|
ХАРКіВСЬКИЙ національний університет
ім. В.Н. Каразіна
Пірожкова-Паталах Ірина Вікторівна
УДК 577.1:661.871.9
АНТИОКСИДАНТНА ТА АНТИКАНЦЕРОГЕННА АКТИВНІСТЬ КЛАСТЕРНИХ СПОЛУК РЕНІЮ
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидита біологічних наук
Харків – 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Дніпрпетровському національному університеті Міністерства освіти та науки України.
Захист відбудеться "18" червня 2001 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17. Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і наукиУкраїни за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. 2-49.
З дисертацією можна ознайомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.
Автореферат розісланий "18"травня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради ______________ Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Залучення біонеорганічних сполук – кластерних комплексів ренію з органічними лігандами – що стали доступними завдяки синтетичній майстерності колег-хіміків [Штеменко и др., 1986; 1996; 1997], до біохімічних і фармакологічних досліджень є перпективним і корисним. Сполуки ренію, які ми вивчали, з одного боку, мають кластерний фрагмент, здатний a priorі до участі в реакціях окиснення-відновлення, а з другого – органічні ліганди, розташовані по-різному навколо зв’язку метал-метал, тому становлять унікальну можливість для з’ясування одного з актуальних питань біохімії, фармакології і фізіології – вивчення зв’язку між тонкою структурою екзогенної речовини й біохімічними перебудовами, які відбуваються в організмі під її впливом. Відомо, що комплекси перехідних металів з органічними лігандами мають антиканцерогенну, антивірусну активність [Keppler, et al., 1995]. Пошук перспективних препаратів повинен супроводжуватися всебічним вивченням механізмів тих змін, які відбуваються в організмі під час їх уживання, і перш за все відбиваються на біохімічних показниках крові [Комендантова и др., 1988, Уайт и др., 1981]. Актуальним завданням є також аналіз протипухлинної активності нових сполук із спільними структурними особливостями з платинідами нових генерацій [Шалимов и др., 1998] і водночас із меншою токсичністю [Олійник та ін., 2001, Бовыкин, 1979]. Особливої уваги заслуговує вивчення системи антиоксидантного захисту організмів при бронхо-легеневих захворюваннях, анеміях різного походження тощо та їх корекції [Барабой и др., 1991; 1997], що сприятиме більш глибокому розумінню протікання біохімічних процесів при патологіях і пошуку нових ефективних препаратів для їх лікування.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась з 1998 по 2000 рік у рамках науково-дослідної роботи держбюджетної теми відділу молекулярної біології НДІ біології і кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету “Дослідження біологічної активності кластерних сполук ренію з органічними лігандами” (№ державної реєстрації 0100U005660), яка входить у координаційний план № 15 Міністерства освіти і науки України.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у з’ясуванні особливостей впливу кластерних сполук ренію з органічними лігандами на антиоксидантні показники крові in vitro, а також дослідити їх активність на моделях гемолітичної анемії і пухлинного зростання.
Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:
- Дослідити вплив кластерних сполук ренію на показники крові in vitro: на швидкість гемолізу еритроцитів, параметри системи антиоксидантного захисту: СОД, КАТ і вміст МДА, на можливість взаємодії із системою глюкозооксидаза-пероксидаза; та з’ясувати наявність залежності ефектів взаємодії від концентрації, структури та стабільності сполуки у водному розчині.
- Вивчити цитостабілізуючу та антиоксидантну активність на моделях свинцевої та фенілгідразинової анемії, протипухлинну активність на моделі карциноми Герена та токсичність кластерних сполук ренію.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено дослідження антиоксидантної активності біядерних кластерних сполук ренію з органічними лігандами на біологічних моделях.
Показано, що сполуки ренію активно стабілізують мембрани еритроцитів під час кислотного гемолізу залежно від стуктури, концентрації, стабільності у водному розчині і стану еритроцитарної мембрани. В експериментах in vitro вперше показано антиоксидантний ефект відібраних найбільш активних сполук ренію. Показано, що в крові з відхиленнями в системі антиоксидантного захисту (підвищений рівень пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), знижена активність супероксиддисмутази (СОД)) виявлено коригуючу дію кластерних сполук ренію на процеси пероксидного окиснення ліпідів, про що свідчить підвищення активності СОД та нормалізація кількості малонового діальдегіду (МДА) після інкубації з Re2(i-C3H7COO)4Cl2 та цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2. Установлено їх здатність впливати на активність ферментної системи глюкозооксидаза-пероксидаза залежно від будови речовини й терміну інкубації.
Продемонстровано корекцію антиоксидантних параметрів, морфології і гематологічних показників даними сполуками на моделях гемолітичної анемії на різних видах дослідних тварин. Порівняння результатів їх дії з відомими антиоксидантами свідчить про наявність антиокиснювальної активності in vivo.
Уперше виявлено антиканцерогенний ефект кластерних сполук ренію Re2(i-C3H7COO)4Cl2 та цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 на тест-моделі карциноми Герена, який проявляється гальмуванням ростових параметрів пухлини та продовженням життя тварин. Визначено низьку токсичність досліджуваних сполук.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення про вплив металоорганічних сполук на живий організм, а також сприяють з’ясуванню деяких аспектів біохімічних механізмів такого впливу.
Показаний позитивний ефект двох сполук ренію в моделях гемолітичної анемії in vivo і карциноми Герена паралельно з їх низькою токсичністю робить актуальними подальші дослідження кластерних сполук ренію з органічними лігандами як перспективних лікарських препаратів.
Особистий внесок здобувача. підготовка й проведення досліджень виконані здобувачем особисто на кафедрі ДНУ (м. Дніпропетровськ), в УкрНДІ Онкології та Радіології (м. Київ) та за безпосередньої участі у спільних експериментах на базі Медичного інституту української асоціації народної медицини (м. Київ), а також за тісної співпраці з Українським державним хіміко-технологічним університетом (м. Дніпропетровськ). інтерпретацію одержаних результатів, їх аналіз та узагальнення проведено особисто.
Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на ІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), V Міжнародній конференції “Франція та Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур” (Дніпропетровськ, 1998), VI Міжнародному конгресі “Amino Acids” (Bonn, FRG, 1999), VI Міжнародному симпозіумі “Metal Ions in Biology and Medicine” (San Juan, USA, 2000).
Публікації. За матеріалами виконаної дисертаційної роботи опубліковано 5 статей та 2 тез доповідей і матеріалів конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку використаних джерел (242 найменування). Робота викладена на 151 сторінці машинописного тексту, проілюстрована 24 таблицями і 37 рисунками.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
У роботі досліджувалися кластерні сполуки ренію з органічними лігандами, зображені на рис. 1.
Об’єктом досліджень in vitro була кров донорів ІІ(А)Rh+ групи, кров дітей з діагнозами кардіоревматичних захворювань та дорослих із діагнозами бронхо-легеневих патологій. Інкубацію крові або еритроцитів із комплексами І-ІV у концентраціях 10-4-10-12 М проводили за Ito, et al. (1988) і Тугановою та ін. (1996).
У моделі свинцевоацетатної анемії об’єктом дослідження були кролі (самиці) з масою тіла 2000-2500 г. Свинцеву анемію моделювали за Гітельзоном та ін. (1960). Тваринам групи І-ІІІ вводили сіль свинцю, кролям груп ІІ та ІІІ протягом 21 доби, починаючи з 9 доби після введення гемолітика, вводили внутрішньом’язово комплекс Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у вільній (0,9% NaCl) та ліпосомній формі в дозі 5,46 мг/кг один раз на дві доби. Кров отримували з вушної вени [Западнюк и др., 1983]. Ліпосоми (MLVs) готували за Kagayama, et al. (1998).
Модель фенілгідразинової анемії здійснювали за Меєрсоном та ін. (1983; 1984) на щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 150-200 г, які були розподілені на групи: 1 – контроль, 2 – фенілгідразин, 3 – фенілгідразин + цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2, 4 – фенілгідразин + цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 у ліпосомах, 5 – фенілгідразин + Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у ліпосомах, 6 – фенілгідразин + іонол, 7 – фенілгідразин + α-токоферол + Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у ліпосомах.
Модель пухлинного зростання проводили на 40 безпородних білих молодих щурах вагою 100-120 г. Клітини карциноми Герена (пухлина Т-8) імплантували підшкірно у праву задню ногу. Уведення активних сполук проводили щоденно, починаючи з 7 доби після імплантації пухлини протягом 1 тижня [Тимофеевский, 1960]. Першу групу тварин залишали контрольною. Другій групі вводили сполуку цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 у дозі 180 мг/кг. Третя та четверта групи отримували речовину Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у дозах 25 і 200 мг/кг, відповідно. Терапевтичний ефект визначали за збільшенням тривалості життя (ЗТЖ) [Балакаева и др., 1999, Снегур и др., 1998], об’ємом пухлини (V), ступенем гальмування зростання солідних пухлин [Тимофеевский, 1960].
Для дослідження токсичності використовувалися самці білої лабораторної миші масою 20-24 г. Речовину цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 розчиняли у стерильному фізіологічному розчині (0,9% NaCl). Сполуку Re2(i-C3H7COO)4Cl2 вводили у вигляді суспензії у фізіологічному розчині, у вигляді масляного розчину та у вигляді розчину DMSO : фізіологічний розчин (3:20) [Тимофеевский, 1960, Collery, et al., 1996]. Параметри токсичності визначали за Балакаєвою та ін. (1999) та Collery, et al. (1996).
Стійкість еритроцитів визначали за методами кислотного [Терсков и др., 1965], спонтанного [Jager, 1968] та вільнорадикального гемолізу [Гладкова и др., 1999]. Використовували величини сумарної резистентності (СР) [Козенец и др., 1997]. Визначення ферментів антиоксидантного захисту: супероксиддисмутази (СОД), каталази (КАТ) здійснювали за Чеварі та ін. (1991), рівня МДА – за Андрєєвою та ін. (1988). Для оцінки антиоксидантного стану крові застосовували фактор Ф [Чевари и др., 1991], який дорівнює добутку активностей ензимів (СОД і КАТ), розділеному на рівень ПОЛ. Також проводили морфологічні дослідження еритроцитів [Locquin, et al., 1983, Бутенко и др., 1974], визначення активності тест-системи глюкозооксидаза-пероксидаза [Buhem at al., 1974], амінного азоту плазми крові [Ушакова та ін., 1995], концентрації гемоглобіну за Салі та кількості еритроцитів [Донцова и др., 1988].
Математичну обробку експериментальних даних виконували за методами варіаційної статистики [Лапач и др., 2000, Рокицкий, 1973, Тимофеевский, 1960].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА їх ОБГОВОРЕННЯ
Вивчення впливу кластерних сполук ренію на швидкість гемолізу еритроцитів. Досліджено вплив сполук ренію на стійкість еритроцитів крові донорів до кислотного гемолізу. Показано, що сполуки ренію, які мають карбоксилатні ліганди, взаємодіють з еритроцитами. Ефект взаємодії носить полімодальний характер, тобто залежить від концентрації комплексу (рис. 2). У діапазоні високих концентрацій (10-4-10-5М) ефект стабілізації еритроцитів збільшується у сполук разом із зростанням ліпофільності радикала: C2H5 < i-C3H7; вплив природи аксіального замісника (Cl- або Br) не такий значний, як при інших концентраціях (більш низьких); нікотинамідний комплекс показує менший вплив до стабілізації внаслідок більшої полярності. Отримані дані дозволяють зробити припущення про те, що переважним механізмом взаємодії комплексів з еритроцитами в діапазоні високих концентрацій, який забезпечує стійкість до гемолізу, є гідрофобна взаємодія по типу комплекс-ліпідний матрикс.
Аналогічні міркування стосовно зв’язку структура комплексу-ефект стабілізації в області низьких концентрацій дозволяють припустити, що в даному діапазоні мають перевагу електростатичні взаємодії типу комплекс-іоногенні амінокислоти білків, при цьому вирішуюча роль належить поляризованості аксіальних зв’язків Re-Hal у комплексі. Підставою для цього стала відсутність стабілізуючих властивостей для сполуки, яка структурно відрізняється тільки природою галогену (Br) у порівнянні до Cl-вмісного аналога (рис. 2).
Ефект стабілізації деяких карбоксилатів наближається до стероїдів [Tuganova, et al., 1998]. Такі механізми дії речовин на еритроцити можуть бути пояснені зміною ліпідного бішару, ліпід-білкових взаємодій або змінами активності мембранозв’язаних ферментів, проникності мембран для іонів тощо.
кластерні сполуки ренію з амінокислотними лігандами здебільшого менш стійкі у водних розчинах і мають ступінчатий процес гідролізу [Штеменко и др., 1999]. Інтерес саме до цих сполук пов’язаний з тим, що явище біологічної активності деяких активних сполук, наприклад, цисплатину, пов’язано не із самою речовиною, а її гідролізною формою [Шалимов и др., 1998].
Для сполуки з GABA-лігандом ІІ типу характерні як високі максимуми, так і високі мінімуми, що свідчить про виражену полімодальність цієї сполуки. Для експериментів за участю гідролізних форм сполук ренію характерно значне зниження ефекту стабілізації (рис. 3, криві: ----, – –). Ми вважаємо, що таке явище пов’язано з перетвореннями сполук у воді, яке включає процес цис-транс-ізомеризації. Доказом цього є те, що транс-ізомери комплексів ренію з амінокислотними лігандами майже не активні в еритроцитарній моделі.
Дослідження взаємодії комплексів ренію з еритроцитами хворих показали, що при деяких кардіоревматичних захворюваннях, коли стійкість еритроцитів значно зменшена внаслідок модифікацій у ліпід-білковому матриксі [Ремус Нестор, 1975], виявлена корекція після інкубації з комплексною сполукою. Ефект стабілізації досягав 100% для еритроцитів хворих із синдромом Вісслера-Фанконі. Такий могутній ефект можна пояснити залежністю взаємодії комплексу від стану мембран еритроцитів.
Вплив комплексів ренію на антиокиснювальні властивості крові. Наступним кроком наших досліджень було з’ясування питання про вплив комплексів ренію з органічними лігандами на антиокиснювальні властивості крові донорів. Дослідження проводилися з розчинами Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 у вище зазначеному діапазоні концентрацій.
Показано, що Re2(i-C3H7COO)4Cl2 практично не змінює кількість МДА, активність СОД, КАТ при будь-яких концентраціях. Проте, інкубація крові з цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 призводила до вірогідного підвищення рівня МДА плазми у концентрації 10-5 М та зниження у концентраціях 10-7 і 10-8 М комплексу. Відмічено тенденцію зниження інтенсивності ПОЛ в усіх інших концентраціях у межах норми (табл. 1). Активність каталази збільшена для всіх концентрацій інкубаційних розчинів сполуки цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 у межах 2-34% відносно контролю, включаючи вірогідні відмінності активності для 10-4, 10-10, 10-11 М концентрацій. найбільшу активність СОД виявлено для 10-4, 10-5 та 10-8 М концентрацій комплексу в інкубаційних розчинах. Слід відзначити, що тенденція зміни антиоксидантних показників є тотожною для показників кислотних еритрограм.
Таблиця 1
рівень МДА плазми, активність КАТ, СОД та фактор Ф крові донорів після інкубації з розчинами різних концентрацій цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 (M±m, n=3-9)
Примітка. *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 – вірогідність відносно контролю.
При вивченні інтенсивності пероксидного окиснення при бронхо-легеневих патологіях було встановлено, що кров хворих на бронхіальну астму, хронічний бронхіт та запалення легенів відрізняється здатністю до аутоокиснення вільнорадикальних продуктів від крові донорів. Рівень ПОЛ такої крові майже в 2 рази більший за норму (рис. 4). Активність СОД при цьому знижувалася на 30%, як це показано на рис. 5. Ці дані знаходяться у відповідності з даними інших досліджень [Джафарова и др., 1989, Проворотов и др., 1992].
Знайдено, що наявність комплексної сполуки цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 при всіх досліджених концентраціях інкубаційних розчинів викликає вірогідну різницю в бік збільшення активності СОД крові in vitro (рис. 6). Висока активність СОД забезпечує підтримання метаболітів на постійному рівні, що не створює загрози для тканин організму [Гусев и др., 1982]. Зниження кількості продуктів ПОЛ крові виявлялося також для всіх досліджених концентрацій і було в межах вірогідного.
Утворення ТБК-активних продуктів, як це зображено на рис. 7 пригнічується комплексом Re2(i-C3H7COO)4Cl2 при концентрації в інкубаційному розчині 10-4, 10-6 та 10-10 М, що супроводжується зниженням активності СОД (рис. 8).
Різний механізм антиоксидантної дії вивчаємих сполук може бути пояснений певним внеском лігандів на фоні антиокиснювальних властивостей кластерного фрагмента.
Також було показано взаємодію комплексів ренію з ферментною системою глюкозооксидаза-пероксидаза, що реєстрували по змінах її активності після інкубації зі сполуками. Усі тестовані сполуки (типи ІІ і V) здатні різною мірою до активації ферментної системи. Активуюча дія пригнічується разом із ліпофільністю радикала. В усіх випробуваних концентраціях комплексів максимальну активацію ферментів спостерігали після одногодинної інкубації, яка досягала 27%.
DМSО та гліцерин, які були введені до робочого розчину, здатні зв’язуватися з реній-ацетатним і реній-пропіонатними комплексами ІІ типу за їх аксіальними положеннями. Певно, завдяки такій здатності DМSО та гліцерин перешкоджають зв’язуванню вказаних комплексів із ферментами, що усуває їх активацію. Даний факт свідчить на користь важливості вільних активних аксіальних положень для активуючого впливу комплексів ренію на ферменти. Також у результаті експериментів визначено, що введення до реакційної суміші надлишку нейтрального для ферментної реакції білка усуває активуючий вплив комплексів. Це вказує на те, що дослідні комплекси можуть зв’язуються з білками.
Дослідження активності комплексів ренію на моделях гемолітичних анемій. За результатами експерименту комплексна сполука дихлоротетра-µ-і-бутиратодиреній(ІІІ) як у вільній, так і в ліпосомній формі виявила себе як цитостабілізуючий агент у процесі дії гемолітичного фактора – оцтовокислого свинцю (рис. 9). До того ж, у разі використання її ліпосомної форми було відзначено більш значну протекторну активність, яка виявлялась у підвищенні популяції стійких форм еритроцитів приблизно на 35% у порівнянні з групою тварин, яка отримувала тільки оцтовокислий свинець, вже на стадії І гемолітичної анемії, та приблизно на 60% на стадії ІІІ.
Якщо розглядати стабілізуючий вплив вільної форми комплексу Re2(i-C3H7COO)4Cl2, то треба зазначити відмінність активності останньої від ліпосомної форми, яка почала проявлятися в “поліпшенні” еритрограм тільки на ІІ стадії експериментальної анемії. Стабілізація на ІІІ стадії експериментальної анемії при вживанні вільної форми сполуки становила 42% підвищення популяції стійких еритроцитів. Результати корелюють із зміною концентрації гемоглобіну та кількості еритроцитів.
Підвищення стійкості еритроцитів до гемолізу під впливом препаратів Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 знайдено і в експерименті з фенілгідразиновою анемією (табл. 2), що супроводжувалося кількісним зниженням деформованих еритроцитів та підвищенням нормальних дискоцитних форм (рис. 10).
Таблиця 2
вміст гемоглобіну в крові щурів, показники спонтанного та аскорбат-Fe2+-індукованого гемолізу еритроцитів (М±м) залежно від умов експерименту
Примітка: * – р<0.05 по відношенню до контролю; ** – р<0.05 по відношенню до фенілгідразинової групи.
Показано, що введення препаратів Re2(i-C3H7COO)4Cl2 та цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 призводить до підвищення рівня гемоглобіну в різному ступені залежно від форми введення й будови речовини. Так, введення Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у ліпосомній формі призводить до найбільшої корекції рівня гемоглобіну в умовах фенілгідразинової анемії. Подані дані про вміст гемоглобіну в крові щурів корелюють із тривалістю життя і загальним фізичним станом тварин.
Вплив сполук також порівнювали з дією відомих антиоксидантів (табл. 3). Якщо вплив препарату цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 на вміст гемоглобіну в крові щурів у вигляді як водного розчину, так і в ліпосомній формі такий, як і антиоксиданту іонолу, то застосування Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у ліпосомній формі перевищує ефект останнього на 27%. Стосовно показників ПОЛ, то іонол нормалізує їх значно більшою мірою, ніж сполуки ренію. Установлено, що всі досліджувані речовини значною мірою підвищують СТЖ тварин при гемолітичних анеміях.
Отже, отримані результати in vivo дозволяють розглядати сполуки Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2, як коригуючі антигемолітичні агенти, які пролонгують життя експериментальних тварин та діють на рівні відомих антиоксидантів.
Таблиця 3
Вміст ТБК-активних продуктів плазми крові тварин різних груп (мкМ)
Примітка: * – р<0.05 по відношенню до першої групи; ** – р<0.05 по відношенню до фенілгідразинової групи.
Дослідження протипухлинної активності комплексів ренію. На рис. 11 представлені дані про вплив комплексних сполук ренію на динаміку зростання пухлини Т-8 у щурів. Щоденне i.p. введення сполуки Re2(i-C3H7COO)4Cl2 у дозі 25 та 200 мг/кг викликало гальмування зростання карциноми. Найбільший ефект спостерігали на 4-8 добу після першого введення речовини Re2(i-C3H7COO)4Cl2. при цьому ефект не є дозозалежним на даному діапазоні доз. Стосовно сполуки цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 ефект уповільнення зростання пухлини був більш виразний, при цьому найбільш значний ефект виявлено на 8-18 доби. Цей ефект супроводжувався збільшенням тривалості життя тварин, яке становило 31-45 %.
Проведений аналіз даних за стандартною шкалою оцінки пригнічення зростання пухлин [Тимофеевский, 1960] дозволяє зробити висновок про наявність слабкого пригнічення (±) для сполуки Re2(i-C3H7COO)4Cl2, та помірного пригнічення (+) для сполуки цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2.
При аналізі результатів експерименту з карциномою Герена необхідно зазначити, що в експериментальній онкології ефективність протипухлинної дії різних препаратів у пізні строки розвитку пухлин виявляється як значно менша [Шалимов и др., 1998]. Цей факт свідчить на користь достатньо вираженого протипухлинного ефекту комплексних сполук, що досліджувалися.
Зростання карциноми Герена [Николюк, 2000], і взагалі пухлини [Шапот, 1975], супроводжується змінами в системі антиоксидантного захисту, що прискорює зростання новоутворень. Отже, наявність протипухлинного ефекту у кластерних сполук ренію може бути пояснено їх антиоксидантними властивостями.
Проведений аналіз токсичності досліджуваних речовин свідчить про їх низьку токсичність [Сидоров, 1973] (ЛД50 є дози 3200 та 1000-1100 мг/кг для Re2(i-C3H7COO)4Cl2 та цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2, відповідно). NOAEL (no observed-adverse-effect level – "рівень, на якому не спостерігали несприятливого ефекту") [Collery, et al., 1996] для токсичності, індукованою сполуками на мишах, становить 3200 мг/кг та 180 мг/кг, відповідно.
Таким чином, виявлено антиоксидантну та протипухлинну активність кластерних сполук диренію(ІІІ) з органічними лігандами поряд із їх низькою токсичністю, що визначає перспективність проведення подальших їх біохімічних досліджень та пошуку активних препаратів у ряду біядерних ренієвих сполук.
ВИСНОВКИ
- Кластерні сполуки ренію з органічними лігандами взаємодіють з еритроцитами людини, призводячи до зміни швидкості гемолізу; ефект впливу залежить від тонкої структури речовини: ліпофільності органічного ліганда, природи аксіального галоген-замісника, положення лігандів навколо кластерного фрагмента, а також від швидкості гідролізу у водному розчині та стану еритроцитарної мембрани. Найбільший стабілізуючий вплив показано для сполуки Re2(i-C3H7COO)4Cl2.
- Комплекс цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 призводить до зниження процесів пероксидного окиснення ліпідів крові з порушеною системою антиоксидантного захисту, що підтверджується вірогідним підвищенням активності супероксиддисмутази (на 10-58%) і нормалізацією кількості малонового діальдегіду.
- Вплив Re2(i-C3H7COO)4Cl2 на антиоксидантні характеристики крові проявляється у зниженні кількості малонового діальдегіду (р<0,05) при високих концентраціях комплексної сполуки, яке супроводжується пригніченням активності супероксиддисмутази (р<0,05). Зворотний ефект виявлено для низьких концентрацій.
- Кластерні сполуки ренію з органічними лігандами безпосередньо взаємодіють із білковими молекулами: активність системи глюкозооксидаза-пероксидаза вірогідно зростає при концентраціях комплексів 10-6, 10-8, 10-10 М. максимальну активацію ферментів спостерігали після одногодинної інкубації, яка досягала 27%. Показана залежність ступеню зміни активності ферментів від будови речовини.
- Встановлена антигемолітична активність комплексів ренію Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 на моделях гемолітичної анемії, що виявлялося у вірогідній корекції гематологічних показників, продовженні середньої тривалості життя тварин та корекції системи антиоксидантного захисту крові на рівні відомих антиоксидантів.
- Сполуки Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 виявили вірогідний ефект пригнічення зростання карциноми Герена, що поряд із їх низькою токсичністю робить перспективним пошук протипухлинних препаратів у ряду кластерних сполук ренію з органічними лігандами.
- Проведені дослідження дозволили запропонувати гіпотезу щодо механізмів біологічної дії кластерних комплексів ренію, які реалізуються, головним чином, завдяки їх антиоксиснювальних властивостей.
ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
- Штеменко Н.И., Пирожкова-Паталах И.В., Штеменко А.В., Голиченко А.А. Изучение влияния комплексов рения с органическими лигандами на кислотную резистентность эритроцитов человека // Укр. биохим. журн. – 2000. – Т. 72, № 3. – С. 77-81.
- Штеменко Н.І., Пірожкова-Паталах І.В. Вплив транс-діакватетрабромоді-µ-півалатодіренію (iii) на показники кислотостійкості еритроцитів людини // Вісник Дніпропетровського університету. – 2000. – Вип. 8, Т. 1. – С. 45-49.
- Shtemenko N.I., Pyroshkova-Patalakh I.V., Shtemenko A.V., Kozhura O.V. Screening and testing strategy for biological activity of rhenium cluster compounds // Metal Ions in Biology and Medicine. – San Juan: John Libbey Eurotext, 2000. – Vol. 6. – P. 616-618.
- Пірожкова-Паталах І.В., Штеменко Н.І., Ліхолат О.А. Антиокиснювальна активність біядерних комплексів ренію в експерименті in vitro // Питання біоіндикації та екології. – 2001. – Вип. 6, № 1. – С. 121-127.
- Олійник С.А., Штеменко Н.І., Горчакова Н.О., Штеменко О.В., Затовський І.В., Пірожкова-Паталах І.В., Паталах Д.Д., Педан Л.І. Токсикологія сполук ренію: огляд літератури // Современные проблемы токсикологии. – 2001. – № 1. – С. 11-15.
- Пірожкова І.В., Штеменко Н.І., Штеменко О.В., Бовикін Б.О. Взаємодія еритроцитів з комплексними сполуками ренію // Тези доп. ІІ УБФТ. – Харків: Харківський Державний Університет, 1998. – С. 154.
- Pirogkova I.V., Chtemenko N.I., Chtemenko A.V. Etude de l’activite bilogique des liaisons de coordination rhenium // Actes de la V Conf. Intern. France et Ukraine, Experience Scientifique et Pratique Dans le Contexte du Dialogue des Cultures Nationales. – Дніпропетровськ: Арт–Пресс, 1998. – Т. 3. – С. 75-76.
АНОТАЦІЯ
Пірожкова-Паталах І.В. антиоксидантна та антиканцерогенна активність кластерних сполук ренію. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2001.
Досліджено вплив ряду нових кластерних сполук ренію з органічними лігандами на біохімічні показники крові. Показано залежність цитостабілізації сполуками від концентрації інкубаційного розчину, утворення гідролізних форм, а також від тонкої структури речовини: будови радикала й аксіального На1-замісника та конфігурації сполуки (цис-, або транс-) у моделі кислотного гемолізу еритроцитів in vitro. Виявлено антиоксидантну активність для сполук Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 та її залежність від будови та концентрації речовини в інкубаційному розчині in vitro. Установлено безпосередню взаємодію сполук ренію з ферментною системою глюкозооксидаза-пероксидаза.
Дослідження сполук in vivo показали наявність антигемолітичної та антиокиснювальної активності, що виявлено корекцією гематологічних показників, антиоксидантних параметрів (рівня МДА та вільнорадикального гемолізу) на рівні антиоксидантів та продовженням життя дослідних тварин. Визначено гостру й хронічну токсичність. Установлено вірогідне гальмування зростання карциноми Герена, а також збільшення тривалості життя у тварин, які отримували терапію сполуками ренію Re2(i-C3H7COO)4Cl2 і цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2.
Ключові слова: кластерні сполуки ренію, органічні ліганди, антиоксидантні параметри крові, еритроцити, канцерогенез.
АННОТАЦИЯ
Пирожкова-Паталах И.В. Антиоксидантная и антиканцерогенная активность кластерных соединений рения. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2001.
Диссертация посвящена изучению влияния кластерных соединений рения с органическими лигандами на биохимические показатели крови и опухолевый рост в модельных экспериментах. Результаты проведенных исследований позволяют понять некоторые причинно-следственные закономерности между структурой экзогенного вещества и биохимическими эффектами при ее введении.
Показана зависимость цитостабилизации соединениями от концентрации инкубационного раствора, скорости образования гидролизных форм, а также от тонкой структуры вещества: строения радикала (липофильности), аксиального галогенозаместителя (Cl- или Br-) и конфигурации соединения (цис- или транс-) на модели кислотного гемолиза эритроцитов in vitro. Предполагается, что превалирующим механизмом взаимодействий соединений рения с мембранами эритроцитов в области высоких концентраций (10-4-10-5 М) является взаимодействие по типу комплекс-липидный матрикс, а в диапазоне низких (10-9-10-11 М) – взаимодействие по типу комплекс-ионогенные аминокислоты белков.
Обнаружена антиоксидантная активность у соединений Re2(i-C3H7COO)4Cl2 и цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 и ее зависимость от строения и концентрации исследуемого вещества в инкубационном растворе in vitro. Показано, что в крови с нарушениями в системе антиоксидантной защиты (повышенная интенсивность процессов пероксидного окисления, сниженная активность фермента СОД) выявлено корригирующее действие кластерных соединений рения Re2(i-C3H7COO)4Cl2 и цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2, о чем свидетельствует повышение активности СОД и нормализация количества малонового диальдегида после инкубации крови с данными соединениями. Отмечено, что тенденция изменений антиоксидантных параметров после инкубации с комплексами рения является подобной для показателей кислотных эритрограмм.
Установлено изменение активности ферментной системы глюкозооксидаза-пероксидаза после инкубации с исследуемыми рениевыми комплексами, что свидетельствует о непосредственном взаимодействии соединений рения с белковыми молекулами. Максимальную активацию ферментов, которая достигала 27%, наблюдали после одночасовой инкубации. Показана зависимость изменения активности ферментной системы от строения исследуемого вещества и его концентрации в среде инкубации.
Исследования соединений in vivo на моделях фенилгидразиновой и свинцовоацетатной анемии показали наличие антигемолитической и антиокислительной активностей, что проявлялось в коррекции гематологических показателей (повышение резистентности эритроцитов к гемолизу, увеличение их количества и повышение концентрации гемоглобина в крови), морфологических (увеличение количества дискоцитных форм эритроцитов и снижение трансформированных форм) и антиоксидантных параметров: уровня малонового диальдегида и свободнорадикального гемолиза, на уровне антиоксидантов ионола и α-токоферола и в увеличении продолжительности жизни опытных животных.
Установлено достоверное торможение роста солидной опухоли карциномы Герена, а также наблюдалось продление жизни групп животных, которым проводили терапию комплексами рения Re2(i-C3H7COO)4Cl2 и цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2. При этом для соединения Re2(i-C3H7COO)4Cl2 показано наличие слабого торможения опухоли, для цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 – умеренного. Противоопухолевую активность соединений предположительно связывают с их антиоксидантными свойствами. Определена острая и хроническая токсичность для кластеров Re2(i-C3H7COO)4Cl2 и цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 (ЛД50 являются дозы 3200 и 1000-1100 мг/кг для Re2(i-C3H7COO)4Cl2 и цис-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2, соответственно).
Наблюдения и выводы работы о проявленной антиоксидантной и антиканцерогенной активности комплексов вместе с их низкой токсичностью позволяют рекомендовать новосинтезированные соединения рения для дальнейших их биохимических исследований, а также с целью поиска новых низкотоксичных противоопухолевых препаратов в ряду биядерных рениевых соединений.
Ключевые слова: кластерные соединения рения, органические лиганды, антиоксидантные параметры крови, эритроциты, канцерогенез.
SUMMARY
Pirozhkova-Patalakh I.V. Antioxidative and anticarcinogenic activity of cluster compounds of rhenium. – Manuscript.
Thesis for a Candidate’s degree by speciality 03.00.04. – Biochemistry. – V.N. Karazin Кharkov National University, Кharkov, 2001.
series of new cluster rhenium compounds with organic ligands influence on biochemical indexes of blood was studied. The dependence of cell-stabilization by compounds on concentration of incubative solution, formation of hydrolysis shapes, and also on subtle frame of substance is shown: radical structure, axial На1-assistant and configuration compound (cis-, or trance-) on erythrocytes acid hemolysis model in vitro. Antioxidative activity for compounds Re2(i-C3H7COO)4Cl2 and cis-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2 and its dependence on structure and concentration of substance in incubative solution in vitro was found out. The immediate interaction rhenium compounds with ensyme system glucoseoxidase-peroxidase was fixed.
Investigations of the compounds in vivo have shown presence of antihemolytic and antioxidizing activity, that was shown in corrective action of hematological indexes, antioxidative parameters (MDA-level and free-radical hemolysis level) at known antioxidants level and in animal life prolongation, with which conducted therapy by rhenium compounds Re2(i-C3H7COO)4Cl2 and cis-[Re2(GABA)2Cl4(H2O)2]Cl2.
Key words: cluster rhenium compounds, organic ligands, antioxidative parameters of blood, erythrocytes, and carcinogenesis.
| 
