Библиотечный каталог авторефератов Украины

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ПОЛЯК ОЛЬГА БОГДАНІВНА

УДК 54.06:615.218:615.9

ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ

ДОСЛІДЖЕННЯ ЛОРАТАДИНУ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник:                        доктор фармацевтичних наук, професор

БОНДАР Володимир Степанович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри токсикологічної хімії

Офіційні опоненти:                        доктор хімічних наук, професор

БОЛОТОВ Валерій Васильович

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри аналітичної хімії

кандидат фармацевтичних наук, доцент

ЧУБЕНКО Олександр Владкорович

Харківська медична академія післядипломної освіти, доцент кафедри клінічної біохімії та судово-медичної токсикології

Провідна установа:                Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться 14 жовтня 2005 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “_7 вересня   2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, проф.                                                Малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Алергічні захворювання відносяться до найпоширеніших хвороб – до них схильні 10 % населення планети. В наш час відомо понад 150 антигістамінних препаратів. Інтоксикації препаратами даної групи займають одне з провідних місць серед отруєнь лікарськими засобами. Відомі випадки отруєнь антигістамінними препаратами, що виявляють седативну та холінолітичну дію (димедрол, піпольфен, супрастин, тавегіл та ін.). В останнє десятиліття з’явилося ІІ покоління Н1гістаміноблокуючих препаратів, які не проникають через гематоенцефалічний бар’єр і не мають вираженої холінолітичної активності, тому широко використовуються в медичній практиці (терфенадин, астемізол, лоратадин). Фармакодинаміка цих препаратів має, мабуть, інший напрямок. Так, в літературі описані неодноразові випадки отруєнь даними препаратами, в тому числі й лоратадином.

В хіміко-токсикологічному відношенні лоратадин практично не вивчений. В літературі відсутні відомості про методи ідентифікації, кількісного визначення та ізолювання лоратадину з біологічного матеріалу та оптимальні умови екстракції препарату з водних розчинів, його розподіл в органах та біологічних рідинах організму, зберігання в біологічному матеріалі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Хімічний синтез, виявлення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв’язку “структура–дія”, створення нових лікарських препаратів” (1998 – 2002), номер держреєстрації 0198U007011 в УкрІНТЕІ.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – розробка ефективних та експресних методів ізолювання лоратадину з біологічного матеріалу та очищення від домішок; методів його виявлення та кількісного визначення, придатних для хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу, вивчення розподілу в органах тварин і терміну зберігання в біологічному матеріалі.

Для досягнення поставленої мети слід було вирішити задачі:

• провести ТШХ-скринінг лоратадину та дезлоратадину;
• запропонувати чутливі кольорові, осадові та мікрокристалоскопічні реакції для ідентифікації лоратадину, виділеного з біологічного матеріалу;
• розробити чутливі методики виявлення лоратадину методом хроматографії в тонких шарах сорбенту, електрофорезу на папері та спектроскопії в ІЧ- та УФ-областях спектра, що дозволяють відрізнити його від структурних аналогів та препаратів, що можуть використовуватись разом із ним;
• вивчити можливість застосування методу хроматографії в тонких шарах сорбенту для ідентифікації та очищення лоратадину від співекстрактивних речовин у витяжках з біологічного матеріалу, відділення від метаболіту;
• розробити методики кількісного визначення лоратадину, придатні для хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу (УФ-спектрофотометрія, екстракційна фотометрія);
• розробити методики виявлення та кількісного визначення лоратадину та його активного метаболіту – дезлоратадину методом високоефективної рідинної хроматографії;
• вивчити вплив природи органічних розчинників та рН середовища на екстракцію лоратадину та дезлоратадину з водних розчинів;
• порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру (О.О. Васильєвої – виділення водою, підкисленою кислотою оксалатною; В.П. Крамаренка – виділення водою, підкисленою кислотою сульфатною; Стаса-Отто – виділення етанолом, підкисленим кислотою оксалатною) стосовно  лоратадину;
• розробити ефективну та експресну індивідуальну методику ізолювання лоратадину з біологічного матеріалу;
• запропонувати методики виділення лоратадину з біологічних рідин організму (кров, сеча);
• вивчити розподіл лоратадину в органах тварин, отруєних препаратом;
• дослідити зберігання лоратадину в трупному матеріалі при його гнитті;
• на підставі виконаних досліджень розробити схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоратадин.

Об’єкт дослідження. Високоактивний блокатор гістамінових Н1-рецепторів – лоратадин, який широко використовується в медичній практиці для лікування різних алергічних захворювань та його активний метаболіт – дезлоратадин.

Предмет дослідження. Ідентифікація лоратадину та дезлоратадину, кількісне визначення, виділення з біологічного матеріалу та біологічних рідин (кров, сеча), розподіл в органах тварин, зберігання в трупному матеріалі.

Методи дослідження. Для ідентифікації лоратадину у водних розчинах та витяжках з біологічного матеріалу використовували методи тонкошарової хроматографії, високоефективної рідинної  хроматографії, УФ- та ІЧ-спектроскопії, кольорові та осадові реакції, електрофорез на папері; для кількісного визначення – УФ-спектрофотометричний, екстракційно-фотометричний методи, метод високоефективної рідинної хроматографії. Для ізолювання лоратадину з біологічного матеріалу використовували загальноприйняті методи О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто, а також методику ізолювання хлороформом. Вивчення розподілу лоратадину проводили на піддослідних щурах, після їх отруєння. Терміни зберігання лоратадину визначали в секційному матеріалі (печінці).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконано систематичні хіміко-токсикологічні дослідження лоратадину.

Проведено ТШХ-скринінг лоратадину і дезлоратадину. Запропоновано осадові реакції, методи високоефективної рідинної хроматографії, хроматографії в тонкому шарі сорбенту, ІЧ- та УФ-спектроскопії, електрофорезу на папері для виявлення лоратадину, виділеного з біологічного матеріалу. Вказані методи і реакції дозволяють ідентифікувати лоратадин у присутності його метаболіту та інших антигістамінних препаратів, що можуть застосовуватись разом з ним.

Розроблено нові методики кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину, придатні для хіміко-токсикологічного, фармацевтичного та криміналістичного аналізу, методами УФ-спектрофотометрії, екстракційної фотометрії, високоефективної рідинної хроматографії.

Вивчено умови (природа органічного розчинника, рН середовища) екстракції лоратадину та його метаболіту з водних розчинів органічними розчинниками, на основі чого розроблена методика їх ізолювання з біологічного матеріалу для хіміко-токсикологічних досліджень.

Вперше проведено порівняльне вивчення загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру стосовно лоратадину. Розроблено ефективну та експресну індивідуальну методику ізолювання лоратадину з біологічного матеріалу хлороформом.

Запропоновано методики виділення лоратадину з біологічних рідин (крові, сечі).

Вперше вивчено розподіл лоратадину в органах отруєних тварин, що дозволяє вибрати оптимальні об`єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу;  досліджено зберігання лоратадину в біологічному матеріалі при його гнитті.

На підставі виконаних досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного дослідження біологічного матеріалу на вміст у ньому лоратадину.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методики виявлення та кількісного визначення лоратадину, виділеного з біологічного матеріалу, можуть використовуватись на практиці при судово-токсикологічних дослідженнях для вирішення питань про отруєння лоратадином, в клінічних лабораторіях з метою визначення лоратадину в біологічних рідинах, а також у фармацевтичному аналізі.

Розроблені методики хіміко-токсикологічного дослідження лоратадину впроваджені в практику лабораторій Державної інспекції з контролю якості лікарських засобів в Тернопільській обл. (акт від 24.02.04.), Тернопільського обласного бюро судово-медичної експертизи (акт від 19.05.04.), Львівського обласного бюро судово-медичної експертизи (акт від 21.02.05), ДП “Дослідний завод ДНЦЛЗ” (акт від 03.06.04.), а також у навчальний процес Тернопільської медичної академії (акт від 18.05.04.), Львівського медичного університету (акт від 21.10.04.), Запорізького медичного університету (акт від 11.06.04.) та кафедри клінічної біохімії й судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти (акт від 15.06.05).

Особистий внесок здобувача:

• проведено аналіз літературних даних з методів виявлення та кількісного визначення, фармакологічних та токсикологічних властивостей антигістамінного препарату лоратадину та його метаболіту – дезлоратадину;
• проведено ТШХ-скринінг лоратадину та дезлоратадину;
• розроблено методи ідентифікації та кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину у витяжках з біологічного матеріалу та біологічних рідин (кольорові та осадові реакції, методи електрофорезу на папері, тонкошарової, високоефективної рідинної хроматографії; ІЧ-, УФ-спектроскопії та екстракційної фотометрії);
• вивчено умови екстракції лоратадину і дезлоратадину з водних розчинів органічними розчинниками залежно від рН середовища та підібрано оптимальні умови ізолювання препаратів з об’єктів біологічного походження;
• досліджено розподіл лоратадину в органах отруєних тварин, а також зберігання препарату в біологічному матеріалі;
• розроблено схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на лоратадин.

Персональний внесок у всіх опублікованих наукових працях зі співавтором   Бондарем В.С. вказується за текстом дисертації.

Апробація результатів. Основні результати дисертаційної роботи викладені та обговорені на Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003), II Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень 2003” (Дніпропетровськ, 2003), XLVII підсумковій науково-практичній конференції “Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (Тернопіль, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), Науково-практичній конференції “Проблеми діагностики, профілактики та лікування екзогенних та ендогенних інтоксикацій” (Чернівці, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових робіт, з них 4 статті та 7 тез доповідей.

Структура дисертації. Робота викладена на 156 сторінках, містить 34 таблиці, 19 рисунків, 1 схему. Складається зі вступу, 6 розділів, загальних висновків, списку використаних джерел (211 пунктів, з яких 102 – іноземних авторів) та додатків.

На захист виносяться наступні результати експериментальних випробувань і їх теоретичне обгрунтування:

• методи виявлення лоратадину та дезлоратадину осадовими, кольоровими реакціями, електрофорезом на папері, ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопії;
• методики кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину екстракційно-фотометричними, УФ-спектроскопічними та ВЕРХ-методами;
• умови екстракції лоратадину та дезлоратадину органічними розчинниками;
• методики ізолювання лоратадину з органів трупа та біологічних рідин організму;
• результати розподілу лоратадину в органах отруєних ним тварин та його зберігання в біологічному матеріалі.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Лоратадин (І) (кларитин, лорфаст, флонідан, еролін, агістам, кларотадин, веро-лоратадин, ломісан) – етиловий ефір 4-(8-хлор-5,6 дигідро-11Н-бензо[5,6]циклогепта[1,2-в]пірі-дин-11-іліден)-1-піперидин-карбоно-вої кислоти. Загальна формула – C22H23ClN2O2, молекулярна маса 382,89.

Дезлоратадин (ІІ) (дезкарбоетоксилоратадин, еріус) –4-(8-хлор-5,6 дигідро-11Н-бензо[5,6]циклогепта[1,2-в]піридин-11-іліден)-1-піперидин. Загальна фор-мула – C19H19ClN2, молекулярна маса 310,83.

Лоратадин та його активний метаболіт – дезлоратадин – блокатори гістамінових Н1-рецепторів.

Об'єкти та методи досліджень

Для хіміко-токсикологічного дослідження як об`єкти вибрані лоратадин, дезлоратадин та деякі інші антигістамінні препарати (димедрол, дипразин, діазолін, фенкарол, терфенадин, супрастин, тавегіл, астемізол), які при лікуванні алергії можуть використовуватись сумісно; об`єкти біологічного походження (печінка, кров, сеча, мозок, нирки, легені, селезінка, серце, кишечник та шлунок із вмістом).

З методів, обраних для дослідження, використовувались загальноприйняті у хіміко-токсикологічному аналізі методи ізолювання О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто, осадові, кольорові, мікрокристалоскопічні реакції, електрофорез на папері, ТШХ, УФ-, ІЧ-спектроскопія, екстракційна фотометрія, ВЕРХ, та дослідження на тваринах.

Виявлення лоратадину та дезлоратадину

В хіміко-токсикологічному аналізі для ідентифікації речовин, виділених з біологічного матеріалу, проводять комплекс досліджень, який включає різні методи аналізу, що значно підвищує надійність одержаних результатів.

В нашій роботі ідентифікацію лоратадину і дезлоратадину ми проводили хімічними (осадові, мікрокристалоскопічні, кольорові реакції) та фізико-хімічними методами (електрофорез на папері, ТШХ, УФ-, ІЧ-спектроскопія, ВЕРХ).

При проведенні осадових реакцій ми встановили, що з більшістю реактивів лоратадин та дезлоратадин утворюють аморфні осади. Найчутливішими серед осадових реактивів для обох препаратів виявились реактиви Драгендорфа в різних модифікаціях, які дозволяють виявити 1 мкг препарату в пробі (граничне розведення 1:50000). Реактиви Бушарда та Вагнера, 1 % розчини калій перманганату і амоній дихромату мають меншу чутливість (межа виявлення 2 мкг в пробі).

Кристалічні осади спостерігаються з піридинроданідним комплексом та 5 % розчином купрум (ІІ) сульфату, але кристалізація проходить повільно і мікрокристалоскопічна картина нехарактерна.

З кольоровими реактивами лоратадин та дезлоратадин не дають чутливих реакцій (забарвлення не виникає і не змінюється).

При ненаправленому дослідженні лоратадину та його метаболіту ми проводили ТШХ-скринінг речовин, що ізолюються полярними розчинниками, за схемою, розробленою на кафедрі клінічної біохімії та судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти, із внесенням власних підтверджуючих ТШХ-досліджень лоратадин та дезлоратадину (часткова система розчинників – хлороформ, проявник – бромтимоловий синій). В результаті проведених досліджень в біологічному матеріалі можна визначити лоратадин і дезлоратадин в присутності інших отруйних речовин кислотного і основного характеру.

Вивчено умови виявлення лоратадину та дезлоратадину методом хроматографії в тонких шарах сорбенту з використанням різних шарів-носіїв (пластинки Силуфол, Сорбфіл та ВЕТШХ). Запропонований метод дозволяє ідентифікувати і розділити лоратадин та дезлоратадин при їх сумісній присутності і в присутності інших антигістамінних препаратів, які можуть застосовуватися разом з ними.

Оптимальні значення Rf лоратадин має в системах хлороформ – ацетон (8:2) (пластинка Сорбфіл, Rf = 0,53) та н-бутанол – оцтова кислота – вода (4:1:5) (пластинка Силуфол, Rf = 0,46); дезлоратадин – в системах н-бутанол – оцтова кислота – вода (1:1:1) (пластинка Сорбфіл, Rf = 0,48) та етанол – оцтова кислота –вода (5:3:2) (пластинка ВЕТШХ, Rf = 0,51). Найефективніше здійснюється розділення лоратадину, дезлоратадину та інших препаратів аналогічної дії в системах хлороформ – ацетон (8:2), метанол – амоніак (25%) (100:1,5) (пластинка Сорбфіл, Силуфол, ВЕТШХ), н-бутанол – оцтова кислота – вода (1:1:1) (пластинка Сорбфіл).

Для проявлення плям лоратадину та дезлоратадину на хроматографічних пластинках використовували реактиви Драгендорфа в різних модифікаціях (чутливість 1 мкг для обох препаратів), пари йоду (чутливість 1 мкг для обох препаратів), бромфеноловий синій (чутливість для лоратадину – 1 мкг, для дезлоратадину – 5 мкг), бромтимоловий синій (чутливість 1 мкг для обох препаратів). Плями дезлоратадину, на відміну від лоратадину, проявляються в УФ-світлі (чутливість 1 мкг).

Досліджено застосування розроблених умов хроматографування лоратадину для його виявлення у витяжках з біологічного матеріалу та очищення від співекстракивних речовин. Встановлено, що придатною для цієї мети є система хлороформ – ацетон (8:2) та хлороформ.

Вивчено можливість ідентифікації лоратадину та його метаболіту методом УФ-спектроскопії в різних розчинниках: етанолі, 0,1 М розчині кислоти хлоридної, хлороформі. Встановлено, що спектри досліджуваних препаратів характеризуються наявністю однієї смуги поглинання (в етанолі для лоратадину λmax=244 нм, для дезлоратадину λmax=246 нм; в 0,1 М розчині кислоти хлоридної для лоратадину λmax=272 нм, для дезлоратадину λmax=280 нм; в хлороформі для лоратадину λmax=260 нм, для дезлоратадину λmax=248 нм) і практично збігаються, що не дозволяє їх використовувати для ідентифікації і розділення лоратадину та його метаболіту в присутності один одного.

Методом електрофорезу на папері вдалося ідентифікувати і розділити лоратадин та дезлоратадин. Довжина шляху форезу (ДШФ) лоратадину становила 60±0,5 мм, дезлоратадину – 95±0,5 мм.

Встановлено характерні смуги коливання лоратадину в ІЧ-області спектра, см1: 3036 (н С–Н аром. ), 2860 – 2900 (н СН аліф.), 1703 (н С=О ).

Крім наведених методів для ідентифікації лоратадину та дезлоратадину використовували метод високоефективної рідинної хроматографії. Хроматографічний аналіз проводили на рідинному хроматографі “Hewlett Packard” MP 1100 (США) з використанням УФ-детектора. Умови хроматографування: колонка Exslipse XDB C8 довжиною 150 мм, діаметром 4,6 мм, заповнена октасилілсилановим сорбентом з розміром частинок 5 мкм. Рухома фаза – метанол–фосфатний буферний розчин з рН 3,0 (70: 30). Швидкість рухомої фази – 1,5 мл/хв. Температура термостату колонки 40 оС. Детектування при довжині хвилі 220 нм. Об’єм проби 10 мкл.

Для ідентифікації препаратів використовували абсолютний час утримування (для лоратадину tабс.=5,226 хв, для дезлоратадину tабс.=2,469 хв) та абсолютний об’єм утримування (для лоратадину Vабс.=7,839 мл, для дезлоратадину Vабс.=3,704 мл) (рис. 1).

Вивчені методи можуть бути використані для виявлення лоратадину та дезлоратадину, виділених з біологічного матеріалу, при чому УФ-спектроскопія – після додаткового хроматографічного очищення.

Рис. 1. ВЕРХ–хроматограма лоратадину та дезлоратадину при їх сумісній присутності: 1 – дезлоратадин, 2 – лоратадин

t, хв..

Кількісне визначення лоратадину та дезлоратадину

Для кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину розроблено екстракційно-фотометричну, УФ-спектрофотометричну та ВЕРХ – методики, придатні у хіміко-токсикологічному аналізі.

Екстракційно-фотометричне визначення лоратадину здійснювали на фотоелектроколориметрі КФК-2 (світлофільтр з λеф=540±10 нм, товщина кювети 20 мм). Методику розроблено на основі утворення іонного асоціату з метиловим оранжевим, який при рН 4,6 екстрагується хлороформом (відносна помилка 1,89 %, підпорядкування основному закону світлопоглинання – в межах 5,0–200,0 мкг/мл). Розрахунок вмісту лоратадину в досліджуваних розчинах проводили за градуювальним графіком.

Розроблено методику УФ-спектрофотометричного кількісного визначення лоратадину в етанолі та в 0,1 М розчині кислоти хлоридної. Оптичну густину отриманих розчинів вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, у кюветі з товщиною шару рідини 10 мм. Визначено, що світлопоглинання спиртових та кислотних розчинів лоратадину підкоряється закону Бугера-Ламберта-Бера в межах концентрацій від 2,0 до 25,0 мкг в 1 мл обох розчинів. Відносна помилка методів складає ±1,60 % і ±1,46 % відповідно.

Розроблено УФ-спектрофотометричну методику кількісного визначення дезлоратадину в етанолі (відносна помилка 1,18%, підпорядкування основному закону світлопоглинання знаходиться в межах 2,0 – 22,0 мкг/мл).

Запропоновано методики кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину методом ВЕРХ, відносні помилки 0,82 % та 1,05 % відповідно. Межі визначення лоратадину від 1,0 до 200,0 мкг/мл, дезлоратадину від 1,0 до 190,0 мкг/мл. Розрахунок вмісту препаратів в досліджуваних розчинах проводили за градуювальним графіком, побудованим в координатах площа піку препарату – концентрація препарату.

Методики можуть застосовуватись для кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину у витяжках з біологічного матеріалу, причому УФ-спектроскопія – після додаткової очистки методом ТШХ.

Вивчення умов екстракції лоратадину та дезлоратадину

У хіміко-токсикологічному аналізі метод екстракції органічними розчинниками часто використовують для ізолювання лікарських речовин з біологічного матеріалу, їх очищення і концентрування.

Для розробки оптимальних умов ізолювання лоратадину та дезлоратадину з біологічного матеріалу, попередньо вивчено екстракцію препаратів з водних розчинів деякими органічним розчинниками залежно від рН середовища.

При вивченні екстракції лоратадину та дезлоратадину використовували універсальну буферну суміш Бріттона-Робінсона. Кислотність буферних розчинів контролювали потенціометрично. Використовували розчини з рН від 2,0 до 12,0. Як органічні розчинники (екстрагенти) використовували свіжоперегнані хлороформ, діетиловий етер, гексан, бензол та тетрахлорметан.

Як видно з рис. 2, лоратадин екстрагується використаними органічними розчинниками з кислого і лужного середовища. Максимальна екстракція для більшості розчинників спостерігається при рН 5 – 6.

Одержані дані свідчать про те, що оптимальними розчинниками для екстракції лоратадину в процесі виділення його з об’єктів біологічного походження є бензол та хлороформ. Кількість лоратадину, виділеного бензолом та хлороформом становить 97,5% (при рН 5) та 88,0% (при рН 5) відповідно. В подальших дослідженнях ми використовували хлороформ, оскільки бензол виявляє токсичні властивості.

Враховуючи те, що гексан не екстрагує лоратадину з водних розчинів, які мають рН 2, його можна застосовувати для очистки водних витяжок, що містять препарат.

Як видно з рис. 3, екстракція дезлоратадину відбувається в кислих розчинах. Так, при рН 2,0 ступінь одноразової екстракції хлороформом становить 17 %, діетиловим етером – 9,5 %. У випадку з гексаном, екстракція дезлоратадину практично не залежить від рН середовища і становить 7 – 11 %. Максимальна ступінь екстракції дезлоратадину хлороформом (83 – 94 %) має місце при рН 7 – 8, діетиловим етером (78 %) – при рН 11.

Таким чином, найбільш придатним розчинником для виділення дезлоратадину з водних розчинів є хлороформ. Гексан зручно використовувати для очищення витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин в кислому середовищі.

З проведених досліджень видно, що лоратадин добре екстрагується хлороформом зі слабкокислих водних розчинів (рН 5,0 – 6,0), а дезлоратадин – з слабколужних водних розчинів (рН 8,0). Також лоратадин добре екстрагується гексаном при рН 5,0, тоді як дезлоратадин при цьому значенні рН даним розчинником практично не екстрагується. Дані властивості препаратів можна використовувати для їх екстракційного розділення в присутності один одного.

Виділення лоратадину та дезлоратадину з біологічного матеріалу

Досліджено умови ізолювання лоратадину з об’єктів біологічного походження методами, загальноприйнятими у хіміко-токсикологічному аналізі: В.П. Крамаренка, О.О. Васильєвої, Стаса-Отто. При цьому використовували модельні суміші препарату з печінкою.

Встановлено, що методом В.П. Крамаренка вдається виділити 39,6 % препарату, методом О.О. Васильєвої – 45,26 %, а методом Стаса-Отто – 10,40 %.

Результати виділення лоратадину з біологічного матеріалу загальноприйнятими у хіміко-токсикологічному аналізі методами свідчать про їх задовільну, але недостатньо високу ефективність. В літературі описано високоефективний метод ізолювання органічних речовин основного характеру хлороформом. У зв’язку з цим вивчено можливість використання його стосовно лоратадину та дезлоратадину.

Метод базується на елююванні лоратадину хлороформом зі скляної колонки з біологічним матеріалом, розтертим із потрійною кількістю безводного натрій сульфату. Через колонку пропускають хлороформ (100 мл) із швидкістю 60-80 крапель/хв. За цих умов утворюється до 100 мл хлороформного елюату. Оскільки працювати далі з цим об’ємом елюату недоцільно, а упарювання призводить до великих втрат препарату, вимірювали об’єм хлороформної витяжки і відбирали у ділильну лійку третину, збовтували тричі по 10 мл з новими порціями 0,1М кислоти хлоридної протягом 5 – 7 хв. У верхніх водних шарах утворювалась пінна емульсія, яку руйнували центрифугуванням (протягом 5 хв. зі швидкістю 6000 об./хв). Кислу водну витяжку (рН ≈ 2) відокремлювали ділильною лійкою, двічі збовтували протягом 5 хв з новими порціями гексану (по 10 мл). Гексанові шари відокремлювали і далі не досліджували. Кислу водну витяжку підлужнювали 25 % розчином амоніаку до рН 5 – 6 за універсальним індикатором і тричі збовтували з новими порціями хлороформу (по 10 мл). Хлороформні витяжки об’єднували та аналізували. Паралельно проводили контрольний дослід.

Даний метод ізолювання підходить і для виділення дезлоратадину з біологічного матеріалу. Всі операції проводили як і у випадку виділення лоратадину хлороформом. Кислу водну витяжку (рН ≈ 2) відокремлювали ділильною лійкою та підлужнювали 25 % розчином амоніаку до рН = 8 за універсальним індикатором і тричі збовтували з новими порціями хлороформу (по 10 мл). Хлороформні витяжки об’єднували та аналізували. Паралельно проводили контрольний дослід.

Результати кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину свідчать, що застосований метод ізолювання хлороформом ефективніший і дозволяє виділити з біологічного матеріалу до 70 % та до 50 % препаратів відповідно.

Ізолюванням хлороформом зроблено спробу виділити лоратадин з біологічного матеріалу в присутності дезлоратадину. Для цього біологічний матеріал, що містив суміш двох препаратів, розтирали з безводним натрій сульфатом, а далі поводилися, як описано вище. Кислу водну витяжку (рН ≈ 2) розділяли ділильною лійкою, підлужнювали 25 % розчином амоніаку до рН 5 – 6 за універсальним індикатором і тричі збовтували з новими порціями гексану (по 10 мл). Гексанові витяжки об’єднували та аналізували. Водну витяжку підлужнювали 25 % розчином амоніаку до рН = 8 за універсальним індикатором і тричі збовтували з новими порціями хлороформу (по 10 мл). Хлороформні витяжки об’єднували та аналізували. Паралельно проводили контрольний дослід.

При цьому лоратадин переходив у витяжку, отриману при елююванні гексаном, а дезлоратадин – у лужну хлороформну витяжку. При аналізі гексанової витяжки, крім лоратадину знаходили також сліди дезлоратадину (4 – 5 %), у хлороформній витяжці знаходили тільки дезлоратадин, тому, при проведенні хіміко-токсикологічного аналізу і для отримання точніших результатів, рекомендовано ізолювати лоратадин та його метаболіт з двох наважок біологічного матеріалу. З однієї наважки виділяють лоратадин, з іншої – дезлоратадин.

Виявлення лоратадину та дезлоратадину у витяжках з біологічного матеріалу

Лоратадин та дезлоратадин, виділені з біологічного матеріалу, виявляли методом ТШХ, УФ-спектрофотометрії та осадових реакцій, а для кількісного визначення препаратів використовували УФ-спектрофотометричний, екстракційно-фотометричний та ВЕРХ методи. Останні два методи дозволяють проводити визначення препаратів без попередньої очистки хлороформних витяжок з біологічного матеріалу.

Для виявлення лоратадину та дезлоратадину, виділених з біологічного матеріалу методом УФ-спектрофотометрії, а також для кількісного визначення даним методом необхідне додаткове очищення витяжок методом ТШХ. При цьому використовували пластинки Сорбфіл. Системою розчинників для лоратадину є хлороформ. Після висушування та проявлення пластинок спостерігали задовільний розподіл плям лоратадину та співекстрактивних речовин (плями домішок були нижче та вище від плям лоратадину).

У випадку дезлоратадину пластинки з нанесеними пробами вміщували в хроматографічну камеру і тричі елюювали хлороформом. При цьому плями дезлоратадину залишалися на старті, а плями співекстрактивних речовин мігрували у бік фінішу. Після цього пластинки висушували і поміщали в камеру із системою розчинників етанол–оцтова кислота–вода (5:3:2). За цих умов був задовільний розподіл плям дезлоратадину і співекстрактивних речовин.

Для виявлення і кількісного визначення лоратадину та дезлоратадину методом УФ-спектрофотометрії проводили попереднє хроматографічне очищення, як зазначено вище. Після цього ретельно елюювали препарат із фрагменту шару сорбенту, що відповідав плямам лоратадину чи дезлоратадину хлороформом. Екстракт відфільтровували і упарювали. Сухий залишок розчиняли в етанолі. Проводили ідентифікацію і кількісне визначення лоратадину чи дезлоратадину в отриманому розчині методом УФ-спектрофотометрії.

Виділення лоратадину з біологічних рідин

Крім секційного матеріалу запропоновано методики виділення лоратадину з біологічних рідин організму – крові та сечі. Методика базується на осадженні формених елементів крові та сечі розчином кислоти хлоридної, екстракційній очистці кислих витяжок гексаном, підлужненню 25 % розчином амоніаку до рН 5,0 – 6,0 та екстрагуванні лоратадину хлороформом. Методика дозволяє виділити до 40 % лоратадину з крові з відносною помилкою 2,78 % та до 70 % препарату з сечі з відносною помилкою 2,9 %.

Виявлення лоратадину у витяжках із крові та сечі проводили методом ТШХ, УФ-спектрофотометрії, кількісне визначення – екстракційно-фотометричним та УФ-спектрофотометричним методами. Вміст препарату у витяжках визначали за градуювальним графіком. Результати ізолювання лоратадин з біологічних об’єктів (печінка, кров, сеча) за розробленими методиками наведено на рис. 4.

Рис. 4. Результати ізолювання лоратадину з біологічних об’єктів за розробленими методиками:

1 – УФ-спектрофотометрія;

2 – екстракційна фотометрія

Вивчення розподілу лоратадину в органах отруєних ним тварин

При вивченні розподілу лоратадину в органах отруєних тварин (щурів) після перорального введення досліджено ряд органів і біологічних рідин (кров, серце, мозок, печінку, нирки, легені, шлунок та кишечник із вмістом, селезінку, сечу). Для цього використовували щурів масою 170 – 230 г, яких не годували протягом доби.

Результати досліджень показали, що найбільшу кількість лоратадину можна знайти в кишечнику із вмістом, шлунку із вмістом, печінці, мозку та сечі (рис. 5).