|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ´Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Болотова Ольга Володимирівна
УДК 615.212.3:54.062:542.6:543.42.061/062:543.544/545
ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
КЕТОРОЛАКУ
15.00.02-фармацевтична хімія та фармакогнозія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків-2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор
Бондар Володимир Степанович
Національний фармацевтичний університет,
завідувач кафедрою токсикологічної хімії
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Гризодуб Олександр Іванович
ДП „Науково-експертний фармакопейний центр”
зам. директора з наукової роботи
кандидат фармацевтичних наук, доцент
Дмитрієвська Жанна Василівна
Харківська медична академія післядипломної
освіти, доцент кафедри клінічної біохімії
та судово-медичної токсикології
Провідна установа: Запорізький державний медичний університет,
кафедра токсикологічної та неорганічної хімії
Захист відбудеться ” 11 ” листопада 2005 року о 12 00 год. на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул..Блюхера,4).
Автореферат розісланий „ 10 ” жовтня 2005 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради, проф. МАЛОШТАН Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Особливе місце серед усіх медикаментів займають препарати групи нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ) – як засоби, що застосовуються найчастіше, та як „лідери” за частотою побічних ефектів. Саме НПЗЗ є причиною половини усіх ускладнень фармакотерапії, а тому представляють досить великий інтерес в хіміко-токсикологічному відношенні.
В хіміко-токсикологічному відношенні практично не вивчений новий знеболюючий препарат піроло-пірольної групи НПЗЗ − кеторолак, що використовується в медичній практиці у вигляді солі трометаміну. Згідно з літературних даних описані випадки побічних реакцій та летальних отруєнь, викликаних прийомом кеторолаку. Але в літературі відсутні дані про методи ізолювання кеторолаку з біологічного матеріалу, виявлення та кількісного визначення, що придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу. Відсутні відомості про оптимальні умови екстракції кеторолаку з водних розчинів, його розподіл в органах та біологічних рідинах організму, зберігання препарату в біологічному матеріалі.
Тому хіміко-токсикологічне дослідження кеторолаку є актуальною проблемою.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано у відповідності до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблем МОЗ України ”Хімічний синтез, виявлення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв‘язку ”структура-дія”, створення нових лікарських препаратів” (1998-2002), керівник В.П. Черних, номер держреєстрації 0198U007011 в УкрІНТЕІ.
Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження є розробка ефективних та експресних методів виділення кеторолаку з біологічного матеріалу, методів його виявлення та кількісного визначення, що придатні для хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу.
Для досягнення цієї мети нами були поставлені такі задачі:
- запропонувати кольорові та осадові реакції для ідентифікації кеторолаку, виділеного з біологічного матеріалу;
- розробити чутливі методики виявлення кеторолаку за допомогою хроматографії в тонких шарах сорбенту (ТШХ), спектроскопії в ІЧ- та УФ-області спектра, високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та газо-рідинної хроматографії (ГРХ), які дозволяють відрізнити його від деяких інших препаратів групи НПЗЗ;
- розробити методики кількісного визначення кеторолаку, придатні для цілей хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу (УФ-спектрофотометрія, ВЕРХ, ГРХ);
- вивчити вплив природи органічних розчинників та рН середовища на екстракцію кеторолаку з водних розчинів;
- порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин (О.О. Васильєвої – виділення водою, підкисленою щавлевою кислотою; В.П.Крамаренка – виділення водою, підкисленою сірчаною кислотою; Стаса-Отто – виділення спиртом етиловим, підкисленим щавлевою кислотою) стосовно до кеторолаку;
- розробити ефективний та експресний індивідуальний метод ізолювання кеторолаку з біологічного матеріалу;
- запропонувати методики виділення кеторолаку з біологічних рідин організму (кров, сеча);
- вивчити розподіл кеторолаку в органах отруєних ним тварин;
- дослідити зберігання кеторолаку в трупному матеріалі при його гнилісному розкладанні;
- на підставі виконаних досліджень запропонувати схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на кеторолак.
Об’єкт дослідження. Кеторолак – ненаркотичний нестероїдний препарат з сильно вираженим знеболюючим ефектом, використовується у вигляді солі трометаміну для купірування сильних та помірних болей.
Предмет дослідження. Методи ідентифікації та кількісного визначення кеторолаку, виділення з біологічного матеріалу та біологічних рідин (кров, сеча), розподіл в органах тварин, зберігання в трупному матеріалі.
Методи дослідження. Для ідентифікації кеторолаку у витяжках з біологічного матеріалу використовували методи ТШХ, ВЕРХ, ГРХ, УФ- спектроскопії, кольорові та осадові реакції; для кількісного визначення – УФ-спектрофотометричний метод, ВЕРХ та ГРХ. Для ізолювання кеторолаку з біологічного матеріалу використовували загальноприйняті методи О.О.Васильєвої, В.П.Крамаренка, Стаса-Отто, а також метод ізолювання ефіром, який запропоновано нами. Вивчення розподілу кеторолаку проводили на піддослідних щурах після їх отруєння. Терміни зберігання кеторолаку визначали в секційному матеріалі (печінці).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконано систематичні хіміко-токсикологічні дослідження кеторолаку.
Запропоновано кольорові та осадові реакції, методи ВЕРХ, ГРХ та ТШХ, УФ-спектроскопії для виявлення кеторолаку, який виділено з біологічного матеріалу. Розроблено нові методики кількісного визначення кеторолаку, які придатні для цілей хіміко-токсикологічного, фармацевтичного та криміналістичного аналізу, за допомогою методів УФ-спектрофотометрії, ГРХ та ВЕРХ.
Вивчено умови (природа органічного розчинника, рН середовища) екстракції кеторолаку з водних розчинів, на основі чого розроблена методика його ізолювання з біологічного матеріалу та біологічних рідин.
Вперше проведено порівняльне вивчення загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин кислого характеру стосовно до кеторолаку. Розроблено ефективний та експресний індивідуальний метод ізолювання кеторолаку з біологічного матеріалу за допомогою ефіру.
Запропоновано методики виділення кеторолаку з біологічних рідин (крові, сечі).
Вперше вивчено розподіл кеторолаку в органах отруєних тварин, що дозволяє вибрати оптимальні об`єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу.
Вперше досліджено зберігання кеторолаку в біологічному матеріалі при його гнилісному розкладанні.
На підставі виконаних досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на кеторолак.
Практичнее значення отриманих результатів. Розроблені методики виявлення та кількісного визначення кеторолаку, який виділено з біологічного матеріалу, можуть використовуватись на практиці при судово-хімічних дослідженнях для вирішення питань отруєння кеторолаком, в клінічних лабораторіях з метою визначення кеторолаку в біологічних рідинах, а також у фармацевтичному та криміналістичному аналізі.
Розроблені методики хіміко-токсикологічного дослідження кеторолаку впроваджені в практику судово-хімічних лабораторій: лабораторії Харківського обласного бюро судово-медичної експертизи (акт від 17.09.02 р.), лабораторії Тернопільського обласного бюро судово-медичної експертизи (акт від 19.05.04 р.), лабораторії Луганського обласного бюро судово-медичної експертизи (акт від 30.04.03 р.); лабораторії фізико-хімічних методів аналізу ДП “Дослідний завод ДНЦЛЗ” (акт від 25.04.03 р., акт від 17.11.03 р.), а також в навчальний процес Запорізького державного медичного університету (акт від 12.05.04 р.), Тернопільської державної медичної академії (акт від 18.05.04 р.), Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (акт від 21.10.04 р.) та Харківської медичної академії післядипломної освіти (акт від 15.11.2004 р.)
Особистий внесок здобувача:
- проведено аналіз літературних даних з методів виявлення та кількісного визначення, фармакології та токсикології препарату групи НПЗЗ - кеторолаку;
- розроблено методи ідентифікації та кількісного визначення кеторолаку у витяжках з біологічного матеріалу та біологічних рідин (кольорові та осадові реакції, методи ТШХ, ВЕРХ кеторолаку та деяких інших препаратів групи НПЗЗ, що можуть застосовуватись разом з ним; ГРХ, ІЧ- , УФ-спектроскопії);
- вивчено умови екстракції кеторолаку з водних розчинів органічними розчинниками в залежності від рН середовища;
- проведено порівняльну оцінку ефективності ізолювання кеторолаку з біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами;
- запропоновано методику ізолювання кеторолаку з секційного матеріалу за допомогою ефіру діетилового;
- запропоновано методики виділення кеторолаку з біологічних рідин організму (крові, сечі);
- досліджено розподіл кеторолаку в органах отруєних ним тварин, а також зберігання препарату в біологічному матеріалі при його гнилісному розкладанні;
- розроблено схему дослідження біологічного матеріалу на кеторолак.
Персональний внесок у усіх опублікованих наукових працях зі співавтором (Бондарем В.С.) вказується за текстом дисертації.
Апробація результатів дисертації. результати дисертаційної роботи доповідались на V національному з´їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи ії розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999 р.), науковій конференції молодих вчених та студентів НФАУ (Харків, 2000 р.), науково-практичній конференції “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків,2000 р.), Всеукраїнської науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002 р.).
Публікації. По темі дисертації опубліковано 8 наукових робіт, з них 4 статті (у провідних наукових фахових виданнях) та 4 тези доповідей.
Об`єм і структура дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, 5 розділів, загальних висновків, списку літературних джерел, додатків. Загальний обсяг дисертації складає 147 сторінок. В роботі приведено 1 схема, 29 рисунків та 20 таблиц. Перелік використаних літературних джерел вміщує 170 назв, з яких 82 - іноземна.
На захист виносяться наступні результати випробувань і їх теоретичне обгрунтування:
- методики виявлення кеторолаку за допомогою осадових, кольорових реакцій, ТШХ, ГРХ та ВЕРХ, УФ-та ІЧ-спектроскопії;
- методики кількісного визначення кеторолаку УФ-спектроскопічним, ВЕРХ та ГРХ методами;
- умови екстракції кеторолаку органічними розчинниками;
- методики ізолювання кеторолаку з секційного матеріалу та біологічних рідин (кров, сеча);
- результати розподілу кеторолаку в органах отруєних ним тварин і його зберігання в біологічному матеріалі.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Кеторолаку трометамін - (±)-5-бензоїл-2,3-дигідро-1Н-піролізин-1-карбонова кислота, сіль з 2-аміно-2- (гідроксиметил)-1,3-пропандіол (1:1)
Кеторолаку трометамін - C15H13NО3·. C4H11NО3, молекулярна маса 376,4.
Кеторолак - C15H13NО3, молекулярна маса 255,27
Кеторолак – новий знеболюючий препарат піроло-пірольной групи НПЗЗ, використовується у вигляді солі трометаміну для купірування сильних та помірних болей.
Об′єкти та методи дослідження
Об'єктами дослідження для вирішення поставлених задач були: кеторолак (C15H13NО3) (вільна кислота) та деякі інши НПЗЗ.
Для дослідження використовували загальноприйняті у хіміко-токсикологічному аналізі методи ізолювання (Стаса-Отто, О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка), осадові, кольорові реакції, УФ-та ІЧ-спектроскопію, методи ТШХ, ВЕРХ, ГРХ та дослідження на тваринах.
Ідентифікація кеторолаку
Нами вивчена можливість використання для виявлення кеторолаку при хіміко-токсикологічних дослідженнях кольорових та осадових реакцій, методів ТШХ, ГРХ, ВЕРХ та УФ-спектроскопії.
Досліджено кольорові реакції кеторолаку та деяких інших препаратів групи НПЗЗ з концентрованими сірчаною та азотною кислотами, реактивами Ердмана, Маркі, Фреде, Манделіна та Лібермана. Найбільш селективним та чутливим є реактив Лібермана, який дозволив відрізнити кеторолак від інших НПЗЗ (чутливість реакції становить 200 мкг у пробі).
При дослідженні мікрокристалоскопічних реакцій на кеторолак використовували наступні осадові реактиви: розчин таніну, пікринову кислоту, реактиви Вагнера, Драгендорфа, фосфорно-молібденову кислоту. Найбільш чутливими реактивом виявилась кислота пікринова, яка з кеторолаком утворює білий кристалічний осад (чутливість реакції складала 200 мкг в пробі ).
Досліджено умови виявлення кеторолаку та деяких інших НПЗЗ за допомогою методу ТШХ на пластинках ВЕТШХ, Силуфол, Сорбфіл та зворотно-фазної пластинки RP-18 “Merck” з використанням систем розчинників кислого, нейтрального та лужного характеру.
Вивчено поведінку кеторолаку в системі ТШХ-скринінгу, що використовується в практиці судово-токсикологічних лабораторій в Україні, у присутності деяких препаратів (діазепам, фенобарбітал, антипірин, кофеїн, АСК, індометацин та ін), які при ізолюванні можуть потрапляти в “кислу” витяжку разом з кеторолаком.
На попередньому етапі ТШХ-скринінгу препарати досліджували в загальних системах: хлороформ-ацетон (8:2), етилацетат, етилацетат-метанол-25% розчин аміаку (85:10:2,5), толуол-ацетон-етанол-25% розчин аміаку (45:45:7,5:2,5). Як проявники використовували УФ-світло, розчин калію перманганату, розчини ртуті нітрату і дифенілкарбазону, розчин заліза (III) хлориду та реактив Драгендорфа за Муньє з додатковою обробкою 20% розчином кислоти сірчаної.
Встановлено, що в даних системах кеторолаку не заважають фенобарбітал, діазепам, кофеїн та антипірин, решта досліджуваних речовин (індометацин, ібупрофен, ніфлумова кислота, саліцилова кислота, АСК) находяться в одній хроматографічної зоні з кеторолаком і при цьому дають з проявниками однаково забарвлені плями.
На другому етапі хроматографування проводили в часткових системах розчинників, оптимальних для розділення зазначених препаратів: хлористий метилен - ацетон - оцтова кислота (95:5:2), гексан-хлороформ-мурашина кислота (10:95:0,3) на пластинках Сорбфіл та в системі метанол –вода - оцтова кислота (80:20:1) на пластинці RP-18 (“Merck”). Як проявники використовували УФ-світло, послідовну обробку 0,5 н розчином міді сульфату і 0,3 н розчином калію йодиду, яка при взаємодії з кеторолаком та індометацином дає перехід забарвлення плями від зеленого кольору (після обробки 0,5 н розчином міді сульфату) до коричневого (після обробки 0,3 н розчином калію йодиду), а також реактив Лібермана, що дозволяє відрізнити кеторолак (пляма оранжево-жовтого кольору) від індометацину (пляма чорного кольору).
Досліджено поведінку кеторолаку в УФ-області спектра в різних розчинниках. Встановлено, що в області спектра від 280 нм до 360 нм кеторолак в спирті етиловому та спирті метиловому має максимум поглинання при довжині хвилі 318±2 нм, у 0,1 М розчині калію гідроксиду – 323±2 нм, у хлороформі – 312±2 нм, у бензолі - 309±2 нм.
ІЧ-спектр кеторолаку (в таблетках з KBr) характеризується наявністю смуг поглинання з частотою 3374, 2924, 1588, 1563, 1382, 1278, 1051,731 см-1.
Крім того, досліджено умови виявлення кеторолаку з використанням інструментальних хроматографічних методів (ВЕРХ та ГРХ).
Дослідження за допомогою методу ВЕРХ проводили на рідинному хроматографі “Hewlett Packard” НР 1100 (США) з діодно-матричним детектором на колонці Supelсosil ABZ розміром 250 4,6 мм, з розміром частинок 5 мкм. Як рухому фазу застосовували систему розчинників ацетонітрил – 0,002 М розчин кислоти сірчаної (40:60), швидкість рухомої фази – 1,5 мл/хв, температура термостату колонки - 30оС. Детектування проводили при довжині хвилі 312 нм. Виявлення кеторолаку проводили за часом утримання (tR), який дозволяє одержувати надійні результати у процесі ідентифікації препарату при паралельному хроматографуванні стандартного розчину кеторолаку. Використання діодно-матричного детектора при цьому дозволяє ідентифікувати кеторолак не тільки за часом утримання піка (рис.1) , але й за УФ-спектром отриманого піка препарату (рис.2).
Рис.1.ВЕРХ-хроматограма розчину
кеторолаку (20 мк/мл)
Рис.2. УФ-спектр кеторолаку в 96% спирті,
отриманий з ВЕРХ-хроматограми
Крім того, розроблені умови хроматографування були використані для ідентифікації кеторолаку в присутності ряду препаратів, які можуть використовуватись разом з ним (ацетилсаліцилова кислота та трамадол).
Рис. 3. ВЕРХ-хроматограма розчину трамадолу (1), ацетилсаліцилової
кислоти (2) та кеторолаку (3)
Попереднє дослідження УФ-спектрів препаратів показало, що АСК і трамадол в концентрації 400 мкг/мл у 96% спирті етиловому при довжині хвилі 312 нм мають низьке значення оптичної густини, що не заважає ідентифікувати кеторолак в зазначених умовах. Аналіз суміши проводили при довжинах хвиль 254; 275 та 280 нм.
Як що за допомогою методу ВЕРХ можливо виявити та розділити кеторолак у нативному вигляді, то при використані методу ГРХ ми зіштовхнулися з деякими труднощами, пов´язаними з тим, що кеторолак у нативному вигляді не хроматографується. Тому нами було запропановано хроматографувати кеторолак у вигляді його продукту етерифікації (ПЕК). Продукт етерифікації одержували при взаємодії кеторолаку зі спиртом метиловим при нагріванні в присутності каталізатора ацетилу хлористого. Одержаний ПЕК визначали на газовому хроматографі фірми “Hewlett Packard” НР 6890 з полум’яно-іонізаційним детектором , на капілярній кварцевій колонці НР-1 розміром 25 м * 0,32 мм, з товщиною шару нерухомої фази (метилсилоксан) 0,17 мкм, температура термостату колонки програмується – спочатку температуру 80оС підтримують протягом 2 хвилин, потім підвищують температуру зі швидкістю 40оС/хв до 300оС і дану температуру підтримують протягом 5 хв; температура інжектора – 320оС, температура детектора - 330оС; об’ємна швидкість газу-носія (гелій) – 2мл/хв, ділення потоку – 1:2. Для проведення аналізу використовували метод внутрішнього стандарту. Як стандарт використовували ментиловий ефір ізовалеріанової кислоти. Відносний час утримання метилового ефіру кеторолаку становить близько 1,4 (час утримання ментилового ефіру ізовалеріанової кислоти прийнято за 1) (рис.4).
Рис.4. ГРХ-хроматограма розчину ПЕК
Рис.5. ВЕРХ-хроматограма суміші розчинів кеторолаку та ПЕК
| 
