних щурів (60 і 120 хвилин) найбільш різкі зміни спостерігаються у вмісті 14С-холестеролу, 14С-триацилгліцеролу і 14С-жирних кислот. Підвищення рівня жирних кислот на тлі падіння вмісту триацилгліцеролу свідчить про активацію ліполізу за даних експериментальних умов, що узгоджується з результатами досліджень впливу тиреоїдних гормонів на ліполітичні процеси в печінці і жировій тканині [Пашкова и др., 1980]. Накопичення вільних жирних кислот у печінці, в свою чергу, може служити сигналом до активації біосинтезу холестеролу [Salam et al, 1989].
Рис. 1. Вплив тироксину на вміст індивідуальних 14С-фосфоліпідів у печінці щурів 3-місячного віку (М±m, n=12-15). Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); СФМ – сфінгомієлін; ФХ – фосфатидилхолін; ФІ – фосфатидилінозит; ФЕА – фосфатидилетаноламін.
Таблиця 1
Вплив тироксину (10 нМ) на утворення [14С]гліцероліпідів із [14С]попередників
в гепатоцитах і суспензії тканини печінки щурів 3-місячного віку (М ± m, n=6-10)
[14С]попередник Ліпід Контроль Дослід
[14С]пальмітинова кислотаa ФЛ 257.0 ± 13.0 421.2 ± 19.1*
ТАГ 4.551 ± 0.426 6.283 ± 1.931
[14С] олеїнова кислотаб ФЛ 151.8 ± 14.9 302.2 ± 16.8*
ТАГ 37.5 ± 4.3 51.1 ± 3.9*
[14С]глюкозаб ФЛ 83.6 ± 6.3 136.0 ± 17.0*
Примітки: Час інкубації з L-тироксином 15 хвилин. а – гепатоцити у концентрації 3ґ106 кл/мл преінкубували з [14С]пальмітиновою кислотою 24 год., дані виражені в імп/хв на 103 кл.; б – суспензія тканини печінки, [14С] мічений попередник вносили до середовища інкубації одночасно з додаванням L-тироксину, дані виражені в імп/хв. на мг білка. * - вірогідно по відношенню до контролю (р<0,05).
Таблиця 2
Вплив тироксину (10 нМ) на вміст гліцероліпідів у печінці
щурів різного віку (10-2імп/хв на г тканини) (М±m, n=6)
Ліпід Вік щурів, міс.
3 24
контроль дослід контроль дослід
14С-ФЛ 242±31 389±20* 277±19 245±59
14С-ТАГ 199±9 256±9* 389±30** 384±46
Примітки: Час преінкубації суспензії тканини печінки з [14С]олеїновою кислотою – 90 хвилин; час інкубації проб з тироксином – 15 хвилин. * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); ** – вірогідно у порівнянні з 3-місячним віком (р<0,05).
Введення тироксину в організм 24-місячних тварин також активує метаболізм ліпідів печінки, що супроводжується змінами рівня загальних 14С-ліпідів та їх окремих фракцій. Однак по 15 хвилині дії гормону в умовах in vivo (рис. 2), а також in vitro (див. табл. 2) не відбувається вірогідних змін рівня загальних фосфоліпідів та їх окремих фракцій за винятком зниження вмісту фосфатидилінозиту. Підвищення рівня 14С-фосфоліпідів у печінці 24-місячних щурів відбувається повільно, лише по 30-й хвилині експерименту (див. рис.2), при цьому на відміну від молодих, 3-місячних щурів, не спостерігається вірогідного збільшення вмісту 14С-холестеролу та 14С-триацилгліцеролу.
Координоване падіння рівня 14С-фосфоліпідів,14С-холестеролу та 14С-триацилгліцеролу в печінці 24-місячних щурів відбувається за даних експериментальних умов значно пізніше, ніж у молодих тварин і, ймовірно, теж пов'язане з активацією секреції ліпопротеїнів до крові.
Рис. 2. Вплив тироксину на вміст індивідуальних 14С-фосфоліпідів у печінці 24-місячних щурів (М±m, n=12-15). Примітки: * – вірогідно відносно до контролю (р<0,05); СФМ – сфінгомієлін; ФХ – фосфатидилхолін; ФІ – фосфатидилінозит; ФЕА – фосфатидилетаноламін.
На відміну від 3-місячних щурів, тироксин не приводив до підвищення рівня 14С-жирних кислот і 14С-холестеролу в печінці 24-місячних щурів протягом всього часу експерименту.
Отримані дані, таким чином, свідчать про суттєві вікові відміни в короткотерміновій регуляції метаболізму ліпідів печінки тиреоїдними гормонами. Активуючий ефект тироксину на обмін ліпідів печінки 24-місячних щурів спостерігається при більш тривалій дії гормону на організм, причому характер ліпідних перебудов у старих тварин суттєво відрізняється від тих, що відбуваються у відповідь на дію гормону в печінці 3-місячних щурів.
Оскільки встановлено, що модифікації початкових етапів клітинної активації, пов'язаних з генерацією вторинних месенджерів можуть бути причиною вікових змін у відповіді клітин на дію гормонального сигналу [Serra et al., 1996], доцільно припустити, що перебудови у механізмах сигнальної трансдукції призводять до вікових змін характеру метаболічної відповіді на дію тироксину.
Механізм швидкої активації метаболізму ліпідів під дією тиреоїдних гормонів.
На цей час встановлено, що активація метаболізму гліцероліпідів є не тільки підготовчим етапом у формуванні клітинної відповіді на вплив агоністу, але і супроводжує сам процес трансмембранної передачі сигналу [Tronchere et al., 1994; Exton, 1997] .
Наступним етапом роботи стало з'ясування механізму швидкої активації метаболізму ліпідів тиреоїдними гормонами. Для цього вивчали вплив тироксину на утворення ліпідних вторинних посередників – ДАГ у клітинах печінки щурів 3- і 24-місячного віку. Підвищення рівня ДАГ в клітинах у відповідь на дію агоніста є важливим етапом процесу сигнальної трансдукції [Billah, Anthes, 1990]. Ці сполуки є ліпідними вторинними месенджерами, для яких у клітинах знайдено численні молекулярні цілі, у тому числі різні субтипи ПКС [Wakelam, 1998].
На різних експериментальних моделях, зокрема на ізольованих гепатоцитах і суспензії тканини печінки (табл. 3, табл. 4, рис. 3, рис. 4) було встановлено, що L-тироксин викликає швидке накопичення ДАГ, яке спостерігається в перші хвилини дії гормону. В той же час D-тироксин не впливає на вміст ДАГ у суспензії тканини та ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів.
Таблиця 3
Вплив неоміцину, пропранололу і ТМВ-8 на індукцію L-тироксином
утворення 14С -1,2-діацилгліцеролів в гепатоцитах 3-місячних щурів
(% від загальних 14С-ліпідів) (М ± m, n=10-12)
Умови експерименту Контроль Дослід
Без добавлень 1,19 ± 0,06 2,02 ± 0,14*
Неоміцин 1,08 ± 0,11 1,43 ± 0,09*
Пропранолол 1,97 ± 0,21 1,77 ± 0,15
ТМВ-8 0,910 ± 0,04 1,09 ± 0,015*
Примітка. * - вірогідно відносно до контролю (р<0,05).
Відомо, що активація фосфатидилінозит-специфічної фосфоліпази С є найбільш ранньою подією, яка відбувається в клітинах у процесі сигнальної трансдукції [Berridge, 1993]. Різні гормони, нейротрансміттери і ростові фактори дуже швидко (протягом перших секунд і хвилин впливу на клітини), але короткочасно, стимулюють активність фосфоліпази С, що супроводжується накопиченням ДАГ, переважно поліненасиченого за своїм жирнокислотним складом. Однак в більшості випадків індуковане агоністом накопичення ДАГ у клітинах відбувається в результаті активації декількох сигнальних шляхів [Liscovitch, 1992; Tronchere et al., 1994; Divecha, Irvine, 1995].
Таблиця 4
Вплив L-тироксину (10 нМ) на вміст фосфатидилетанолу і діацилгліцеролів
в гепатоцитах щурів 3- і 24-місячного віку (імп/хв на 107 кл) (М ± m, n = 10-12)
Ліпід Умови експери-менту Вік щурів (міс)
3 24
Контроль Дослід Контроль Дослід
Фосфа-тидил-етанол Без добавлень 2170 ± 362 5000 ± 638* 968 ± 92 788 ± 96
Н7 1847 ± 296 2915 ± 447* 972 ± 152 940 ± 152
ДАГ Без добавлень 10797 ± 715 16515 ± 1077* 12879 ± 1755 12790 ± 1172
Н7 7359 ± 746 9051 ± 1290 11717 ± 2285 10651 ± 2053
Примітка. * - вірогідно відносно до контролю (р < 0,05).
| 
