|
ІНСТИТУТ БОТАНІКИ ІМ. М. Г. ХОЛОДНОГО
НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ
Курченко Ірина Миколаївна
УДК 632.4 : 633.11 : 582.288.45
Морфолого-культуральні та фізіологічні особливості
FUSARIUM OXYSPORUM (SCHLECHT.) SNYD. ET HANS. SENSU LATO
03.00.21 - мікологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жданова Неллі Миколаївна, Інститут
мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії
Наук України, зав. відділом фізіології та систематики мікроміцетів
Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, Корнійчук Микола Сергійович,
Інститут землеробства Української Академії Аграрних Наук, зав. відділом
захисту рослин
кандидат біологічних наук, Андріанова Тетяна Володимирівна, Інсти-
тут ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії Наук України,
старший науковий співробітник відділу мікології
Провідна установа: Національний аграрний університет, кафедра фітопатології,
Міністерство освіти України, м. Київ.
Захист відбудеться “ 26 ” квітня 1999 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.211.01 Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії Наук України за адресою:
м. Київ, 252601, МСП - 1, вул. Терещенківська, 2
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії Наук України за адресою:
м. Київ, 252025, вул. Велика Житомирська, 28
Автореферат розісланий 14 березня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Ільїнська А.П.
Актуальність теми. Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans. - широко розповсюджений фітопатоген, який активно завойовує життєвий простір. Він здатний уражувати близько 150 видів вищих рослин та сапротрофно існувати в грунті (Wollenweber, Reinkling, 1935; Райлло, 1950; Gordon, 1960; Booth, 1971; Matuo, 1972; Билай, 1977; Nelson. et al., 1981; Gerlach, Nierenberg, 1982). Цей вид давно є об’єктом вивчення фітопатологів, які характеризували, в основному, його фітопатогенні властивості (Расулев, Тагирова, 1974; Сидорова, Акмударов, 1980; Широков, Масленкова, 1981; Суздальская и др., 1983). Менш вивчена екологія популяцій цього виду (Левитин, 1982; Портянкин и др., 1988; Левитин, Гагкаева, 1991; Мурашева, 1996).
Виділення варіантів F. oxysporum за різними класифікаційними системами основане на морфологічних ознаках (Райлло, 1950; Booth, 1971; Nelson, Tousson, Marasas, 1983). Деякі автори визнають тільки вид F. oxysporum (Matuo, 1972), інші - основний вид і один його варіант - F. oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans. var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai (Билай, 1977).
Щодо фізіології F. oxysporum, то є відомості про ріст цього виду в умовах, жорстко лімітованих за джерелом вуглецю органічної природи (Woronick, Johnson, 1960; Quereshi, Pag, 1970; Mirocha, de Vay, 1971; Tribe, Mabadeje, 1972; Hasselbring et al., 1975; Schinner, Consin, 1981; Wainwright, 1988; Parkinson et al., 1990; Windels et al., 1993; Gorbushina et al., 1994).
Таким чином, проблеми спеціалізації щодо ураження певної рослини, особливості розповсюдження, екології та фізіології такого фітопатогена, як F. oxysporum актуальні, а вивчення його в цих напрямках є доцільним.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, зокрема з темами: “Вивчення мікроміцетів еконіш антропогенного походження; їх видовий склад, еколого-фізіологічні властивості, біологічна активність при трансформуванні труднодоступних субстратів з метою одержання високоактивних штамів та їх метаболітів” (№ державної реєстрації 0196U021674) та “Еколого-систематичне та фізіологічне вивчення мікроміцетів як основа створення перспективних біотехнологій” (№ державної реєстрації 0196U018115), а також грантами Державного фонду фундаментальних досліджень (№ 01.11.07/001-92, 5.3/58, 5.4/109). Дисертаційна робота Курченко І.М. була підтримана Грантом Соросівського Аспіранта № PSU054078 Міжнародної Соросівської програми підтримки освіти в галузі точних наук.
Мета і задачі дослідження.
Метою роботи було визначити адаптаційні можливості популяцій виду F. oxysporum та реалізацію ним типів життєвої стратегії в процесі вивчення ряду морфолого-культуральних та фізіологічних ознак штамів, вилучених з зернових рослин, їх ризосфери та неокультурених грунтів різних регіонів України.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
- Провести порівняльне вивчення морфологічних та культуральних ознак штамів F. oxysporum.
- Визначити фітотоксичну активність досліджуваних штамів.
- Дослідити трофічні особливості штамів F. oxysporum.
- Встановити швидкість лінійного росту штамів F. oxysporum на середовищах різного складу.
- Виявити активність ряду гідролітичних та окисно-відновних ферментів в популяції F. oxysporum.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне дослідження грунтової та паразитуючої на рослині популяцій F. oxysporum з використанням фенотипічного підходу та методів варіаційної статистики.
Статистично доведена більша мінливість морфології конідій штамів F. oxysporum, ізольованих з грунту, порівняно з рослинними. Ознака ширини конідій обох типів у всіх вивчених штамів (210) виявилась більш стабільною, ніж їх довжина.
Дослідження фітотоксичної активності популяції F. oxysporum виявило кращу пристосованість до паразитичного існування у штамів, ізольованих з рослин, завдяки переважанню середнього рівня фітотоксичності в порівнянні з штамами, ізольованими з грунту.
Вперше встановлена надзвичайно широка адаптація 52 вивчених штамів цього виду до концентрацій джерел вуглецю органічної природи в живильному середовищі: від слідових його кількостей в силікагельному середовищі до 20 г / л в максимальних середовищах. Отримані дані про здатність кожного з досліджених штамів F. oxysporum поєднувати в собі ознаки r- і К-типів життєвої стратегії.
Поліморфність F. oxysporum підвищує пристосувальні можливості цього виду. Із зменшенням концентрації джерел вуглецю в середовищі досліджена популяція F. oxysporum зберігала свою життєздатність, але варіювання морфолого-культуральних ознак зменшувалось.
Вивчення ферментативної активності популяції F. oxysporum показало, що на рослинних субстратах провідна роль належить целюлозолітичним ферментам - целюлазі, ендо-1,4-β-ксиланазі та β-глюкозидазі, а в грунті вони поступаються ферментам окисно-відновного комплексу - монофенол-монооксигеназі (тирозиназі, лаказі) та пероксидазі.
В процесі вивчення трофічних особливостей популяції F. oxysporum сформульована гіпотеза, яка пояснює легкий та швидкий перехід всіх вивчених штамів гриба від оліготрофного та сапротрофного до паразитичного способу живлення.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані поглиблюють уявлення про адаптаційні можливості F. oxysporum, зокрема здатність кожного з вивчених штамів рости на звичайних живильних середовищах, існувати в умовах майже повної відсутності джерела вуглецю на силікагелі та уражувати зернові культури, що важливо при розробці питань екстремальної екології грибів. Одержані результати можуть бути використані в селекційній практиці для створення інфекційних фонів та стійких до фузаріозів сортів сільськогосподарських культур, в мікотоксикології, а також для отримання промислово цінних ферментів.
Особистий внесок здобувача. Робота є самостійним дослідженням здобувача, яким проведені морфологічні дослідження 210 штамів F. oxysporum, ізольованих з трьох екотопів на двох середовищах. Визначена фітотоксична активність досліджених культур на проростках пшениці. Культуральні ознаки та швидкість лінійного росту штамів F. oxysporum досліджені на 7 живильних середовищах різного складу. Вивчена ензиматична активність ряду гідролітичних та окисно-відновних ферментів. Отримані експериментальні дані опрацьовані статистично, визначені показники внутрішньопопуляційної різноманітності. Зроблений поглиблений аналіз літератури.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені, доповідалися та обговорювались на Х з’їзді Українського Ботанічного Товариства (Полтава, 1997), Міжнародному Регіональному семінарі “Environment Protection: Modern Studies in Microbiology and Ecology” (Ужгород, 1997), конференціях з фундаментальних досліджень Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (1995, 1996), на мікологічній секції Українського Ботанічного Товариства (1995), конференції, присвяченій пам’яті М.В. Горленко (Росія, 1996), з’їзді Німецького Товариства Мікології та Ліхенології (Регенсбург, 1997), науковому семінарі Інституту ботаніки Регенсбурзького університету “Спеціальна ботаніка” (Німеччина, 1998).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць: 4 статті (“Український ботанічний журнал” та “Мікробіологічний журнал” Національної Академії Наук України, журнал “Микология и фитопатология” Російської Академії Наук) та 3 тез.
Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 181 сторінок машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, висновків, списку використаних джерел (279 найменувань, з них 128 іноземних). Робота ілюстрована 29 таблицями та 19 рисунками.
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури. Він має три розділи, в яких відображені питання таксономії, екології та фізіології природних популяцій F. oxysporum та їх трофічних особливостей.
РОЗДІЛ 2. Матеріали і методи досліджень
2.1. Об’єктами досліджень були 210 штамів F. oxysporum та F. oxysporum var. orthoceras з колекції культур відділу фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, вилучених з уражених зернових культур, окультурених та неокультурених грунтів різних регіонів України. Згодом на основі даних по вивченню морфологічних особливостей їх кількість була обмежена 52 штамами.
2.2. Методи досліджень. Морфологічні особливості популяції F. oxysporum вивчали з використанням методів світлової мікроскопії (Методы..., 1982) та метода мікрокультури (Билай, Элланская, 1975; Методы..., 1982) на середовищі Чапека та безвуглецевому силікагельному середовищі (СС).
Особливості росту та культуральні ознаки 52 штамів F. oxysporum визначали на 7 живильних середовищах різного складу: 3 максимальних - картопляно-глюкозному агарі (КГА), сусло-агарі (СА), борошняному агарі (БА), 3 мінімальних - мінімальному середовищі Чапека з 0.06 г/л сахарози (МСЧ), середовищі Парка з 0.7 г / л глюкози (СП), середовищі на основі грунтової витяжки, розведеної в 10 раз (ГВ), та безвуглецевому силікагельному середовищі (СС). Культури інкубували при 26 ± 2оС. Діаметр колоній штамів вимірювали двічі на добу на максимальних та мінімальних середовищах, на СС - кожної години з початку проростання конідій.
Визначення швидкості лінійного росту у досліджених штамів F. oxysporum проводили за загально відомими методами (Перт, 1978; Методы..., 1982; Шемшур и др., 1989).
Фітотоксичну активність популяцій F. oxysporum вивчали за методом Берестецького (1972) та методикою, розробленою в Інституті захисту рослин УААН (Лесовой и др., 1988).
Наявність деяких гідролітичних (целюлази, ендо-1,4-β-ксиланази, β-глюкозидази, α- і β-амілази) та окисно-відновних ферментів (монофенол-монооксигенази - тирозинази і лакази, та пероксидази) вивчали за методами, розробленими проф. Інституту ботаніки Регенсбурзького університету Х.П. Моліторісом (Molitoris, Schaumann, 1986).
Отримані в роботі кількісні дані були оброблені статистично з використанням показників: середніх квадратичних відхилень, коефіцієнтів варіації, довірчих інтервалів. Були побудовані гістограми та криві нормального розподілу (гаусові криві). Для них визначали критерії відповідності їх закону нормального розподілу λ, а також коефіцієнти асиметрії (As) та ексцесу (Ex) (Лакин, 1973). Були визначені також показники, які дозволили оцінити внутрішньопопуляційну різноманітність та подібність популяцій за поліморфними ознаками: середня кількість фенотипів в популяції (μ), частка рідкісних фенотипів (h), показник подібності популяцій (r) та критерій ідентичності (I) досліджених штамів F. oxysporum (Животовский, 1982).
Розділ 3. Морфолого-культуральні особливості популяцій F. oxysporum (Schlecht.)
Snyd. et Hans., вилучених з грунту та зернових культур
Вивчена мінливість конідіального спороношення 210 штамів F. oxysporum та F. oxysporum var. orthoceras з різних регіонів України. Виявлена значна мінливість їх форми та розмірів. За результатами статистичної обробки даних побудовані гістограми та криві нормального розподілу за такими ознаками: довжина макроконідій, їх ширина; довжина мікроконідій, їх ширина (з урахуванням місцеіснувань вивчених штамів). За допомогою критерію відповідності λ доведено, що розподіл штамів F. oxysporum та F. oxysporum var. orthoceras за цими ознаками підлягає закону нормального розподілу.
Порівняльне дослідження розмірів макро- і мікроконідій штамів F. oxysporum, ізольованих з трьох місцеіснувань - уражених зернових культур, окультурених і неокультурених грунтів, свідчить про те, що в популяціях гриба, незалежно від місця вилучення, траплялись макроконідії з двома - сімома перетинками, але переважали - з трьома перетинками. Амплітуда мінливості розмірів конідій не перевищувала меж, характерних для виду (Билай, 1977; Райлло, 1950; Booth, 1971; Gerlach, Nirenberg, 1982), і була дещо більшою серед грунтових штамів (табл. 3.1). Значення коефіцієнтів варіації довжини і ширини макроконідій були більшими у грунтових штамів, ніж у штамів, ізольованих з рослин (табл. 3.1).
Таблиця 3.1 - Мінливість довжини та ширини макроконідій штамів Fusarium oxysporum з
різних місцеіснувань (середовище Чапека)
Встановлено, що згідно з коефіцієнтами варіації довжина та ширина мікроконідій - стабільніші ознаки, ніж довжина і ширина макроконідій. Амплітуда мінливості довжини мікроконідій практично однакова у штамів з різних місцеіснувань, а ширини - більша у штамів з уражених рослин (табл. 3.2).
Таблиця 3.2 - Мінливість довжини та ширини мікроконідій штамів Fusarium oxysporum з
різних місцеіснувань (середовище Чапека)
Частка рідкісних морф (h) за ознаками довжини макро- і мікроконідій збільшувалась з наростанням несприятливих умов від рослинних штамів до штамів з неокультурених грунтів (довжина макроконідій: 0.091±0.055 для штамів з рослин, 0.151±0.046 - з окультурених та 0.252±0.054 - з неокультурених грунтів; довжина мікроконідій: 0.133±0.059, 0.250±0.045 та 0.215±0.042 відповідно), тобто вид проявляє велику здатність до виживання в таких умовах. Частка рідкісних морф за ознакою ширини макроконідій майже не відрізнялась в усіх штамів F. oxysporum (0.130±0.065, 0.167±0.048 та 0.101±0.038 відповідно), за шириною мікроконідій вона зменшувалась в напрямку погіршення умов існування - від штамів з рослин (0.474±0.087) до грунтових штамів (0.359±0.050 - з окультурених та 0.277±0.046 - з неокультурених грунтів).
На основі значень показників подібності та критеріїв ідентичності за довжиною і шириною макроконідій вивчені штами подібні, але штами, вилучені з рослин, відрізняються від грунтових. За довжиною мікроконідій вивчені групи штамів подібні, а за їх шириною штами зернових культур достовірно відрізняються від грунтових (табл. 3.3).
Таблиця 3.3 - Показники подібності (r) та критерії ідентичності (І) штамів F. oxysporum,
вилучених з зернових рослин (1), окультурених (2) та неокультурених (3)
грунтів, за дослідженими ознаками
Примітка. * - довжина і ширина макро- та мікроконідій на середовищі Чапека.
Таким чином, довжина та ширина мікроконідій виявились стабільнішими ознаками, ніж довжина і ширина макроконідій. За вивченими ознаками штами, ізольовані з рослин, відрізнялись від грунтових штамів. Найбільшою мірою це проявилось за шириною мікроконідій. Ознака ширини конідій обох типів у всіх вивчених штамів виявилась більш стабільною, ніж їх довжина. Мікроконідії штамів, вилучених з грунту (особливо неокультуреного), були більшими порівняно з мікроконідіями штамів, ізольованих з зернових культур.
Встановлено, що в екстремальних умовах існування на силікагельному середовищі при слідових кількостях джерела вуглецю досліджені штами F. oxysporum проходили всі стадії онтогенезу, включаючи утворення мікроконідій, але макроконідії в таких умовах не утворювались. Третина штамів мали лише поодинокі мікроконідії (табл. 3.4), що, можливо, є відповіддю організму на жорсткі умови існування. Розміри мікроконідій майже половини досліджених штамів F. oxysporum були достовірно меншими, порівняно з відповідними на максимальному середовищі Чапека, причому більшою мірою це проявлялось за ознакою їх довжини. Виявлена також група штамів, на розміри мікроконідій яких, не вплинули умови існування на силікагельному середовищі (8 - з зернових рослин, 7 - з окультурених та 9 - з неокультурених грунтів). Достовірні відмінності між розмірами їх мікроконідій на оптимальному
Таблиця 3.4 - Мінливість довжини та ширини мікроконідій штамів Fusarium oxysporum
з різних місцеіснувань (безвуглецеве силікагельне середовище)
та силікагельному середовищах статистично не виявлені. Це свідчить про наявність в кожній з досліджених популяцій високо резистентних штамів стосовно зміни концентрації джерел вуглецю органічної природи. Кількість їх становила більше 50 % в кожному випадку і не залежала від місцеіснування. На ширину мікроконідій грунтових штамів не вплинула майже повна відсутність джерела вуглецю в середовищі. Силікагельне середовище частково вплинуло на ширину мікроконідій штамів з рослин. Приблизно в половині випадків значення ширини мікроконідій достовірно не відрізнялись від відповідних на оптимальному середовищі, інша половина була достовірно ширшою, або достовірно вужчою. Виявлена мінливість в однаковій мірі була притаманна F. oxysporum та F. oxysporum var. orthoceras.
Для характеристики структури популяції F. oxysporum значення мають культуральні ознаки, які вивчали на 7 живильних середовищах різного складу: 3 максимальних (СА, КГА, БА), 3 мінімальних (СП, ГВ, МСЧ) та силікагельному середовищі (СС).
За фактурою та забарвленням колоній на КГА грунтові штами виявились більш подібними між собою та відрізнялись від штамів з рослин. На інших максимальних, мінімальних та силікагельному середовищах відмінності між дослідженими штамами з різних місцеіснувань були відсутні. За цими ознаками вивчені штами F. oxysporum, вилучені з різних місцеіснувань, на багатих середовищах були різноманітнішими, ніж на голодних.
РОЗДІЛ 4. Фітотоксична aктивність штамів Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et
Hans., ізольованих з грунту та зернових культур
Фітотоксичну активність 52 штамів F. oxysporum, вилучених з різних місцеіснувань, досліджували за методом О.О. Берестецького (1972). Більшість вивчених штамів пригнічували розвиток кореневої системи проростків пшениці більш ніж на 30 % і тільки у п'яти грунтових штамів вона була дещо нижчою (20 - 30 %). За фітотоксичною активністю штами F. oxysporum були віднесені нами до трьох груп: нетоксичні та слаботоксичні (0 - 30 %), середньотоксичні (30 - 50%) та високотоксичні (50 - 70 %). Фітотоксичну активність вище 70 % досліджені штами з різних місцеіснувань не проявляли. Серед штамів, ізольованих з рослин, нетоксичні були відсутні, а кількість середньотоксичних (11 штамів) була в 2 рази більшою, ніж високотоксичних (6 штамів). Серед грунтових штамів в усіх типах грунтів переважали високотоксичні (по 13 штамів).
Фітотоксична активність штамів з рослин змінювалась в межах 31,1 - 62,2 %. У штамів з окультурених та неокультурених грунтів ця ознака варіювала в межах 22,0 - 66,7 % та 21,7 - 70,3%, відповідно.
Визначення коефіцієнтів варіації показало, що штами з уражених зернових культур проявили меншу мінливість за ознакою фітотоксичної активності порівняно з грунтовими. Штами з окультурених та неокультурених грунтів практично не відрізнялись між собою за значеннями коефіцієнту варіації (С - 24,41 % та 27,15 %), але значно перевищували відповідні значення для штамів з рослин (С - 15,33 %).
Таким чином, оцінка значень коефіцієнтів варіації, а також амплітуди мінливості фітотоксичної активності штамів F. oxysporum свідчить про те, що у рослинних штамів мінливість за цією ознакою виражена слабше, ніж у грунтових.
Визначення показників подібності (r), які є мірою попарної подібності популяцій і які можна розглядати як частоту спільних морф в порівнюваних групах, і критеріїв ідентичності (I) трьох груп штамів F. oxysporum показало, що за ознакою фітотоксичної активності грунтові штами більше подібні між собою та достовірно відрізнялись від штамів з рослин (табл. 3.3).
У штамів, вилучених з окультурених грунтів та уражених зернових культур, виявлено однакову кількість фенотипів (μ - 4.484±0.632 та 4.465±0.354 відповідно), в неокультурених грунтах їх кількість була більшою (5.185±0.499). Частка рідкісних фенотипів, яка відображає структуру популяції в кожному з місцеіснувань, була найменшою у штамів з окультурених грунтів (h - 0.107±0.071), більшою - у штамів з неокультурених грунтів (0.136±0.083), а у штамів з рослин кількість їх майже в 2 рази перевищувала таку перших двох груп (0.253±0.105). Таким чином, місцеіснування вивчених нами штамів F. oxysporum не впливало на величину показників внутрішньопопуляційної різноманітності. Внесок рідкісних морф в склад популяції F. oxysporum був найбільшим на рослині та значно меншим - в грунті. Ми припускаємо, що вид F. oxysporum еволюціонує в напрямку до паразитизму на рослині і тому йому конче необхідний значний потенціал рідкісних фенотипів для успішного освоєння рослинного субстрату.
Більшість штамів F. oxysporum проявили значну фітотоксичну активність. Серед грунтових ізолятів домінували високотоксичні, що може бути пов’язане з необхідністю витримувати конкуренцію з боку численних грунтових організмів в таких умовах. Більшість штамів з рослин були середньотоксичними мабуть тому, що саме цей рівень фітотоксичності забезпечує збалансоване існування обох організмів в системі “паразит - рослина-живитель”.
РОЗДІЛ 5. Особливості росту штамів F. oxysporum, вилучених з грунту та уражених зернових
культур, на живильних середовищах різного складу
- Швидкість росту досліджених штамів на агаризованих середовищах різного складу та
в умовах жорсткої оліготрофії
Досліджені особливості лінійного росту 52 штамів F. oxysporum на 3 максимальних, 3 мінімальних та безвуглецевому силікагельному середовищі.
Визначення достовірності відмінностей між середніми значеннями швидкості лінійного росту на максимальних і мінімальних середовищах показало, що вони були статистично недостовірними. Саме тому ми вивчили ріст тих же штамів на силікагельному середовищі при наявності слідових кількостей джерела вуглецю органічної природи. У всіх досліджених штамів F. oxysporum була виявлена здатність до росту на безвуглецевому силікагельному середовищі в четвертому пасажі. Інокулюм для кожного наступного пасажу брали з попереднього. Такий прийом забезпечує повне виснаження їх ендогенних субстратів, накопичених в процесі попереднього культивування на оптимальних живильних середовищах (Wainwright, 1988; 1995). Штами F. oxysporum в четвертому пасажі росли на такому середовищі та утворювали мікроконідії в клубочках, хламідоспори в великій кількості, але гіфи міцелію були стоншеними (1.5 - 3.0 мкм в діаметрі), вакуолізованими, жирові включення практично були відсутні.
Найбільшу амплітуду мінливості за швидкістю гіфального росту виявили у штамів, ізольованих з рослин (1.84 - 10.20 мкм / год). Для грунтових штамів вона була дещо меншою: 2.05 - 6.77 мкм / год - у штамів з окультурених та 2.03 - 8.63 мкм / год - з неокультурених грунтів.
Штами з рослин виявились більш мінливими (С - 54.12%) і тому більшою мірою пристосованими до існування в екстремальних умовах росту на силікагельному середовищі. При порівнянні значень дисперсій і коефіцієнтів варіації були встановлені достовірні відмінності в характері варіювання швидкості росту між грунтовими штамами (С - 41.56 та 41.02%) і такими з рослин (Лакин, 1973).
Значення показників подібності (r) та критеріїв ідентичності (I) (табл. 3.3) трьох груп штамів F. oxysporum за ознакою швидкості гіфального росту в умовах жорсткої лімітації за джерелом вуглецю свідчать про більшу подібність штамів з рослин і неокультурених грунтів.
Визначення показників внутрішньопопуляційної різноманітності за кількістю виявлених фенотипів (μ) дозволило встановити, що найменше їх у штамів з неокультурених грунтів (4.486 ± ±0.379), більше - у штамів з рослин (5.185±0.498) та ще більше - штамів з неокультурених грунтів (5.444±0.422) . Внесок рідкісних фенотипів (h) в склад популяції F. oxysporum був найбільшим на рослині (0.136±0.083) та трохи меншим - в грунті (0.093±0.070 та 0.103±0.076 відповідно). Наявність великої кількості рідкісних фенотипів обумовлює кращу пристосованість до виживання в екстремальних умовах штамів, вилучених з рослин, порівняно з штамами з грунту.
Таким чином, на силікагельному середовищі, умови існування на якому можна віднести до екстремальних, відмінності за швидкістю лінійного росту між штамами, вилученими з грунту та зернових рослин, залишались достовірними.
5.2. Прояв біологічних ритмів серед досліджених штамів F. oxysporum. Біологічні ритми притаманні всім рівням організації живої матерії - від молекулярних та субклітинних структур до біосфери. Вивчення біологічних ритмів у грибів привертає увагу багатьох дослідників (Беккер та ін., 1977; 1978; 1981, 1983; Дудченко, 1978; Шаркова, 1971; Мельничук, 1980; Бухало із співавт., 1985; Бухало, 1988). Так, З.Е. Беккер із співавт. (1971; 1977; 1978) встановили наявність 2-3-добових ритмів у деяких видів грибів в умовах глибинного культивування. Цикли у F. oxysporum повторювались двічі та були пов'язані з двома генераціями міцелія.
В ряду вивчених нами штамів F. oxysporum також були встановлені ритмічні зміни швидкості лінійного росту. Більшості з них (36 штамів) були притаманні 1-добові циркадні ритми (табл. 5.1), які були представлені в кожному з трьох місцеіснувань. Однодобові зміни швидкості лінійного росту реєстрували протягом 5 - 9 діб. Виявлено, що швидко затухаючі біоритми (до 3 доби росту) більшою мірою були характерні для грунтових ізолятів, тоді як більш тривалі (до 5 - 9 діб) спостерігали у штамів, ізольованих з рослин, окультурених та неокультурених грунтів, рівною мірою (табл. 5.1).
У дослідженій популяції в 2.3 рази рідше були виявлені також штами з 1-2-добовими ритмічними коливаннями Kr . У штамів з рослин частіше спостерігали тривалі (5 - 9 діб росту) 1-2-добові біоритми (табл. 5.1).
В умовах зменшення концентрації джерела вуглецю на мінімальних середовищах тільки у штамів з рослин збільшувався період коливань Kr, тобто збільшувалась кількість штамів з 1-2-добовими ритмами. Серед грунтових штамів ми не помітили значних відмінностей між контрольним і мінімальними середовищами.
В умовах лімітування за джерелом вуглецю також реєстрували ритмічні коливання максимумів швидкості росту гіф в годинні проміжки часу. Ми розподілили їх за тривалістю на 2 групи: 2-4-годинні та 4-6-годинні. Штами з рослин характеризувалися 4-6-годинними максиму-мами швидкості росту, а у грунтових майже вдвічі частіше проявлялися 2-4-годинні (табл. 5.1).
Виявлене нами явище нерівномірного росту міцелія F. oxysporum на максимальних, мінімальних середовищах та голодному силікагельному середовищі в годинні інтервали потребує більш детального вивчення із застосуванням сучасних біохімічних, цитологічних та генетичних методів досліджень.
Таблиця 5.1 – Біоритми швидкості лінійного росту штамів F. oxysporum на середовищах різного складу
(у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
Висів Час (доба)
РОЗДІЛ 6. Наявність різних груп ферментів у штамів F. oxysporum, вилучених з
зернових культур, окультурених та неокультурених грунтів
Вивчені дві групи ферментів, які відіграють важливу роль в процесі ураження рослин: ферменти обміну вуглецевих сполук, необхідних для розкладу клітинної стінки рослин і проникнення вглиб субстрату, та окисно-відновні ферменти, завдяки яким фітопатоген захищає свій організм та здійснює обмін речовин в клітині рослини-живителя.
6.1. Ферменти обміну вуглецевих сполук.
6.1.1. Целюлаза (3.2.1.4). Встановлено, що штами F. oxysporum, ізольовані з грунту та зернових культур, активно утворюють целюлазу. За шириною зони просвітління ми виділили три групи: 0.5 - 0.9, 1.0 та 1.1 - 2.0 мм.
За якісним проявом целюлазної активності штами, ізольовані з рослин, виявилися активнішими порівняно з грунтовими (табл. 6.1.1) і розмістилися в ряду: Р > ОГ > НГ, де Р - штами, ізольовані з рослин; ОГ - штами з окультурених грунтів; НГ - з неокультурених грунтів.
Таблиця 6.1.1 - Наявність целюлазної активності серед штамів F. oxysporum
(у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
6.1.2. Ендо-1,4-β-ксиланаза (3.2.1.8). Показником рівня ферментативної активності вважали ширину зони просвітління середовища навколо колонії гриба та її інтенсивність у 52-х штамів F. oxysporum (табл. 6.1.2). За шириною зони просвітління виділено 3 групи (табл. 6.1.2). Грунтові штами в 1.5 - 1.8 раз частіше утворювали вузькі зони просвітління (1.5 - 2.5 мм), штами з рослин у більшості мали зони 2.6 - 3.5 мм, а широкі зони - були майже однаково представлені серед штамів з рослин та грунту (табл. 6.1.2). Інтенсивність просвітління середовища не залежала від місцеіснування трьох груп штамів.
Таблиця 6.1.2 - Наявність ендо-1,4-β-ксиланазної активності серед штамів F. oxysporum
( у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
За якісним проявом ендо-1,4-β-ксиланазної активності штами F. oxysporum, ізольовані з рослин, виявилися активнішими порівняно з штамами, вилученими з грунту.
6.1.3. β-Глюкозидаза (3.2.1.21). Було встановлено, що більшість досліджених штамів F. oxysporum утворюють β-глюкозидазу досить активно. Для переважної більшості штамів з грунту більш характерною була чітка (+ та ++) реакція на наявність цього ферменту (табл. 6.1.3). Штами, ізольовані з рослин, в більшості випадків виявляли сильну та дуже сильну реакцію на наявність β-глюкозидази.
Таблиця 6.1.3 - Наявність β-глюкозидазної активності серед штамів F. oxysporum
(у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
Таким чином, за ознакою наявність β-глюкозидази штами F. oxysporum розподілились так само як у випадках з целюлазною та ендо-1,4-β-ксиланазною активністю, тобто Р > ОГ > НГ.
6.1.4. α- та β-амілази (3.2.1.1 та 3.2.1.2). Просвітління середовища було досить інтенсив-ним в усіх випадках, відмінностей між штамами з трьох місцеіснувань не спостерігали. Штами, ізольовані з грунту, утворювали амілази інтенсивніше, ніж штами з рослин (НГ = ОГ > Р).
6.2. Ферменти окисно-відновного комплексу.
6.2.1. Монофенол-монооксигеназа (1.14.18.1). Встановлено, що майже половина штамів, ізольованих з зернових рослин і окультурених грунтів, та третина штамів з неокультурених грунтів виявили тільки слідову тирозиназну активність (табл. 6.2.1). Поряд з цим 40 % досліджених штамів мали чітку реакцію на наявність цього ферменту, і лише у незначної кількості штамів виявили сильну реакцію. Штами з різних місцеіснувань за цією ознакою розподілились в ряду: НГ > ОГ > Р.
Таблиця 6.2.1 - Наявність монофенол-монооксигеназної активності (тирозинази) серед
штамів F. oxysporum (у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
Встановлено, що третина всіх досліджених штамів F. oxysporum під впливом бензидину та сирінгалдазину виявила слідову реакцію щодо лакази. Середня та висока активність лакази виявлена серед штамів, ізольованих з рослин, окультурених та неокультурених грунтів. Розподіл штамів F. oxysporum за активністю лакази повторив тенденцію, виявлену для тирозинази.
6.2.2. Пероксидаза (1.11.1.7). Більшість досліджених штамів F. oxysporum з різних місцеіснувань проявили слідову реакцію на наявність пероксидази, але 35 % штамів була притаманна висока активність такого ферменту (табл. 6.2.2).
При якісному визначенні наявності пероксидази штами, вилучені з неокультурених та окультурених грунтів, знову були активнішими порівняно з штамами з рослин.
Таблиця 6.2.2 - Наявність пероксидазної активності серед штамів F. oxysporum
(у % до загальної кількості кожної з груп штамів)
Таким чином, встановлено, що за наявністю вивчених ферментів, які приймають участь в гідролізі вуглецевих сполук (крім амілази), активнішими були штами, вилучені з зернових рослин. За наявністю досліджених ферментів окисно-відновного комплексу активнішими були штами, ізольовані з неокультурених та окультурених грунтів. З отриманих даних також витікає, що наявність ферментів досліджених нами груп характерна для популяції F. oxysporum в цілому. Поряд з іншими морфолого-культуральними та фізіологічними ознаками це є одним з факторів патогенності та підтримання високої гетерогенності популяції даного виду на сталому рівні.
ЗАКЛЮЧЕННЯ
Виходячи з отриманих експериментальних даних можна говорити про можливі шляхи становлення і розвитку фітопатогенних властивостей в популяції F. oxysporum. Очевидно, що перехід до паразитичного способу життя цього виду не супроводжувався значними змінами в особливостях їх трофіки, морфології та фітотоксичній активності (розд. 3, 4, 5).
Однією з причин такого явища може бути висока адаптація виду F. oxysporum до комплексу умов існування, який включає поєднання сапротрофного і паразитичного способів життя у більшості досліджених штамів. Про високий ступінь надійності F. oxysporum свідчать великий діапазон коливань фітотоксичної активності, мінливість конідіального спороношення, відсутність достовірних відмінностей в швидкості лінійного росту на вивчених оптимальних і мінімальних живильних середовищах, а також здатність до ураження широкого кола рослин-живителів (більше 150 видів) (Гродзинский, 1983; Красникова, 1987).
Дані, отримані в циклі експериментів, пов'язаних з використанням голодного силікагельного середовища, дозволяють розширити наші уявлення про здатність майже кожного з вивчених штамів F. oxysporum проявляти такі різні трофічні можливості, як паразитизм, сапротрофія, крайня олігокарботрофія. Відображенням цього є здатність кожного з штамів уражувати живу рослину пшениці (паразитизм), рости на звичайних живильних середовищах (сапротрофія) та на безвуглецевому силікагельному середовищі (оліготрофія) (розд. 3, 4, 5, 6). Тобто кожний з вивчених штамів F. oxysporum поєднував у собі здатність до реалізації r- та К-типів життєвої стратегії, які проявляються залежно від умов його існування, а досліджуваній популяції притаманні значно ширші пристосувальні можливості, ніж видам грибів, які перейшли до облігатного паразитизму на вищих рослинах і, відповідно, втратили або майже втратили здатність до сапротрофного способу живлення. Види, які мають такі властивості, як F. oxysporum, в ході свого онтогенезу можуть легко й швидко переходити до паразитичного способу життя.
ВИСНОВКИ
- Показаний більший рівень екологічної пластичності штамів F. oxysporum, ізольованих з грунту, порівняно з штамами, вилученими з рослин, шляхом статистичного аналізу спектру їх морфологічних та культуральних ознак. Виявлено, що ознака ширини макро- та мікроконідій у всіх вивчених штамів більш стабільна, ніж їх довжина.
- Встановлено, що переважна більшість досліджених популяцій F. oxysporum (50 штамів) була фітотоксичною. Високотоксичні домінували серед грунтових ізолятів. Висловлене припущення, що високий рівень фітотоксичності є реакцією на необхідність витримувати конкуренцію з боку інших організмів так само, як середньотоксичні властивості забезпечують штамам, вилученим з рослин, збалансоване існування в системі “паразит - рослина-живитель”.
- Дослідженнями показана адаптація вивчених штамів F. oxysporum до широкого діапазону концентрацій джерел вуглецю в середовищі, про що свідчить відсутність статистично достовірних відмінностей швидкості лінійного росту на максимальних та мінімальних живильних середовищах (0.064 ± 0.015 - 0.374 ± 0.031 мм / год). На силікагельному середовищі при відсутності джерел вуглецю органічної природи швидкість лінійного росту залишалась досить високою і становила 1.84 - 10.20 мкм / год, відрізняючись від такої на максимальних та мінімальних середовищах лише на 1 - 2 порядки.
- Динаміка швидкості лінійного росту досліджених штамів F. oxysporum змінювалась ритмічно. Найбільш поширеними серед досліджених штамів виявились довготривалі (5 - 9 діб культивування) 1-добові ритми. Штамам з рослин більшою мірою були притаманні 1-2-добові біоритми тривалістю до 5 - 9 діб. Відмінності між вивченими групами штамів F. oxysporum виразніше проявились на силікагельному середовищі. Штами з рослин характеризувалися 4-6-годинними ритмами, грунтові - 2-4-годинними.
- Встановлено, що всі популяції F. oxysporum надзвичайно широко пристосовані до різних концентрацій джерел вуглецю в середовищі, які змінювались в межах 4-5 порядків. Вивчені штами F. oxysporum росли та утворювали спороношення в умовах олігокарботрофії. На силікагельному середовищі більша гетерогенність була притаманна штамам, ізольованим з зернових рослин, що дає їм перевагу в екстремальних умовах існування.
- Штами, вилучені з рослинних субстратів, відрізняла висока активність целюлази, ендо-1,4-β-ксиланази та β-глюкозидази. За ступенем активності цих ензимів вивчені штами розподілились таким чином: рослинні штами (Р) > штами з окультурених грунтів (ОГ) > штами з неокультурених грунтів (НГ). За проявом активності окисно-відновних ферментів (монофенол-монооксигенази та пероксидази) спостерігали протилежну тенденцію, активнішими виявились грунтові штами: НГ > ОГ > Р.
- Доведено, що перехід до паразитичного способу життя виду F. oxysporum не супроводжується значними змінами в його трофіці, морфології та фітотоксичній активності, що дозволяє йому уражувати живу рослину пшениці (паразитизм), рости на звичайних живильних середовищах (сапротрофія) та безвуглецевому силікагельному середовищі (олігокарботро-фія). Надзвичайно широкий діапазон трофічної пристосованості дає можливість штамам цього виду реалізувати r- або К-тип життєвої стратегії в залежності від заданих умов. Така здатність надає цьому виду значні переваги порівняно з облігатними паразитами та забезпечує досить легкий перехід до паразитичного способу життя в процесі його онтогенезу.
Список опублікованих праць
1. Курченко І. М., Елланська І. О., Соколова О. В. Варіабільність конідіального спороношення ізолятів Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., що були виділені з місцезаселень з різним рівнем антропогенного навантаження // Український ботанічний журнал. - 1996. - 53, № 3. - С. 207 - 214.
- Курченко И. Н., Жданова Н. Н., Шупикова О. И., Элланская И. А., Соколова Е. В. Фитотоксическая активность штаммов Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., изолированных из почвы и зерновых культур // Микробиологический журнал. - 1996. - 58, № 2. - С. 33 - 39.
- Курченко И. Н., Жданова Н. Н., Элланская И. А., Соколова Е. В. Особенности линейного роста штаммов Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., выделенных из почвы и пораженных зерновых культур // Микробиологический журнал. - 1996. - 58, № 5. - С. 35 - 44.
- Жданова Н. Н., Курченко И. Н., Элланская И.А., Соколова Е.В. Трофические особенности штаммов Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., изолированных из почвы и зерновых культур // Микология и фитопатология. - 1997. - 31, № 2. - С. 39 - 46.
- Kurchenko I., Zhdanova N., Sokolova E., Ellanskaya I. The investigation of species structure of Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans. // Proceedings of the International regional seminar “Environment protection: modern studies in ecology and microbiology”, Ukraine, Uzhgorod - 1997 (may 13 - 16). - v. 2. - P. 130 - 132.
- Жданова Н.М., Курченко І.М., Соколова О.В., Елланська І.О. Трофічні особливості штамів Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., ізольованих з різних місцезаселень // Матеріали Х з’їзду УБТ “Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття” (Полтава, 22 - 23 травня 1997 р.) - Тез. доп. : Київ - Полтава, 1997. - С. 93.
- Zhdanova N.M., Sokolova E.V., Kurchenko I.M. Untersuchung der Populationsstruktur von Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans. anhand verschiedener Merkmale// Abstracts der Poster der Tagung der Gesellschaft fьr Mykologie und Lichenologie (Regensburg, 24.10 - 26.10. 1997). - S. 63.
| 
