Библиотечный каталог авторефератов Украины

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н.Каразіна

ДЕГТЯР Марина Віталіївна

УДК 577.323

ВЗАЄМОДІЯ ІОНІВ ДВОВАЛЕНТНИХ МЕТАЛІВ З НЕКАНОНІЧНИМИ СТРУКТУРАМИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико - математичних наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-технічному інституті низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України.

Науковий керівник    доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Сорокін    Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти:

       доктор фізико-математичних наук, професор, Веселков Олексій Никонович, Севастопольський національний технічний університет, завідувач кафедри фізики (м. Севастополь).

       кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Круглова Олена Борисівна, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, старший науковий співробітник (м. Харків).

Провідна установа

       Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “_16_” __05__2003 року о _15_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці  Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “_11_” __04__2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                           Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найважливіших задач біофізики і фізики нуклеїнових кислот (НК) є з'ясування молекулярних механізмів, які забезпечують виконання їх біологічних функцій.  Іони металів беруть участь в підтриманні нормального функціонування генетичного апарата клітини, а також можуть призводити до його порушення. Це викликає інтерес до вивчення взаємодії іонів з природними та синтетичними  нуклеїновими кислотами, у тому числі з їх неканонічними структурами. В теперішній час проводяться численні дослідження можливостей використання багатоланцюгових структур НК для лікування вірусних, генетичних та онкологічних захворювань. Основою антигенної та антизмістової стратегій виборчого пригнічення експресії генів є формування триплексів. Управління утворенням квадруплексів в теломірних кінцях хромосом також представляє потенціальний механізм регулювання функціонування клітини. Проте умови стабільності триплексів та квадруплексів вивчені недостатньо, тому представляє інтерес вивчення конформаційних переходів в системах, що містять одно-  та багатоланцюгові спіралі, в присутності іонів металів. В якості модельних систем особливий інтерес представляють гомополінуклеотиди, тому що в залежності від умов вони можуть знаходитися в стані клубка, одноланцюгових спіралей, а також утворювати канонічні та неканонічні багатоланцюгові структури.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати дисертації одержані в ході виконання  планових науково-дослідницьких робіт за темою: "Дослідження структурних і фізико-хімічних властивостей комплексів нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами" (шифр теми 1.4.10.18.2), а також Міжнародного гранта  US Civilian Research and Development Foundation (CRDF) "Study of Me2+ ion  interaction  with  noncanonical multi-chain structures of nucleic acids" N UN1-435 (1997-1999).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення  основних закономірностей впливу температури та концентрації іонів двовалентних металів (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Cu2+) на конформаційну рівновагу  в водних розчинах гомополінуклеотидів різного рівня структурної організації та з'ясування  фізичної природи структурних переходів, що індукуються іонами Mt2+, а також встановлення  особливостей  форми фазових діаграм металокомплексів при різних іонних силах розчину.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

1. Одержати фазові діаграми металокомплексів НК (діаграми температура конформаційних переходів - концентрація іонів Mt2+);
2. Визначити  атоми, що координують іони Mt2+ в одно- та багатоланцюгових  полінуклеотидах, що утворені аденіном та урацилом (polyA, polyU, A×U, A×2U), а також гіпоксантином  (1×I, 4×polyI);
3. Встановити  характер конформаційних переходів, що індукуються іонами металів;
4. Розрахувати  константи зв'язування, що характеризують утворення відповідних  металокомплексів.

Об’єкт дослідження: конформаційні переходи в водних розчинах гомополінуклеотидів.

Предмет дослідження: молекулярні механізми зміни термостабільності та конформації полінуклеотидів, індуктовані іонами одно- та двовалентних металів.

Методи дослідження: метод диференційної УФ спектроскопії використовувався для встановлення місць звя’зування іонів металів з гомополінуклеотидами; конформаційні переходи, індуктовані іонами металів, реєструвалися методом термічної денатурації. 

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Впереше одержано діаграми конформаційної рівноваги в водних розчинах A×U та A×2U в присутності  іонів Mg2+ та Ni2+ в інтервалі концентрацій Mt2+ (10-5 - 10-2)М і температур (20 - 96)0С при 10-2, 3×10-2, 10-1 М Na+.
2. Встановлено, що форма цих діаграмм визначається  значеннями констант зв’язування іонів двовалентних металів з різними конформаціями полінуклеотида.
3. Впереше визначено порядок величини фактора кооперативності переходів потрійна спіраль → подвійна спіраль (3→2) та потрійна  спіраль → одноланцюгові ниті (3→1). Показано, що низька кооперативність переходу 3→2 зумовлена низьким значенням ентальпії цього переходу.
4. Запропонований можливий механізм руйнування впорядкованої структури чотирьохланцюгової polyI  іонами перехідних металів: Mt2+ взаємодіють з N7 та через молекулу води гідратної оболонки іона з О6, що призводить до депротонування N1 та руйнування системи водневих зв’язків, які підтримують стабільність полінуклеотида.
5. Виявлена компактизація одноланцюгових polyA і polyI в присутності  іонів Ni2+ і Cu2+.
6. Визначено  константи зв'язування  іонів  Ni2+ з подвійною  спіраллю A×U і потрійною спіраллю A×2U, а також іонів Cu2+ з N7 гіпоксантина одно- та чотирьохланцюгової  polyI.

Практичне значення одержаних  результатів. Встановлений  температурно-концентраційний діапазон стійкості вивчених  дуплексів, триплексів та квадруплексів в присутності різних іонів Mt2+, а також механізм їх впливу на конформаційний стан полінуклеотидів може представляти  інтерес при  дослідженні методів лікування генетичних захворювань, які основані на утворенні  триплексів між ДНК або РНК клітини та олігонуклеотидами, що введені в клітину. Одержані  результати можуть бути використані  для вибору іонів металів, що сприяють  формуванню триплексів і квадруплексів та  забезпечують їх стабільність.

Особистий внесок здобувача.  В опублікованих з співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає: в роботах [1,2,5] – у пошуку та критичному аналізі літературних даних, участі в проведенні експериментальних досліджень, розрахунках констант зв'язування; в роботах [3,4] – у розробці програм розрахунку констант зв'язування іонів Mt2+ з використанням  теорії лігандів та експериментальних концентраційних залежностей температур конформаційних переходів; в роботах [6-19]  - в участі в постановці задачі, аналізі та інтерпретації одержаних даних, розробці комп'ютерних програм автоматичної реєстрації та обчислювання  диференціальних УФ-спектрів та кривих плавлення.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень за темою дисертації були представлені та обговорені на:

• XIII Інтернаціональній школі - семінарі "Спектроскопія молекул та кристалів", Суми, Україна, 20-26 Квітня, 1997;
• 7th International Symposium on Macromolecule-Metal Complexes, Nordwijkerhout, The Netherlands, October 6­-10, 1997;
• XV Conference on Statistical Mechanics in Biological Systems, Sitges, Spain, June 8­-12, 1998;
• II з'їзд Українського біофізичного товариства, Харків, Україна, 29 червня - 3 липня, 1998;
• XII Round Table Nucleosides, Nucleotides and their Biological Application, Montpellier, France, September 6-10, 1998;
• Конференції “Фізика біологічних систем”, Київ, Україна, 6-10 вересня, 1998;
• Інтернаціональній школі - семінарі "Спектроскопія молекул та кристалів",   Одеса, Україна, 7-12 червня, 1999;
• 8th  European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules,   Enschede, the Netherlands,   29 August - 2 September 1999;
• 8th Jerusalem Spring School in Life Sciences on “DNA Repair and Human Disease, Jerusalem, Israel, May 2-7, 1999;
• Adriatico Research Conference on Interaction and Assembly of Biomolecules, Trieste, Italy, August 27-31, 2001;
• European Conference on Biological Inorganic Chemistry, Lund, Sweden, July 29 - August 3, 2002.

Публікації.  За результатами дисертації опубліковано 5 статей у наукових фахових журналах і 14 тез доповідей на національних та міжнародних конференціях.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається  зі вступу, п'яти розділів та висновків. Повний обсяг дисертації складає  148  сторінок, 55 малюнків, з них 4 на окремих сторінках, 11 таблиць, список використаних джерел  (123 найменувань) займає 13 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету та задачі досліджень, наведена загальна характеристика дисертації.

Розділ 1 містить огляд літератури, присвяченої експериментальному та теоретичному дослідженню комплексів неканонічних структур НК з іонами металів. Розглянуто біологічну роль неканонічних структур НК. Наведені методи теоретичного опису взаємодії НК з низькомолекулярними лігандами, які надалі використовувалися  в роботі  для визначення  констант зв'язування.

       Детально проаналізована існуюча інформація про комплекси іонів одно- та двовалентних металів з багатоланцюговими структурами  НК. Показано, що в випадку A×U та A×2U (мал 1.) подібні дослідження були виконані  тільки для іонів Na+ і K+. Для комплексів цих полінуклеотидів з Mg2+  і Ni2+ дослідження  були проведені тільки при окремих концентраціях іонів, що не дозволяє  отримати повні фазові діаграми. Дані про взаємодію  іонів Mt2+ з 1×I і 4×I малочисельні та мають  якісний характер. Дані про константи зв'язування перехідних металів з A×U, AЧ2U і  4ЧI практично відсутні.

Розглянуто теоретичне описання переходу спіраль-клубок в присутності низькомолекулярних речовин (теорія лігандів,    Франк - Каменецкий, 1972). Показано, що викликане зв'язуванням лігандів змінення температури переходу визначається формулою:

                               (1)

де Tm  і ΔН - відповідно температура та ентальпія переходу спіраль - клубок, Tm  - температура, що відповідає  переходу в нову конформацию 50% ланок полінуклеотиду, Tm0 - Tm в відсутності лігандів, Af - вільна концентрація лігандів, K2 та K1 - константи зв'язування з спіральною та клубкоподібною фазами полінуклеотиду, відповідно. 

В Розділі 2 наведена загальна характеристика матеріалів та методів дослідження.

       Об'єктами дослідження є гомополінуклеотиди polyA, polyU, A×U, AЧ2U, 1×I і 4×I (Sigma, Serva).

       Полінуклеотиди та хлориди Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+  і Cu2+ розчиняли в ацетатному (pH 6.0,  [Na+] = 10-3-10-1 M) або  какодилатному (pH 7.0, [Na+] = 10-2 М) буферах. Для одержання чотирьохланцюгової polyI  одноланцюгову polyI розчиняли в ацетатному буфері, що містив 1 М Na+, та  витримували при  20С протягом 300 годин. При вимірюванні диференційних УФ спектрів концентрація НК (Р) складала  (1±0.1)×10-4М, в експериментах по плавленню Р=(6.5±0.5)×10-4М. Похибка визначення концентрації  Р та іонів металів складала 0.5%. 

Експериментальні методи: диференційна УФ спектроскопія, термічна денатурація.

Метод УФ спектроскопії  має високу  чутливість до змін поглинання НК, що дозволяє використовувати розведені розчини, зводжуючи  до мінімуму агрегацію полінуклеотидів в відсутності іонів, а також збільшити діапазон досліджених  концентрацій іонів. Форма диференційних УФ спектрів (ДУФС) залежить від природи атомів, з якими взаємодіє іон (Сорокин, Благой, 1991). Метод ідентифікації зв'язуючих центрів грунтується на порівнянні  форми ДУФС полінуклеотидів з формою диференційних  спектрів мономерів, для яких місця зв'язування іонів відомі,  а також з ДУФС,  зумовленими протонуванням, оскільки  для протонів іонізовані атоми визначені з великим ступенем надійності. Експериментальні ДУФС реєстрували з використанням 4-кюветної схеми. Похибка вимірювання оптичної щільності складала 0.5%. Вимірювання проводилися на спектрофотометрі Specord M 40, Carl Zeiss Jena. 

Термічну денатурацію полінуклеотидів проводили в герметичних кварцевих кюветах, розміщених в 2 ідентичних мідних блоках, що знаходилися в камері спектрофотометра Specord UV VIS фірми Carl Zeiss Jena. Нагрів проводився із швидкістю 0.25 0С/мин. Криві конформаційних переходів 2→1, 3→1 та 3→2 реєструвались в максимумі поглинання полінуклеотидів, переходи 2→3 і 3→2 спостерігались в ізобестичній точці спектра гіперхромізму подвійної спіралі (ν = 35700см-1). Похибка вимірювання температури знаходилась  в межах ±0.50С.

Розділ 3 містить  експериментальні дані про комплекси A×U та A×2U з іонами Mg2+. Як видно з мал. 2., форма ДУФ спектрів A×U і A×2U (Деа) є "дзеркальним" відображенням спектрів  Δеh,   зумовлених  плавленням  подвійної спіралі  A×U та потрійної  спіралі  A×2U,  відповідно.   Це

означає, що при 200С і 10-2 M Na+ AЧU та A×2U мають деяку кількість  невпорядкованих  ланок, які  при додаванні Mg2+ переходять в спіральний стан.

Одержані криві плавлення комплексів  A×U та A×2U з іонами Mg2+ були використані для побудови діаграм конформаційних переходів. За винятком фазових діаграм комплексів A×2U з іонами Mg2+ при низьких іонних силах розчину,  усі інші мають “критичну” точку, в якої змінюється тип конформаційного переходу.  Відповідна їй концентрація іонів Mg2+ слабо залежить від початкової конформації полінуклеотиду. Крім того, при 10-1M Na+ накладення фазових діаграм комплексів A×U та A×2U з іонами Mg2+ (мал. 3)   показує   наявність"критичної"  точки,   спільної   для   обох полінуклеотидів. Їй відповідає температура   (Tm)cr=(55÷58)0C і концентрація [Mg2+t]cr = (3,5÷5,5)⋅10-5М. Якщо співвідношення концентрацій polyA та polyU  в розчині дорівнює  1:2, то при більш високих  температурах  і  вищих від “крітичної” концентраціях  іонів  Mg2+ при плавленні потрійної спіралі  A×2U подвійна спіраль A×U не утворюється, а при співвідношенні 1:1 при плавленні подвійної  спіралі  утворюється потрійна  при температурах, більш низьких, ніж  “критична”.

       В роботі  також були отримані повні фазові діаграми  A×U і A×2U з іонами Mg2+ (мал. 4). Форма фазових діаграм суттєво залежить від іонної сили розчину. Так, при 10-2 М Na+ при руйнуванні потрійної спіралі  A×2U в якості проміжної конформації утворюється подвійна спіраль, яка існує в вузькому температурному інтервалі (3-50С). При 10-1 М Na+ AЧ2U область існування подвійної спіралі  звужується з підвищенням вмісту Mg2+ і при концентрації іонів вищє, ніж  критична, A×2U  при нагріванні  розпадається безпосередньо  на одноланцюгові клубки.

Аналіз температурних інтервалів  конформаційних переходів показав, що перехід 3→2 має суттєво меншу кооперативність, ніж переходи 2→1 і 3→1 (мал.4). Інтервал переходу (ΔT) визначається, в основному, величинами його ентальпії  та фактора кооперативності (σ) (Lazurkin Yu.S., Frank-Kamenetskii M.D., Trifonov E.N. 1970) 

                                               (2)

Показано, що фактори кооперативності для всіх вивчених переходів є величинами одного порядку (10-4 - 10-5). Таким чином, причиною меншої кооперативності переходу 3→2 є низьке значення його ентальпії  (величини ΔH переходів 3→1, 2→1 і 3→2 складають 12.7,  7.8 і 2.0 ккал/моль, відповідно, Krakauer H., 1968, Pilch D.S., 1995).

Фазові діаграми дозволили розрахувати значення констант зв'язування Mg2+ з polyA та polyU по теорії лігандів. Знайдені константи погоджуються з експериментально одержаними результатами інших авторів в межах розсіяння їх значень. Це свідчить про те, що термодинамічний опис конформаційних переходів в досліджених системах, оснований на теорії лігандів, є коректним. Підтвердженням цього  є також задовільна згода експериментальної та  розрахованої теоретично залежностей інтервалу переходу 3→1 від ступеню зв'язування (мал. 5) при (табл).  

В разділі 4 наведені експериментальні дані про взаємодію Ni2+ з A×U і A×2U. Форма ДУФС комплексів Ni2+ з A×U і A×2U (мал. 2.) показує, що іони Ni2+, подібно Mg2+, не зв'язуються з основами подвійних  та потрійних спіралей, а взаємодіють тільки з фосфатними групами, що призводить до упорядкування розупорядкованих ділянок полінуклеотидів. Причиною відсутності взаємодії з N7 аденіна в разі A×U є, можливо, жорсткість подвійної спіралі, що перешкоджає утворенню  хелатних комплексів N7 - Ni2+  - О(Р). В A×2U N7 бере участь в утворенні водневих зв'язків (мал. 1),   що додатково утруднює взаємодію Ni2+  з цим гетероатомом.

Подібність форм ДУФС AMP і polyA, індукованих іонами Ni2+ (мал. 6), показує, що в обох випадках координуючим іон атомом є N7 аденіну. В разі polyA при кімнатній температурі ця взаємодія спостерігається при [Ni2+]>4Ч10-4М. При [Ni2+]>10-3М відбувається утворення компактних часток з ефективним радіусом Rэф ~100 Е, оцінка якого проведена по хвильовій залежності  оптичної щільності від хвильового числа в області ν = (16000 - 30000)см-1.

Вплив іонів Mg2+  і Ni2+  на конформаційні переходи A×U і A×2U якісно подібний, але є й деякі відрізнення. Як для Mg2+, так і для Ni2+ зростання вмісту  іонів призводить до підвищення температур переходів 2→1 та 3→1 (мал. 4,7). Значення критичної концентрації для цих іонів співпадає, однак, в разі іонів Ni2+ температура переходу 2→3 не залежить від концентрації іонів, тоді як для Mg2+ при концентрації вище критичної, стабільність подвійної спіралі  знижується з підвищенням вмісту іонів, внаслідок чого область існування  потрійної спіралі  розширюється (рис 3, рис 7).

Розрахунок констант зв'язування  Ni2+ з A×U  і  A×2U було виконано в рамках теорії лігандів. Зв'язування Ni2+ характеризується негативною кооперативністю (мал. 8), що зумовленокулонівським відштовхуванням іонів, що адсорбуються з розчину, іонами, вже зв'язаними  з полімером. Одержані значення констант зв'язування дозволяють пояснити деякі особливості фазових діаграм. Так, причиною  дестабілізації A×U іонами Mg2+ є виконання умови KA×2U > KA×U (табл.). Відсутність залежності температури переходу 2→3 від вмісту  Ni2+ (мал. 7) обумовлена близькими значеннями констант зв'язування Ni2+ з A×U, A×2U  і polyA (табл). Підвищення термостабільності подвійних  та  потрійних спіралей в присутності іонів Mg2+ і Ni2+ викликано тим, що константи зв'язування іонів з багатоланцюговими спіралями вище, ніж з одноланцюговою  polyU.

                                        Таблиця.

Константи зв'язування іонів Mg2+ та Ni2+ з polyA, polyU, A×U і A×2U при С = 0.

- значення, одержані в роботі.

(а) - дані Diebler, 1987, перераховані на 3×10-2М Na+,  інші - Krakauer, 1974

       Розділ 5 присвячений вивченню  взаємодії іонів Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+ та Cu2+ з одно-

та чотирьохланцюговою polyI. Для  4×I спектр Δεa складається з конформаційної та координаційної (Δεb) складових. Останній обумовлений  взаємодією іонів з гетероатомами основ. Порівняння індукованих іонами Cu2+ спектрів Δεa для  1×I, з координаційною складовою ДУФС 4×I, а також з спектрами протонування по N7 та депротонування   по  N1  (мал. 9)   дозволяє   припустити,   що   іони Cu2+ утворюють хелатні комплекси,      взаємодія з  N7 та через молекулу  води гідратної оболонки   іона  з О6,  що призводить  до депротонування N1 (мал. 10).

       Руйнування упорядкованої  структури 4×I іонам Cu2+, що відбувається при цьому, зумовлено, можливо, розривом системи водневих зв'язків, що забезпечують її стабільність (мал. 10).

       В цьому розділі представлені також розрахунки констант зв'язування іонів Cu2+ з 1×I і 4×I. На відмінність від антикооперативністі зв'язування Cu2+ з 4×I, взаємодія з 1×I характеризується позитивною кооперативністю. Зростання відмін між K4 та K1 при зростанні ступеню зв'язування є додатковим фактором руйнування чотирьохланцюгової структури.  

Іони Mn2+ та Ni2+ взаємодіють з 4×I подібно до іонів Cu2+ тільки при суттєво більш високих концентраціях. При великому вмісті   іонів Ni2+ та Cu2+ спостерігається компактизація 1×I, що утворилася  в результаті розпаду 4×I. Як і в випадку polyA в присутності іонів Ni2+, ефективний радіус компактних часток 1×I складає ~100 Å. Ця компактизація повинна супроводжуватися дегідратацією полімеру, що може бути причиною позитивної кооперативністі взаємодії  іонів Cu2+ з 1×I. Іони Mg2+ і Ca2+ в вивченому діапазоні концентрацій не зв'язуються з основами 4×I та не змінюють її конформацію.

ВИСНОВКИ

В дисертації  встановлені  основні закономірності впливу температури та концентрації іонів одно- та двовалентних металів  на конформаційну рівновагу  в водних розчинах гомополінуклеотидів. Встановлені  температурні та концентраційні  області стабільного стану окремих конформацій. Показано, що форма діаграм конформаційної рівноваги визначається  значеннями констант зв’язування іонів Mt2+ з різними конформаціями полінуклеотида.

1. Впереше отримані фазові діаграми конформаційної рівноваги одно- (polyA, polyU), дво- (polyA×polyU) та трьохланцюгових (polyA×2polyU) полінуклеотидів в розчинах, що містять іони Mg2+ та Ni2+, в широкому інтервалі температур (20 - 960С) та концентрацій іонів (10-5  –   10-2)М, визначена "критична" концентрація іонів Mg2+ та Ni2+, перевищення якої призводить до зміни типу конформаційного переходу;

2. Знайдено, що перехід 3→2 є значно менш кооперативним, ніж переходи 2→1 та 3→1. Причиною цього є низька величина ентальпії переходу 3→2;

3. Форма фазових діаграм комплексів A×U та A×2U з іонами Mg2+ та Ni2+ суттєво залежить від концентрації іонів Na+. Так, при їх концентрації, близькій до фізіологічної (0.1М), підвищення вмісту іонів Mg2+ в розчині A×U призводить до безперервного розширення діапазону стабільного стану потрійної спіралі, тоді як при 10-2 М Na+ він не залежить від концентрації Mg2+. При цьому "критична" точка на фазових діаграмах комплексів A×2U з ионами Mg2+ та Ni2+ відтсутня;

4.  Показано, що теорія лігандів задовільно описує зміну параметрів переходів 3→1, 3→2 та 2→1 в A×U та A×2U, викликану іонами Mg2+ та Ni2+.  З термодинамічного аналізу, виконаного в рамках цієї теорії, випливає, що зміна температур  конформаційних переходів визначається константами зв'язування іонів Mt2+ з одно- та багатоланцюговими спиралями;

5.  Знайдено, що подібно до іонів Mg2+, іони Ni2+ зв'язуються тільки з атомами кисню фосфатних груп A×U та A×2U. Взаємодія з N7 аденіну цих полінуклеотидів відсутня, в той час як вона спостерігається в AMP та polyA;

6. Встановлено, що іони Cu2+, Ni2+, Mn2+   зв'язуються з N7 гіпоксантину, що призводить до руйнування упорядкованої структури чотирьохланцюгової polyI. В присутності високих концентрацій цих іонів спостерігається утворення компактних часток одноланцюгової polyI з ефективним радіусом ~100 Е. Іони Mg2+ та Cа2+ не взаємодіють з N7 4×polyI і відповідно не змінюють її конформацію;

7. Впереше встановлена залежність від ступеню зв'язування констант асоціації Cu2+ з гіпоксантином чотирьох- та одноланцюгової polyI і іонів Ni2+ з фосфатами A×U та A×2U. Взаємодія іонів з мультиланцюговими спіралями характеризується негативною кооперативністю, зв'язування іонів Cu2+ з одноланцюговою polyI має позитивну кооперативність.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Sorokin V.A.,Valeev V.A., Degtyar M.V.,Blagoi Yu.P. Interaction of Ni2+ ions with homopolynucleotides containing adenine and uracil and its monomers // Biophysical Bulletin -  N466 - Series - "Molecular Biophysics". - 1999. - Issue 5(3). -  P.33 - 37
2. Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Interaction of divalent metal ions with polyriboinosinyc acid // Macromolecular Chemistry and Physics - 2000. -  V.201, N 17. -  P. 2408 - 2416
3. Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Ni2+ Ion Effect on Conformations of Single-, Double- and Three-Stranded Homopolynucleotides Containing Adenine and Uracil // Macromolecular Chemistry and Physics  - 2001. -  N 5. -  P. 191 - 203
4. В.А.Сорокин, В.А. Валеев, Г.О. Гладченко, М.В. Дегтяр, А.Ю. Рубина, Е.А. Андрусь, Ю.П. Благой, В.А. Карачевцев Влияние ионов Mg2+  на конформацию polyA×polyU// Вісник Харківського університету. - № 528. - Серія "Молекулярна Біофізика" - 2001. - Вип. 2(9). - С. 45-50
5. V.A Sorokin,  V.A. Valeev, G.O. Gladchenko , M.V. Degtiar, E.A.Andrus, Yuri P. Blagoi, V.A. Karachevtsev Effect of Mg2+ ions on the stability of polyA⋅2polyU three stranded helices in aqueous  solutions //Macromol. Biosci. - 2002. - v.2. - p.155-162
6. V. Sorokin, I. Sysa, V. Valeev, G. Gladchenko , M. Degtiar, Yu. Blagoi Differential UV spectroscopic studies of transition metal ion interaction with DNA and its monomers // Abstracts XXIII European Congress on Molecular Spectroscopy. - Balatonfured, Hungary. - 1996.  - P. 150
7. M.Degtyar,  V.Sorokin, G.Gladchenko, V.Valeev, I.Sysa, Yu. Blagoi  Interaction of   Me2+ ions with poly  I  in conformation of four-stranded helix //  Book of Abstract XV  Conf. on Statistical Mechanics in Biological Systems.-    Sitges, The Spain. - 1998. - P.2
8. Гладченко Г.О., Сорокін В.О., Валеєв В.О., Сиса І.В., Дегтяр М.В., Благой Ю.П. Кооперативні ефекти при утворенні металокомплексів нуклеїнових кислот // Тези доповідей II з'їзду Українського біофізичного товариства. - Харків, Україна - 1998. -  С.13
9. Сорокін В.О., Гладченко Г.О.,Валеєв В.О., Сиса І.В., Дегтяр М.В., Благой Ю.П. Структура та стабільність металокомплексів нуклеозидмонофосфатів канонічних основ Тези доповідей II з'їзду Українського біофізичного товариства. - Харків, Україна - 1998. - С. 24
10. V.Sorokin, M.Degtyar,  G.Gladchenko, V.Valeev, Yu. Blagoi  Influence of Ni2+ ions on thermostability of polyA×2polyU // Proceeding of the XIV International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. - Odessa, Ukraine. - 1999 -  Р. 167
11. G.Gladchenko, V.Sorokin, V.Valeev, M.Degtyar, I.Sysa, Yu. Blagoi Phase Equilibrium in polyA×polyU complexes with Mg2+ and Ni2+ ions.// Proceeding of the XIV International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. - Odessa, Ukraine. -  1999. - Р. 144
12. Gladchenko G.O., Sorokin V.A., Valeev V.A., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P.Mg2+ ion effect on phase equilibrium in polyA× polyU and polyA× 2polyU.// Abstracts of the  8th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. - Enschede, The Netherlands. - 1999. -  Р. 259 - 260
13. Blagoi Yu.P., Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V. Ni2+ ion effect on conformational transitions in triple helix of polyA×2polyU // Abstracts of the  8th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. - Enschede, The Netherlands. - 1999. -  P. 251 - 252
14. Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Effects of divalent metal ions on secondary and tertiary structures of polyriboinosilic acid.// Abstracts of the  8th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. - Enschede, The Netherlands. - 1999. - P. 253 - 254
15. Г.О. Гладченко, В.А.Сорокин, В.А. Валеев, М.В. Дегтяр, И.В. Сыса, Ю.П. Благой Конформационные переходы в комплексах polyA×polyU и polyA×2polyU с ионами Mg2+ и Ni2+ // Тезисы докладов II съезда биофизиков России. - Москва, Россия. -  1999. -  С. 106 - 107
16. Gladchenko G.O., Sorokin V.A., Valeev V.A., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P Metal ion effects on phase equilibrium in polyA×polyU and polyA×2polyU // Abstracts of the 3rd Eur. Bioph. Congress in “Europ.Biophys.J”. -  2000. - V.29, N4-5. -  P.250
17. Degtyar M.V. , Sorokin V.A., Gladchenko G.O., Valeev V.V., Yurii P. Blagoi   Conformational transitions of  polyA×2polyU in the presence of Mg2+ in    solutions with different ionic strength // Abstracts of EUROBIC-6. - Lund, Sweden. - 2002. -  P. 190
18. Sorokin V.A., Valeev v.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Karachevtsev V.A., Blagoi Yu.P Study of conformational transition in polyA×polyU and polyA×2polyU in the presence of Mg2+ // Abstracts of the  17 Symposium of Medical Chemistry  in “Drugs of the future”. -  2002. -  V. 27, suppl A. - P. 198
19. V.Sorokin, V.Valeev, G.Gladchenko, M.Degtyar, V. Karachevtsev,  Yu. Blagoi Mg2+ and Ni2+ ion effect on conformational state of polyA×polyU and polyA×2polyU // Тези доповідей III з'їзду Українського біофізичного товариства. -  Львів, Україна. - 2002. - С.7

АНОТАЦІЯ

       Дегтяр М.В. Взаємодія іонів двовалентних металів з неканонічними структурами нуклеїнових кислот – Рукопис.

       Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2002.

       Проведено експериментальне дослідження комплексів іонів лужноземельних (Ca2+, Mg2+) та перехідних (Cu2+, Ni2+, Mn2+) металів з одно- та багатоланцюговими гомополінуклеотидами (polyA, polyU, polyI, A×U, A×2U, 4×polyI) в водних розчинах. Виміряні диференційні УФ-спектри металокомплексів, що дозволило визначити вплив іонів на конформацію полінуклеотидів, а також встановити міста зв'язування іонів, запропонувати структуру комплексу, що утворюється,  та механізм викликаного іонами руйнування спіралі. В широкому діапазоні концентрацій іонів одержані діаграми конформаційних рівноваг. Виконані розрахунки констант зв'язування іонів  з одно- та  багатоланцюговими спіралями. Одержані значення констант зв'язування дозволили в рамках теорій лігандів пояснити деякі особливості фазових діаграм. Зареєстровано утворення  компактних часток в присутності високої концентрації іонів металів та визначені  розміри цих часток.

Ключові слова: іони перехідних металів,  полінуклеотиди, диференційна УФ спектроскопія, термічна денатурация.