|
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені Юрія Федьковича
СЕМЧИШИН
Галина Миколаївна
УДК 577. 158.7+577.23+576.851.48
БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ АНТИОКСИДАНТНИХ СИСТЕМ ШТАМІВ ESCHERICHIA COLI З РІЗНОЮ ТОЛЕРАНТНІСТЮ ДО КИСНЮ
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці– 2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії Міністерства охорони здоров'я України та Прикарпатському університеті імені Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України, м. Івано-Франківськ.
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор Клименко Анатолій Олексійович, Івано-Франківська державна медична академія, декан фармацевтичного факультету, завідувач кафедри біохімії.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України Донченко Георгій Вікторович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, науковий керівник відділу біохімії коферментів, м. Київ.
доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія, проректор з наукової роботи, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології, м. Чернівці.
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ.
Захист відбудеться 4 грудня 2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д76.051.05 у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці, в. Лесі Українки, 23).
Автореферат розісланий 1 листопада 2002 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Оксидативний стрес – це збільшення рівня активованих форм кисню (АФК) внаслідок порушення рівноваги між процесами їх утворення і детоксикації [Sies H., 1993; Sies H., 1997]. Живі організми зазнають оксидативного стресу внаслідок впливу іонізуючого та ультрафіолетового випромінювання, різноманітних хімічних реагентів, чисельних лікарських середників тощо [Kappus H. et al., 1981; Hassett D.J. et al.,1987]. Escherichia coli та інші ентеробактерії є факультативними анаеробами і складають значну частину нормальної мікрофлори кишкового тракту ссавців, тому знаходяться переважно в анаеробних умовах. Проте, ентеробактерії можна виділити і з природних водоймищ, ґрунту тощо. Ці мікроорганізми піддаються впливові АФК при різкому переході від анаеробних умов до аеробних, а також при дії на них фагоцитів [Demple B., 1991; Storz G. et al., 1999; 2000].
Відомо, що АФК задіяні в патогенезі чисельних захворювань. Інтенсивність вільнорадикального окиснення в організмі зростає при атеросклерозі, ракових захворюваннях, цукровому діабеті, а також ці процеси супроводжують старіння [Yu B.P., 1994; Stadtman E.R. et al., 1998; Stadtman E.R., 1998]. Саме тому увага багатьох дослідників прикута до функціонування механізмів генерації АФК та їх знешкодження в клітині, і кишкова паличка визнана найзручнішим модельним об'єктом у подібних дослідженнях.
Система глобальної відповіді клітини на дію пероксиду водню вперше була виявлена в E. coli [Demple B. et al., 1983]. Інкубація бактерій з пероксидом водню або супероксид-генеруючими реагентами низьких концентрацій робить клітини резистентними до дії високих доз оксидантів, які до цього були летальними. Адаптивна відповідь кишкової палички залежить від синтезу певних білків, оскільки обробка бактерій оксидантами низьких концентрацій в присутності інгібіторів синтезу білка попереджує виникнення резистентності мікроорганізмів до високих концентрацій цих реагентів. У кишковій паличці ідентифіковано два білки SoxR та OxyR, які контролюють глобальну відповідь клітини на дію супероксид-аніону і пероксиду водню. Ці білки є регуляторами транскрипції ефекторних генів оксидативного стресу, 16 з яких належать до регулону SoxRS (активується О2-) та 9 – до OxyR (активується Н2О2) [Storz G. et al., 2000; Zheng M. et al., 2000]. На сьогодні накопичено чимало знань про функціонування цих регулонів. Проте, згідно з наявною у нас інформацією експресія киснем генів регулону OxyR раніше не вивчалась. До цього часу не було проведено систематичного порівняння впливу оксидативного стресу на штами ешерихій з різною чутливістю до кисню.
Зв'язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційне дослідження виконане за планом основного наукового напрямку Івано-Франківської медичної академії "Розробка нових технологій і стандартів якості діагностики і лікування найважливіших неінфекційних захворювань" і є складовою частиною наукової теми "Антиінфекційна резистентність і стан здоров'я дітей м. Івано-Франківська в сучасних екологічних умовах Прикарпаття" (№ держреєстрації ВНО2.05/0110/ 054.99П). У вказаній комплексній науково-дослідній роботі автором виконані дослідження впливу оксидативного стресу і різних рівнів кисню на активність антиоксидантних ферментів та вміст продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів в штамах E. coli з різною чутливістю до кисню, а також вивчення функціональних характеристик каталази E. coli. Дисертаційне дослідження виконане на базі кафедри біохімії Івано-Франківської державної медичної академії та клініко-діагностичної лабораторії Івано-Франківського обласного перинатального центру. Завершальна частина дисертаційного дослідження та оформлення роботи проводились в Прикарпатському університеті ім. В. Стефаника, м. Івано-Франківськ.
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було оцінити інтенсивність оксидативного стресу і потужність системи детоксикації АФК у штамах E. coli, які відрізняються чутливістю до кисню. Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:
1) дослідити вплив різних рівнів кисню в середовищі культивування та оксидативного стресу на активність антиоксидантних ферментів штамів E. coli, які відрізняються за чутливістю до кисню;
2) визначити вплив різних рівнів кисню в середовищі культивування та пероксиду водню на вміст продуктів вільнорадикального окиснення білків та ліпідів у клітинах E. coli;
3) вивчити функціональні властивості антиоксидантних ферментів E. coli.
Об'єкт дослідження – відповідь антиоксидантних систем штамів E. coli з різною чутливістю до кисню на дію екзогенного оксидативного стресу.
Предмет дослідження – показники активності антиоксидантних ферментів та вміст продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів в штамах E. coli з різною толерантністю до кисню за дії пероксиду водню та різних рівнів кисню в середовищі культивування.
Методи дослідження. Стан антиоксидантної системи ешерихій оцінювали за супероксиддисмутазною, каталазною, пероксидазною, глутатіон-редуктазною, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназною активністю у диких штамах, які відрізняються генетичними характеристиками, та штамах-мутантах, дефектних за певними ланками антиоксидантної системи. Дію оксидативного стресу оцінювали за рівнем карбонільних груп білків та ТБК-активних продуктів в клітинах ешерихій.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що оксидативний стрес, індукований пероксидом водню, збільшує активність ферментів регулону SoxRS. Вперше комплексно оцінено вплив оксидативного стресу на рівень продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у бактеріях. Показано, що екзогенний пероксид водню призводить до збільшення вмісту окиснених білків та ліпідів у E. coli, причому величина цих показників залежить від способу індукції стресу. Систематичний аналіз антиоксидантних систем E. coli KS400 i AB1157, які характеризуються різною чутливістю до кисню, свідчить про залежність здатності цих штамів рости за різних умов забезпечення киснем від потужності їхніх систем захисту від АФК. Запропоновано метод вивчення каталазної активності в нативних клітинах кишкової палички, що ґрунтується на здатності молекул субстрату каталази (Н2О2) вільно дифундувати через плазматичні мембрани.
Практичне значення одержаних результатів. Представлені в роботі дані поглиблюють відомості про експресію ферментів регулонів SoxRS, OxyR та RpoS Escherichia coli. Отримані в роботі результати свідчать про підвищення вмісту модифікованих вільнорадикальним окисненням білків та ліпідів за дії екзогенного оксидативного стресу, що може використовуватись для оцінки впливу оксидативного стресу у клітинах ешерихій. Одержані результати можна використати для біохімічної ідентифікації різних варіантів ешерихій, а також для розробки методів і засобів культивування E. coli. Результати роботи використовуються при читанні лекцій та проведенні практичних занять з мікробіології, біохімії та молекулярної біології на кафедрі біології Прикарпатського університету ім. В. Стефаника та на кафедрі біохімії Івано-Франківської державної медичної академії.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під науковим керівництвом доктора медичних наук, професора Клименка А.О. Дисертантом самостійно проведені експерименти, результати яких представлені у розділах 3 і 5, визначені обрані для дослідження показники та виконані статистична обробка матеріалу і оформлення дисертаційної роботи. Наведені в рукописі результати підрозділів 4.1 та 4.2 отримані у співробітництві з кандидатом біологічних наук Багнюковою Т.В. Разом із співавторами підготовлені рукописи опублікованих статей.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: III міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 1999 р.); звітно-наукових конференціях Прикарпатського університету ім. В. Стефаника (Івано-Франківськ, 2001, 2002); VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей та 2 тез доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, трьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 152 сторінках машинописного тексту та містить 33 рисунки і 11 таблиць. Список літератури складається з 255 джерел і розміщений на 25 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. У першому розділі роботи представлено огляд літератури за темою оксидативний стрес та регуляція антиоксидантної системи Escherichia coli. Обговорюються механізми генерації АФК в клітині, їх роль в метаболізмі та наводяться загальні відомості щодо антиоксидантної системи. В окремому підрозділі наводяться молекулярні характеристики та властивості каталази кишкової палички. Особлива увага приділена характеристиці регулонів оксидативного стресу E. coli. Сучасні дані стосовно регуляції регулонів кишкової палички SoxRS, OxyR та RpoS підсумовані у вигляді схеми.
Об'єкт, матеріали та методи досліджень. В роботі використовували наступні штами E. coli: KS400 (дикий тип К12, metB), АВ1157 (дикий тип К12, F- thr-1 leuB6 proA2 his-4 thi-1 argE2 lacY1 galK2 rpsL supE44 ara-14 xyl-15 mtl-1 tsx-33), МР180 (дикий тип К12, HfrH thi-1), UM120 (МР180 katE12::Tn10), UM202 (МР180 katG17::Tn10), В23 (дикий типВ), MC41000 (araD139 relA1 thi rpsL150 flbB5301 D(lacU139) deoC7 ptsF25) та GS071 (MC41000 DsoxRS-zjc2205 zjc2204::Tn10kan). Бактерії вирощували за умов глибинного культивування (умови наближені до анаеробних) та в середовищі, барбітованому стерильним повітрям (аеробні умови) або медичним киснем (оксигенація). Після досягнення культурою необхідної фази росту клітини збирали центрифугуванням, двічі промивали 50 мМ калій-фосфатним буфером з 0,5 мМ ЕДТА (рН 7,0) та ресуспендували у тому ж буфері. Для одержання гомогенату клітин бактерії руйнували ультразвуком, отримані суспензії центрифугували. У дослідженнях використовували супернатант. Для вивчення впливу оксидативного стресу аеробну культуру в експоненційній фазі росту інкубували з пероксидом водню або феназинметасульфатом.
Ферментативну активність визначали спектрофотометричним методом при температурі 25°С. Каталазну (КФ 1.11.1.6) активність визначали в нативних клітинах та на різних етапах їх руйнування: після заморожування-розморожування, в суспензії після заморожування та обробки ультразвуком, а також в супернатанті після центрифугування зруйнованих клітин. Розпад пероксиду водню реєстрували при довжині хвилі 240 нм [Aebi H., 1984]. Пероксидазну (КФ 1.11.1.7) активність визначали при довжині хвилі 436 нм модифікованим методом Клейборна та ін. [Claiborn A. еt al., 1979]. Супероксид-дисмутазну (СОД, КФ 1.15.1.1) активність визначали при 406 нм модифікованим методом Костюк та ін. [Костюк В.А. и др., 1990]. Глутатіон-редуктазну (КФ 1.6.4.2) та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) активність оцінювали при 340 нм за кількістю використаного та утвореного НАДФН відповідно [Lushchak V.I. et al., 2001]. Концентрацію білка в пробах визначали, використовуючи барвник кумасі яскраво-синій G-250 [Bradford M.M., 1976].
Вміст карбонільних груп у білках супернатанту зруйнованих ультразвуком клітин визначали за їх взаємодією з динітрофенілгідразином. Визначення проводили спектрофотометричним методом при довжині хвилі 370 нм [Lenz A.G. et al., 1989]. Вміст ТБК-активних продуктів визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 535 нм [Rice-Evans C.A. et al., 1991]. Статистичну обробку проводили за допомогою комп'ютерної програми "Mynova", а аналіз кінетичних параметрів – програми "Kinetics" [Lushchak V.I. et al., 1998].
Результати та їх обговорення
Активність антиоксидантних ферментів E. coli за різних умов забезпеченості киснем. Штами Escherichia coli KS400 та АВ1157 відрізняються за багатьма генетичними характеристиками, що зумовлює їх різну чутливість до наявності кисню в середовищі культивування. Умови оксигенації є найсприятливішими для росту E. coli KS400 в порівнянні з умовами глибинного культивування та аерації. Так, в експоненційній фазі час подвоєння кількості клітин цього штаму за різних умов культивування становив: 102 хв (глибинне культивування), 57 хв (аерація), 44 хв (оксигенація). На відміну від E. coli KS400, культура АВ1157 не виявила ознак росту за умов оксигенації. Час подвоєння кількості клітин E. coli АВ1157 за умов обмеженого доступу кисню та аерації складав відповідно 173 хв і 79 хв. Відмінності у толерантності до кисню досліджених штамів, можливо, пояснюються різною потужністю їх систем захисту від АФК, генерація яких є результатом аеробного метаболізму [Skulachev V.P., 1997; Fridovich I., 1998]. Так, СОД, каталазна і пероксидазна активність E. coli KS400 в середньому була в 1,5-2,0 рази вищою, ніж АВ1157, незалежно від умов культивування та фази росту культури (табл. та 2). Ці результати добре відповідають показникам вмісту окиснених ліпідів (рівень ТБК-активних продуктів), які були в 1,5-3,0 рази нижчими в E. coli KS400 порівняно з АВ1157. Аерована культура E. coli АВ1157 в експоненційній фазі росту характеризувалася також більшими в 1,7 рази кількостями карбонілбілків. В стаціонарній фазі цей показник був у 2-3 рази нижчим у 1 E. coli АВ1157 порівняно з KS400. Крім того, кількість ТБК-активних продуктів
незмінно зростала зі збільшенням рівня кисню впродовж усього періоду росту культур обох досліджуваних штамів, на відміну від вмісту карбонілбілків. Отже, можна стверджувати, що концентрації ТБК-активних продуктів у E. coli АВ1157 є вищими незалежно від умов культивування та
Таблиця 1
Активність антиоксидантних та спряжених з ними ферментів E. coli KS400 в експоненційній та стаціонарній фазах росту культури за різних умов культивування
Активність Умови культивування
Глибинне культивування Аерація Оксигенація
Експоненційна СОД (од/хвЧмг білка) КАТ (мкмоль/хвЧмг білка) ПР (DОД436/хвЧмг білка) ГР (мкмоль/хвЧмг білка) Г6ФДГ (мкмоль/хвЧмг білка) Стаціонарна СОД (од/хвЧмг білка) КАТ (мкмоль/хвЧмг білка) ПР(DОД436/хвЧмг білка) ГР (мкмоль/хвЧмг білка) Г6ФДГ (мкмоль/хвЧмг білка) 25,1±4,3 18,8±2,9 0,27±0,02 0,075±0,011 0,018±0,004 44,7±6,5* 22,2±0,8 0,45±0,02* 0,077±0,012 0,010±0,002 44,9±5,8г 15,3±1,7 0,51±0,03г 0,079±0,006 0,024±0,006 85,2±3,6*,г 41,5 ±3,6*,г 0,83±0,14*,г 0,111±0,022 0,015±0,002 97,4±13,4г,а 11,6±1,8г,а 0,62±0,04г,а 0,071±0,012 0,040±0,008г 143,9±26,1г,а 25,8±4,1*,а 0,87±0,17 г 0,115±0,031 0,028±0,005г,а
Примітки: *Достовірно відмінне від значень для експоненційної фази та від значень для відповідної фази росту культури в умовах глибинного культивування (г) та аерації (а), P < 0,05. Результати представлені як середнє ± похибка середнього, n =3-4. СОД– супероксиддисмутаза, КАТ– каталаза, ПР– пероксидаза, ГР– глутатіонредуктаза, Г6ФДГ– глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа.
фази росту культури порівняно зі штамом KS400, а кількість карбонільних груп білків може змінюватись залежно від доступності кисню та часу культивування бактерій.
Таким чином, на відміну від E. coli АВ1157 штам KS400 характеризується
Таблиця 2
Активність антиоксидантних та спряжених з ними ферментів E. coli АВ1157 в експоненційній та стаціонарній фазах росту культури за різних умов культивування
Активність Умови культивування
Глибинне культивування Аерація
Експоненційна СОД (од/хвЧмг білка) КАТ (мкмоль/хвЧмг білка) ПР (DОД436/хвЧмг білка) ГР (мкмоль/хвЧмг білка) Г6ФДГ (мкмоль/хвЧмг білка) Стаціонарна СОД (од/хвЧмг білка) КАТ (мкмоль/хвЧмг білка) ПР (DОД436/хвЧмг білка) ГР (мкмоль/хвЧмг білка) Г6ФДГ (мкмоль/хвЧмг білка) 16,3±3,8 14,1±0,5 0,17±0,01· 0,045±0,003 · 0,024±0,001 38,3±4,7* 13,6±0,5· 0,35±0,01*,· 0,062±0,011 0,020±0,004· 31,8±3,4г,· 9,0±1,3г, · 0,32±0,05г, · 0,042±0,002· 0,034±0,006 67,0±8,9*,г 34,9 ±6,3*,г 1,07±0,06*,г 0,056±0,012· 0,024±0,002
Примітки: *Достовірно відмінне від значень для експоненційної фази та від значень для відповідної фази росту культури в умовах глибинного культивування (г). ·Достовірно відмінне від відповідних значень для штаму KS400 з P < 0,05. Результати представлені як середнє ± похибка середнього, n = 4. Скорочення як у табл. 1.
потужнішою антиоксидантною системою, яка дозволяє зберігати оксидантний статус клітини на необхідному рівні. Це, ймовірно, забезпечує ріст E. coli KS400 за умов оксигенації. При цьому глутатіонредуктазна і Г6ФДГ активність була подібною в обох досліджуваних штамах і мало залежала від умов культивування, що може підтверджувати незначну роль глутатіону як антиоксиданту в E. coli [Gonzalez- Flecha B. et al., 1997].
Ферменти, активності яких вивчали, належать до двох регулонів E. coli, чутливих до оксидативного стресу: СОД і Г6ФДГ є членами регулону SoxRS, а каталаза, пероксидаза, глутатіонредуктаза – регулону OxyR [Storz G. et al., 2000; Zheng M. et al., 2000]. Каталаза, пероксидаза і глутатіонредуктаза одночасно входять і до регулону RpoS, який контролюється альтернативним sS фактором (субодиниця РНК-полімерази), регулятором глобальної відповіді кишкової палички на різні стреси в стаціонарній фазі [Loewen P.C. et al., 1994; Hengge-Aronis R., 1996]. Зміна активності ферментів регулонів SoxRS, OxyR і RpoS зі збільшенням рівня кисню була подібною в експоненційному і стаціонарному періодах росту культур обох штамів (табл. 1 і 2). Зростання пероксидазної
активності E. cоli KS400 і АВ1157 в експоненційній фазі внаслідок збільшення рівня кисню в середовищі вирощування може свідчити про активацію киснем регулону OxyR, оскільки sS фактор контролює резистентність бактерій до оксидантів у стаціонарній фазі росту культури [Hengge-Aronis R., 1993; Gort A.S. et al., 1999; Schellhorn H.E. et al., 1998]. Каталазна і пероксидазна активність зросла також у відповідь на збільшення рівня кисню в середовищі культивування бактерій обох штамів і в стаціонарній фазі. Це дозволяє висловити припущення про активацію киснем sS фактора, так як експресія OxyR в стаціонарній фазі є мінімальною [Gonzalez-Flecha B. et al., 1999; Michan C. et al., 1999].
Вміст окиснених білків і ліпідів у E. coli за дії оксидативного стресу. Важливим біологічним аспектом дії АФК на клітину є їхня взаємодія з ліпідами і білками [Stadtman E.R., 1997; McCord J.M., 1998; Fridovich I., 1998]. В залежності від способу індукції оксидативного стресу можуть змінюватись типи білків, які зазнають модифікації [Lu Z. et al., 1998; Tamarit J. et al., 1998]. Проте, до цього часу не було проведено одночасної кількісної оцінки
інтенсивності окиснення білків і ліпідів внаслідок дії АФК у бактерій. В даній роботі вперше комплексно оцінено рівень продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у бактеріях, як результат впливу оксидативного стресу. На рис. 1 показано динаміку вмісту карбонільних груп білків (А) і
|
