Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

МЕЛЬНИЧУК Сергій Дмитрович

УДК 577.192.3:619:612.015:3:616-089.5

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ДІЇ ВУГЛЕКИСЛОТИ НА РОЗВИТОК ТА ПІДТРИМАННЯ ГІПОБІОТИЧНОГО СТАНУ ТВАРИН

03.00.04 – біохімія

А в т о р е ф е р а т

на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії тварин Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України

Науковий консультант – доктор медичних наук, професор

Фурманов Юрій Олександрович,

                                               Інститут хірургії і трансплантології

                                               АМН України, завідувач відділу

Офіційні опоненти:        доктор біологічних наук, членкор НАН України

       Донченко Георгій Вікторович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу коферментів

       доктор медичних наук, професор, академік НАН України Грищенко Валентин Іванович,

       Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор

       доктор біологічних наук, професор

       Калачнюк Григорій Іванович, Львівська

       національна академія ветеринарної медицини

       ім. С.З. Гжицького, професор кафедри органічної і неорганічної хімії, директор НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивно-сті тварин

Провідна установа –        Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 27 грудня 2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради  Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9

Автореферат розісланий 26 листопада 2004 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук        Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення молекулярних механізмів переходу і перебу­ван­ня тварин та інших видів живих організмів у стані природного й штучного зни­жен­ня життєдіяльності (анабіоз, гіпобіоз, гібернація, естивація, торпідний стан тощо) належить до десяти найактуальніших наукових проблем біології початку ХХІ століття (“Дойчланд”, № 3, 1999). Такий висновок німецьких науковців є своєрідним узагаль­ненням результатів опитування з цього питання багатьох видатних вчених сучасності.

Наукові пошуки у вказаному напрямі мають надзвичайно важливе значення для розробки нових та модифікації існуючих способів консервування біологічних об'єктів (клітин, тканин, органів, організмів), загального знеболення організму, бо­ротьби з хворобами тварин і людей, вирішення ряду проблем стосовно пере­бування людей в екстремальних умовах (під водою, під землею, у космосі тощо).

Найвідоміші фізіолого-біохімічні досягнення минулого століття у вивченні даної проблеми пов'язані з дослідженнями М.І. Калабухова, О.В. Палладіна, Р.В.Чагов­ця, Я.В. Бєліка, І.В. Смірнова, П.В. Шмідта, В.І.Грищенка, А.М. Білоуса, А.М. Гол­довського, Г.Ф. Жегунова, Н.С. Пушкаря, Е.З. Емірбекова, Д.О.Мель­ни­чука, В.О. Михайлівського, W. Dawson, G.Heldmaier, A. Malan, N.Stewart, K. Storey, J.Wang та ін. Вони свідчать, що основними факторами, які обумов­люють перехід організму у стан гіпобіозу є різкі температурні перепади у навко­лиш­ньому середовищі (холод, спека) і пов’язаний з цим дефіцит води та корму. Завдяки одержаним знанням сформувалися такі нові галузі науки, як кріобіологія, кріомедицина тощо, успіхи яких незаперечні.

Ще у позаминулому столітті було встановлено, що зміна складу газової атмос­фе­ри (у першу чергу, зміна вмісту СО2 і О2), також є фактором, який зумов­лює пере­хід організму в стан гіпобіозу. Доведено, що комбінація факторів холоду й гіпер­кап­нії значно посилює кінцевий ефект (В.Е.Маршак, 1969). Проте резуль­тати дослі­джень стосовно вуглекислотного гіпобіозу тривалий час залишалися без на­леж­ної уваги. Роль вуглекислоти в регуляції метаболізму в організмі тварин було з’ясовано порівняно недавно – у другій половині минулого століття, коли були детально вив­чені механізми реакцій декарбоксилювання та карбокси­лю­вання певних метаболітів у тканинах тварин та встановлена  значущість згаданих реакцій у проце­сах біосинтезу та біоенергетики. Тоді й виникла потреба знову повернутиcя до проблеми вивчення ролі та механізмів впливу вуглекислоти на процеси обміну речовин у тварин у стані гіпобіозу (H.G. Wood, C.H. Werkman, М.Ф. Гулий, Д.О.Мель­ничук, A. Malan, Н.М. Гула, В.О. Михайлівський, С.П. Роговський, С.Д.Мельничук).

Зв’язок робот із науковими програмами, планами, темами. У 1996-1997 роках експериментальні дослідження за темою дисертаційної роботи вико­ну­валися у відділі біохімії ліпідів (зав. відділу – членкор НАН України Н.М. Гула), а також у відділі регуляції обміну речовин (в.о. зав. відділу – канд. біол. наук В.О.Михай­лів­ський) Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України у рамках науково-технічної програми: “Механізми метаболічної адаптації і шляхи корекції їх порушень в організмі тварин і людини” (номер державної реєстрації: 0194U135507).

З 1997 року і по теперішній час робота ведеться в проблемній науково-дослідній лабораторії “Біохімія гіпобіозу тварин” (зав. лабораторії – канд. біол. наук С.Д.Мель­ничук), що функціонує на базі кафедри біохімії тварин Націо­нального аграрного університету України, та в інших установах у межах тем: “Вивчення молекулярних механізмів розвитку гіпо­біотичного стану тварин та його моделювання” (№ державної реєстрації 0197U007141), “Вивчення впливу різних форм вуглекислоти на розвиток стану штучного гіпобіозу та розробка технологій переведення організму тварин, тканин та клітин в стан штучного гіпобіозу” (№ державної реєстрації 0103U005378), а також у рамках теми: “Розробка та впровадження системи кріоконсервації та збереження сперми плідників великої рогатої худоби в умовах штучного гіпобіозу” (№ державної реєстра­ції 0196U013527, з 1998 року – 0198U004071).

Мета і задачі дослідження. Основною метою роботи було з’ясувати моле­кулярно-біохімічні механізми дії основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3–) на основні ланки обмінних процесів у динаміці розвитку, підтримання та виходу тварин із стану природного гіпобіозу, а також на основі результатів молекулярно-біохімічних й клінічних досліджень розробити моделі і ефективні шляхи засто­сування явища штучного гіпобіозу біологічних об’єктів для вирішення важливих проблем тваринництва й медицини.

Для досягнення вказаної мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. вивчити молекулярно-біохімічні особливості та встановити законо­мір­ності щодо змін концентрації протонів, вмісту СО2, НСО3– і О2 у крові та температури тіла тварин (крапчасті ховрахи) у стані природ­ного гіпобіозу (в динаміці етапів його розвитку, підтримання та виходу з нього);
2. з’ясувати особливості вуглеводнево-ліпідного і азотного обміну у тканинах та окисно-відновного стану у компартментах клітин печін­ки тварин за умов природного (в динаміці гіпобіотичного бауту) та штучного гіпобіозу;
3. визначити й порівняти інтенсивність процесів утилізації вуглекис­лоти в тканинах печінки тварин за умов природного та штучного гіпобіозу;
4. дослідити дію зміни кислотно-основної рівноваги (КОР) крові тварин на процеси їх входження у стан штучного гіпобіозу;
5. встановити оптимальні концентрації СО2, НСО3–, Н+ та температури в живильних середовищах для сперми бугаїв з метою переведення сперміїв у стан гіпобіозу, а також виявити особливості впливу цього явища на енергетичний обмін та здатність клітин до зберігання й запліднення;
6. розробити способи переведення риб у стан штучного гіпобіозу, а також вивчити його вплив на стан їх енергетичного й азотного обмі­ну та термін їх життєдіяльності;
7. вивчити і дати біохімічне й клінічне обґрунтування способу застосу­вання стану штучного гіпобіозу у тварин для загального знеболення та запобігання крововтрат при хірургічних втручаннях в організм.

Об’єкти досліджень: щури, крапчасті ховрахи (Cittelus suslicus Gueld), риба (озерний короп Cuprinus carpio), окремі органи, кров, тканини печінки,  спермії бугаїв, компартменти клітин, інтермедіати.

Предмет дослідження: молекулярно-біохімічні механізми дії вуглекислоти на розвиток та підтримання гіпобіотичного стану тварин, ензиматичні реакції, редокс-стан, концентрація протонів, НСО3–, величина рСО2 та О2, природний і штучний гіпобіоз.

Методи досліджень: молекулярно-біохімічні, радіоізотопні, спектрофото­мет­ричні, хроматографічні, ензиматичні, потенціометричні, кріоскопічні, фізико-хімічні, ультрацентрифугування та інші.

Наукова новизна одержаних результатів. Експериментально доведено, що характер змін вмісту кожної з основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3–) та кон­цен­трації протонів у крові гібернуючих тварин (ховрахів) має певні законо­мір­ності і відіграє певну роль у процесах їх входження, перебування й виходу із стану гіпобіозу. Виявлено зворотну залежність між парціальним тиском вугле­кислоти (рСО2) у крові та засвоєнням О2 тканинами і рівнем температури тіла гібернуючих тварин.

Вивчено динаміку та встановлені чіткі закономірності змін величин редокс-стану (NАD+/NАDН і NАDP+/NАDPН) у цитозолі та (NАDP+/NАDPН) у міто­хондріях гепатоцитів ховрахів за вищевказаних умов. Показано важливу роль змін вмісту рСО2 та концентрації NH3 у тканинах гібернуючих тварин у регуляції окисно-відновного стану в компартментах їх клітин, що має визначальне значення в корегуванні інтен­сив­ності процесів анаболізму – катаболізму та теплопродукції цілого організму. Вперше виявлено, що вказані вище зміни величини рСО2 у крові дослідних тварин у динаміці гіпобіотичного бауту знаходяться у зворотній залежності із змінами концен­трацій аміаку та у прямій – із змінами рівнів глутамату, малату й лактату у тканині їх печінки.

За допомогою радіоізотопного методу вперше показано, що співвідношення між інтенсивністю процесів декарбоксилювання та карбоксилювання в тканинах тварин за умов природного і штучного гіпобіозу зсувається у бік домінування фіксації вуглекислоти порівняно з активним станом досліджуваних тварин.

Запропоновано гіпотетичну схему анаеробної взаємотрансформації енергії відновлених піридиннуклеотидів і АТР у клітинах тварин за умов природного гіпо­біо­зу, яка передбачає паралельне взаємоперетворення СО2 і НСО3–, що здатне відігравати важливу роль у енергозабезпеченні організму за вказаних умов.

Удосконалено існуючі та розроблені нові методи переведення деяких біоло­гіч­них об’єктів (тварини, риби, клітини) у стан штучного гіпобіозу, показані певні молекулярно-біохімічні особливості впливу цього явища на ключові ланки енерге­тич­ного і азотного метаболізму та на утворення вільних радикалів у тканинах.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати досліджень стали науково-теоретичною й практичною основою для:

1. модифікації номограми Д. Ван-Слайка для роботи з пойкілотермними та гіпобіотичними тваринами;
2. внесення коректив у загальноприйняту формулу розрахунків окисно-відновного стану в компартментах клітин за умов природного й штучного гіпобіозу тварин за концентраціями субстратів дегідрогеназних реакцій, в яких одним з компонентів є СО2. Суть коригувань полягає в тому, що зна­чен­ня рСО2 у цитозолі клітин пропонується розраховувати за концен­трацією його у крові, а не вважати за сталу величину (як пропонувалося раніше);
3. удосконалення відомого вуглекислотного способу зберігання сперми бугаїв-плідників (Науково-практичні рекомендації “Спосіб зберіган­ня охолодженої сперми бугаїв шляхом використання комбінованого вуглекислотного гіпо­біозу”, 2004). Удосконалений спосіб успішно пройшов виробниче випробування та рекомен­до­ваний Міністерством аграрної політики України для застосування у практиці тварин­ниц­тва;
4. розробки способу переведення риб (озерний короп) у стан штучного гіпобіозу, що має велику перспективу застосування його з метою подов­ження терміну зберігання живої риби, у тому числі при перевезенні на далекі відстані;
5. доведення перспективності способу переведення тварин у стан штучного гіпобіозу як альтернативи загальному знеболенню організму без застосу­ван­ня тривіального хімічного наркозу, що надзвичайно важливо для тривалих складних оперативних втручань.

Пріоритетність усіх вищезгаданих способів підтверджена чотирма патен­тами України на винаходи, позитивним рішенням про видачу патенту України та практич­ними рекомендаціями.

Продовжується організаційна робота щодо широкого практичного застосування розроблених рекомендацій, зокрема: налагоджується виробництво спеціального середо­вища для зберігання охолодженої сперми; проектується спеціальне обладнання для переведення риби у гіпобіотичний стан та транспортування їх у цьому стані на далекі відстані; опрацьовується метод загального гіпобіотичного знеболення на інших видах тварин тощо.

Результати експериментальних досліджень, висновки та пропозиції вико­ристо­вуються у навчальному процесі при викладанні курсу “Біохімія тварин”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було сплановано і виконано автором в основному самостійно, під загальним керівництвом наукового консультанта. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції роботи належать здобувачеві. Автор дисертації є основним виконавцем досліджень, результати яких викладені у даній роботі. Роль співавторів окремих досліджень визначена у відповідних публіка­ці­ях і патентах та окремих письмових угодах. Деякі результати досліджень опубліковані у співавторстві (М.В. Маренець, В.І. Цвіліховський, П.В. Ярош, С.В. Терещенко, Н.Б. Силонова, В.І. Вихованець, О.В.Арнаута) і цитуються у роботі при обговоренні певних висновків, але експериментальні дані цих робіт у дисертацію не увійшли.

Апробація дисертації. Результати досліджень, які увійшли в дисертаційну роботу, доповідались її автором на:

Першій Всеукраїнській науково-виробничій конференції ветеринарних пато­ло­гів (13-15 листопада 1996 р., м. Київ); VII-му Українському біохімічному з’їзді (20-21 ве­рес­ня 1997 р., м. Київ); Світовому ветеринарному конгресі (World International Veterinary Congress, 23-26 September 1999, Leon, France); Симпозіумі гіпобіозу (Life in the cold – Hibernation Symposium – Jungholz, Germany 13-18 August 2000); 1-й Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарної медицини з питань фізіології і патології відтворення с.-г. тварин” (25-26 травня 2000 р., м. Київ); 2-й Всеукраїнській конференції ветеринарних патологів (21-24 листопада 2001 р., НАУ, м. Київ); VI-й Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (27-28 вересня 2001 р., м. Київ); VIII-му Українському біохімічному з’їзді (22-23 жовтня 2002 р., м. Чернівці); І-му з’їзді токсикологів України (11-13 жовтня 2001 р., м. Київ);  нау­ко­во-практичній конференції “Лікування хірургічних ран”  (12-13 грудня 2002 р., м. Київ); засіданні відділення ветеринарної медицини Української академії аграрних наук (17 березня 2004 р., м. Київ); засіданні Президії Національної академії наук України (23 берез­ня 2004 р., м. Київ); науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України (6 липня 2004 р., м. Київ).

Публікації. Результати дисертаційної роботи відображені у 37 статтях, опуб­ліко­ваних у 7 фахових наукових журналах, збірниках наукових праць, у 4 патен­тах на винаходи, матеріалах і тезах наукових конференцій та у практичних рекомендаціях.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу; огляду літера­ту­ри; загальної методики та основних методів досліджень; результатів досліджень; аналізу і узагальнення результатів досліджень; висновків; списку використаних джерел; додат­ків. Робота викладена на 242 сторінках основного тексту, містить 48 таблиць та 34 рисунки. Список використаних джерел включає 298 найменувань, у тому числі 161 – зарубіжних авторів.

матеріали та методи досліджень

Відповідно до поставлених завдань та для досягнення мети були змодельовані стани природного і штучного гіпобіозу тварин. Кожна модель мала  ряд досліджуваних серій і підсерій. Модель природного гіпобіозу тварин включала першу, другу і третю серії, а штучного – четверту, п’яту і шосту відповідно.

Матеріали і методи моделі природного гіпобіозу тварин. Досліди прове­де­ні на крапчастих ховрахах (Cittelus suslicus Gueld), масою 150-200 г, яких відловлювали в степу Херсонської області (Асканія-Нова). Відбір проб крові тканин здійснювали у 1-й, 2-й, 3-й, 6-й, 8-й і 9-й день з початку періодичного гіпобіотичного бауту. За контроль слугували тварини, які перебували в активному стані.

Зимова сплячка ховрахів – процес циклічний, який складається з баутів. Баут – це вхід у сплячку – сплячка – вихід з неї. Між гіпобіотичними баутами ховрах знахо­диться у стані нормотермії 1-2 дні. У січні-лютому тривалість бауту становить 8-12 днів. У наших дослідженнях тривалість гіпобіотичного бауту ховрахів дорівнювала 9 днів.

Перша серія – вивчення молекулярно-біохімічних особливостей змін основних параметрів кислотно-основної рівноваги (КОР) та рівня О2 в крові ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту. Досліджувані показники визначали на кислотно-основному аналізаторі Radelkis OP-215.

Друга серія – вивчення молекулярно-біохімічних особливостей окисно-відновного стану в гепатоцитах ховрахів у динаміці їх гіпобіотичного бауту.

Величини окисно-відновного стану в мітохондріях (за глутамат­дегідро­ге­наз­ною системою) і цитозолі (за лактатдегідрогеназною та NADР+-малатде­гідрогеназною (де­кар­боксилюючою) системами) гепатоцитів піддослідних тварин визначали за методом Г. Кребса (Krebs H.A., Veech R., 1970), а концентрації пірувату, лактату, оксало­аце­тату, малату, -кетоглутарату, глута­мату, аміаку та глюкози – викорис­то­вуючи загаль­новідомі методи, які описані у роботах автора.

Відбір тканин печінки для визначення вказаних параметрів здійснювали в динаміці гіпобіотичного бауту аналогічно, як і в першій серії досліджень.

Третя серія – вивчення молекулярно-біохімічних особливостей процесів утилі­зації вуглекислоти (карбоксилювання) в тканинах печінки ховрахів у стані природного гіпобіозу. Використано методику визначення інтенсивності сумар­но­го процесу ути­лізації вуглекислоти тканинами печінки тварин в умовах in vitro за кіль­кіс­тю радіоактивного вуглецю NaH[14C]O3, який перейшов у молекули органічних сполук інкубованих гомогенатів печінки. Дослідження включення радіоактивної мітки проводили на сцинтиляційному лічильнику SL-30 “Intertechnique” за відомою методикою, описаною в роботах автора. Радіоактивність зразків визна­чали на базі радіоізотопної лабораторії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Матеріали і методи моделі штучного гіпобіозу тварин

Четверта серія – розробка бікарбонат-вуглекислотного способу переве­дення сперміїв бугаїв-плідників у стан гіпобіозу та вивчення за вказаних умов молекулярно-біохімічних особливостей їх енергетичного обміну, тривалості зберігання та запліднювальної здатності.

Дослідження проводили спільно з відомими вченими в області штучного осіменіння тварин кандидатами с.-г. наук А.П. Кругляком, М.П. Журавлем та асистентом О.І. Смирновою на базі Броварської районної станції штучного осіменін­ня, Бородянської станції осіменіння (Київська область), Головного Селекційного Центру України (м. Переяслав-Хмельницький), кафедри генетики і розведення с.-г. тварин Національного аграрного університету. 

Свіжу сперму контрольних зразків розріджували живильним середовищем згідно з інструкцією (“Инструкция…”, 1981). Технологічну придатність сперми у процесі її зберігання визначали шляхом підрахунку рухливих сперміїв у полі зору мікроскопу. При зниженні рухливості нижче 50% (5 балів), сперму вважали техно­логічно непридатною для використання.

На другому етапі досліджень проводили вивчення впливу бікарбонат-вугле­кис­лотного способу переведення сперміїв бугаїв у стан гіпобіозу на їх енергетичний обмін. Використовували живильне середовище з такими встановленими дослідним шляхом параметрами рН – 6,7; НСО3– – 40 ммоль/л; СО2 – 10,05 ммоль/л; температура – 12 0С і вивчали їх вплив на концентрацію основних метаболітів фруктолізу та цикл трикарбонових кислот у сперміях бугаїв (М.В.Маренець, С.Д. Мельничук, 2000; Д.О. Мельничук та ін., 2000). У сперміях та плазмі сперми визначали концентрації фрук­то­зи, молочної, піровиноградної, лимонної, -кетоглутарової, яблучної та щавлево­оцтової кислот за відомими методами, описаними у роботах автора.

На третьому етапі проводили вивчення запліднювальної здатності сперміїв розбавленої сперми при її зберіганні у бікарбонат-вуглекислотному гіпобіотич­ному стані. Контрольні проби сперми  розводили відповідно до вищевказаної інструкції.

У п’ятій серії вивчали молекулярно-біохімічні особливості метаболізму за умов вуглекислотно-кисневого гіпобіозу риб та з’ясовували перспективи його практичного використання.

Використовували суміш СО2 і О2 у співвідношенні 1:1, яка продувалась крізь воду акваріума. Коропів середньою живою масою 250-350 г відбирали із Переяслав-Хмельницького рибного господарства Київської області. Для переве­дення у стан штучного гіпобіозу рибу поміщали у прикритий зверху склом акваріум (об’єм 40 л) і продували крізь воду газову суміш двоокису вуглецю й кисню у певному співвідно­шенні протягом години із швидкістю 150-200 мл/хв (на 50-100 л води) (температура води – 16-18 0С). Через годину риба поступово переходила у штучний гіпобіотичний стан, в якому могла знаходитись до трьох діб. Після перенесення у чисту воду риба через 5-8 хв виходила із стану гіпобіозу. Контролем слугувала риба, яка перебувала у ненасиченій газовою сумішшю воді з такою самою температурою.

Шоста серія присвячена вивченню молекулярно-біохімічних особли­востей метаболізму при штучному гіпобіозі теплокровних тварин та розробці способів його використання у хірургічній практиці. Експерименти проводили на білих щурах лінії Вістар живою масою 180-200 г, яких утримували в умовах віварію.

Ця серія досліджень включала три етапи.

Перший етап. Вивчення впливу змін стану КОР крові щурів на швидкість їх входження у стан штучного гіпобіозу. За принципом аналогів (за масою, віком та статтю) тварин розділяли на три групи:

перша дослідна група – тварини, яких переводили у стан метаболічного аци­дозу за загальноприйнятою методикою (S.Vaccarezza, A. Charney, 1988);

друга дослідна група – тварини, яких переводили в стан метаболічного алкалозу за аналогічною методикою;

третя контрольна група – тварини, яким вводили еквівалентно за кількістю Nа+ розчин NаCl. Кров для досліджень стану КОР у тварин відбирали через одну годину після введення.

Наступний хід досліджень полягав у переведенні тварин кожної із груп (контрольна і дослідні) у стан штучного гіпобіозу за методикою Бах­мет’єва-Анжуса, детально описаною у роботах автора. Для цього застосовувалась розроблена автором гіпобіотична камера ГК-01 та змішувач газів 122 СГ-01. Як тест на швидкість розвитку явища штучного гіпобіозу у піддослідних тварин брались показники інтенсивності зниження у них ректальної температури у динаміці.

Другий етап. Вивчення інтенсивності процесів карбоксилювання в тканинах печінки щурів за умов штучного гіпобіозу. Відбір проб печінки та вивчення інтенсивності процесів утилізації вуглекислоти (як і у ховрахів 3-ї серії досліджень) у щурів здійснювали при перебуванні їх у стані штучного гіпобіозу (через 3 год. від початку переведення їх у цей стан) та в активному стані (контрольна група).

Третій етап. Вивчення особливостей обмінних процесів при штучному гіпобіозі у щурів та можливостей його використання у хірургічній практиці. Дослідження щодо вивчення принципової можливості використання явища штуч­ного гіпобіозу за умов різноманітних оперативних втручань на щурах були проведені спільно з фахівцями Інституту хірургії та трансплантології АМН України (д.м.н., професор Ю.О. Фур­ма­нов) і кафедри хірургії ветеринарного факультету НАУ (д.в.н., професор О.Ф. Петрен­ко). В процесі досліджень були виконані такі оперативні втручання: резекція легені, часткова гепатектомія, операції на шлунку, ампутація кінцівки, остеосинтез трубчастих кісток тощо (С.Д. Мельничук, Ю.О. Фурманов, П.В. Ярош, 1998). Харак­тер біохімічних та клінічних післяопераційних змін в організмі дослідних і контрольних груп щурів вивчався на прикладі операції з ампутації передньої кінцівки тварини. Як контроль використовували групу тварин, для яких застосовували типовий хімічний наркоз. У процесі цих досліджень використовувалися, в основному, методики, які описані вище.

Дослідження вільно-радикального окислення ліпідів у мітохондріях печінки щурів здійснювали на хемолюмінометрі (ПХЛ-01) з фотоелектронним помножувачем (ФЄУ-84-3), додатково обладнаним комп’ютером АХЛГ-01 згідно з методикою описаною у статті С.Д. Мельничука, О.І. Кузьменка, В.М. Маргітича та ін. (1998).

Одержані дані обробляли статистично за допомогою комп’ютерної програми MS Excel з використанням критерію t Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Біологічна роль вуглекислоти та можливі біохімічні механізми її впливу на організм тварин за умов природного гіпобіозу

Особливості змін концентрацій основних форм вуглекислоти (СО2 та НСО3–), Н+ і О2 в крові та температури тіла ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту

За наведеними даними, вже протягом першої доби у період, коли тварини “засну­ли”, значно знижується температура їх тіла (рис. 1) порівняно з активним станом.

Рис. 1. Температура тіла ховрахів у динаміці розвитку гіпобіотичного стану та під час їх пробудження (Mm; n = 7)

Надалі спостерігається її поступове зниження до рівня температури навко­лишнього середовища (шоста доба). При пробудженні (восьма доба) температура тіла тварин різко підвищується і досягає контрольних значень. З початком наступного бауту цей показник знову різко знижується.

Рівень парціального тиску СО2 у крові тварин протягом першої доби (рис. 2) зростає на 65,8 % порівняно з їх активним станом. Приблизно такий самий парціальний тиск вуглекислого газу в крові тварин залишається протягом наступних двох діб.

Рис. 2. Парціальний тиск вуглекислого газу у крові ховрахів у динаміці розвитку гіпобіотичного стану та в період їх пробудження (M±m;  n=6)

На четверту добу тиск вуглекислоти в крові починає знижуватися і спадає до восьмої доби – аж до повного пробудження тварин, коли величина рСО2 дося­гає конт­роль­ного значення. На дев’яту добу, після повторного засипання тварини, рівень вуглекислоти в крові знову різко зростає на 60,5% порівняно з контроль­ними величинами.

Рівень бікарбонатів у крові піддослідних ховрахів змінюється дещо по-іншому – їх концентрація поступово підвищується і на шосту добу після початку гіпобіотичного бауту стає на 59,7 % вище, ніж у контролі (рис. 3). Надалі, протягом сьомої-восьмої діб відмічається поступовий спад цього показника з виходом на контрольний рівень при  повному пробудженні тварини.

Отже, за перебігом гіпобіотичного стану піддослідних тварин динаміка змін парціального тиску СО2 і концентрації НСО3- в їх крові має протилежний характер. Ці факти пояснюють наявність існуючих протиріч у результатах аналогічних досліджень, отри­ма­них попередніми дослідниками стосовно величини рСО2 і концентрації НСО3– у крові гібернуючих тварин, коли не бралася до уваги стадія їх гіпобіотичного бауту  (K.M. Kent, E.C. Piece, 1967).

Рис. 3. Концентрація бікарбонатів у крові ховрахів у динаміці розвитку гіпобіотичного стану та в період їх пробудження (M±m; n=7)

Досить показовими слід вважати також дані щодо зміни величин рН крові протягом усього періоду досліджень (рис. 4).

Рис. 4. Рівень рН крові ховрахів у динаміці розвитку гіпобіотичного стану та в період їх пробудження (M±m; n=7)

Так, уже через добу після початку гібернації рівень рН крові різко знижується (на 0,238 од.) порівняно з контролем. Цей стан за класифікацією Д. Ван-Слайка характеризується як гострий респіраторний ацидоз. На третю добу величина рН крові підвищується і на шосту досягає величини 7,636, що вже можна характеризувати як метаболічний субкомпенсований алкалоз. На наступних етапах рівень рН крові знижується і досягає контрольних величин при повному пробудженні тварин. Треба підкреслити, що значення величин рН крові гіпобіозних тварин ми розраховували, беручи до уваги пряму кореляційну залежність зміни величини рК вугільної кислоти  від температури середовища. Це впливає на рівень рН крові згідно з формулою Хандерсона-Хассельбаха:

.

З тієї самої причини ми не могли користуватися класичною номограмою Д. Ван-Слайка при розрахунках параметрів КОР у гіпобіозних тварин, оскільки зміни рівнів рН крові, як і величини рСО2 останньої, не входили в межі визначених класичною номограмою величин.

Враховуючи досвід роботи з тваринами в стані штучного і природного гіпо­біо­зу та зробивши відповідні розрахунки, ми модифікували номограму Д. Ван-Слайка (рис. 5), якою і користувалися у своїх дослідженнях (С.Д. Мельничук, 2002).

За цією номограмою, при температурі 37°С величина рН крові становить 7,40; при 20°С – 7,47; а при 5°С – 7,61.

Величина рО2 у крові тварин у динаміці гіпобіотичного бауту також змінюється, і ці зміни мають певні закономірності (рис. 6). Так, через добу після “засипання” тварин величина рО2 у крові стає вищий (на 50,1 %), ніж у контролі. Підвищення рівню кисню спостерігається до четвертої доби, після чого він поступово починає знижуватись і на восьму добу стає нижчий, ніж у контролі (на 25,7 %). У період, коли тварини повністю прокидаються і виходять із стану гіпобіозу, парціальний тиск О2 наростає до контрольних величин, і при повторному “засипанні” – знову має місце тенденція до його підвищення.

Рис. 5. Модифікована номограма взаємозалежності показників кислотно-основної рівноваги крові і температури тіла для пойкілотермних тварин

Рис. 6. Величина парціального тиску кисню у крові ховрахів у динаміці розвитку гіпобіотичного стану та в період їх пробудження (M±m; n=6)