Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ХАРХУН МАКСИМ ІВАНОВИЧ

УДК 352.5:616.12-008.331.1

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОТЕНЦІАЛКЕРОВАНИХ ІОННИХ СТРУМІВ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ АРТЕРІЙ ГЕНЕТИЧНО ГІПЕРТЕНЗИВНИХ ЩУРІВ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Захист відбудеться “ 14 ” листопада 2000 р. о “_14_” годині на засіданні  спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_9_” жовтня 2000 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

Доктор біологічних наук                                Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. При розвитку генетичної гіпертензії спостерігається підвищення резистивності периферичних кровоносних судин. Таким чином, ці судини можуть бути одним із визначних факторів у регуляції кров’яного тиску. В свою чергу, важливу роль в регуляції скорочувальної активності васкулярних гладеньких м'язів відіграють потенціалкеровані калієві та кальцієві канали. Так, мембранний потенціал васкулярних міоцитів строго залежить від калієвої провідності мембрани міоцитів, а зміна напруження судин корелює з мембранним потенціалом (Harder 1984). Хоча механізм вивільнення кальцію із внутрішньоклітинних депо є відповідальним за підтримання сили після активації агоністом в гладеньких м'язах (Somlyo 1968) підтримання тонусу васкулярних гладеньких м'язів вимагає постійного входу іонів кальцію до клітини із зовнішньоклітиного середовища (Shuba 1986, Ratz et al 1987). Залежність між калієвою провідністю, мембранним потенціалом, та входом кальцію через потенціалкеровані Ca2+ канали L-типу показано у васкулярних гладеньких м'язах (Nelson et al. 1990). Також для гладеньких м'язів характерний той факт, що вхід кальцію до клітин при потенціалах близьких до порогу активації Ca2+ каналів L-типу прямо впливає на підтримання постійної внутрішньоклітинної концентрації Ca2+ ([Ca2+]I) (Fleischmann et al 1994).

Дослідження потенціалзалежних іонних струмів поодиноких васкулярних міоцитів при гіпертензії стали можливими завдяки впровадженню методу фіксації потенціалу і перші роботи почали з'являтись на початку останнього десятиріччя. Так в культуральних васкулярних міоцитах вен генетично гіпертензивних щурів було показано збільшення амплітуди вхідного кальцієвого струму (Hermsmeyer 1989). Підвищення активності Ca2+ каналів L-типу мембрани міоцитів при гіпертензії було показано для свіжоізольованих міоцитів інших артерій (Lozinskaya et al 1997, Simard et al 1998). Збільшення Ca2+ струму в міоцитах генетично гіпертензивних щурів може відбуватися принаймні двома шляхами: 1) збільшенням кількості функціонуючих Ca2+ каналів в плазматичній мембрані; 2) збільшенням частоти відкривання існуючих Ca2+ каналів. Було також виявлено, що модулятори Ca2+ каналів проявляють більш сильну дію на препаратах артерій гіпертензивних щурів (Bruner 1990 et al, Storm et al 1993).

Досліджень в області потенціалзалежних К+ каналів при гіпертензії досить небагато і ці дослідження демонструють збільшення струму через Ca2+-залежні K+ канали (IK(Ca)) у васкулярних міоцитах генетично гіпертензивних щурів (Rusch et al 1992, England et al 1993, Liu et al 1997), хоча ці дані не пояснюють підвищену скорочувальну активність васкулярних гладеньких м'язів при гіпертензії.

На цей час нема вагомих даних про участь К+ каналів, які відрізняються за своїми біофізичними характеристиками при гіпертензії в регуляції мембранного потенціалу. На наш погляд, порівняння амплітудно-кінетичних характеристик потенціалзалежних калієвих струмів у нормотензивних щурів та при розвитку гіпертензії разом із дослідженням участі відповідних каналів у регуляції мембранного потенціалу є найбільш адекватним підходом для дослідження цієї проблеми. При дослідженні Ca2+ струмів велику увагу було приділено компоненту струму через Ca2+ канали L-типу, який не інактивується, і може в той же час відігравати чи не головну роль в постійному вході іонів Ca2+ до міоцитів васкулярних гладеньких м'язів при певній величині мембранного потенціалу.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України: "З'ясування молекулярних механізмів специфічних змін провідності клітинних мембран при виникненні основних нервових процесів" та "Механізми електро- та хемокерованої кальцієвої провідності мембрани та її роль у спряженні збудження-скорочення в гладеньких м'язах", "Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком'язових клітин".

Мета і завдання дослідження. Враховуючи вищевикладене, метою даної роботи було дослідити функціонування потенціалкерованих іонних каналів при розвитку генетичної гіпертензії. Для досягнення цієї мети було поставлено такі задачі:

1. Розробити методику виділення міоцитів резистивних мезентеріальних артерій щура та застосувати до них методики фіксації потенціалу та фіксації струму.
2. Дослідити амплітудно-кінетичні характеристики та фармакологічні властивості вихідних К+ струмів міоцитів резистивних мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів.
3. Дослідити участь К+ каналів у регуляції мембранного потенціалу міоцитів мезентеріальних артерій щурів та дію блокаторів К+ каналів на мембранний потенціал.
4. Порівняти амлітудно-кінетичні характеристики вхідного Ca2+ струму міоцитів резистивних мезентеріальних артерій для нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. В міоцитах мезентеріальної артерії щура за допомогою методу "patch-clamp" було віднайдено, що 4-амінопіридин (4-АП), блокатор потенціалкерованих К+ каналів, викликає деполяризацію мембрани міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних щурів.

Показано, що в міоцитах резистивних мезентеріальних артерій генетично гіпертензивних щурів 4-АП-чутливий компонент К+ струму значно менший, ніж у нормотензивних при незначній різниці в сумарному калієвому струмі.

Показано, що стаціонарний компонент Ca2+ струму, що не інактивується, значно більший у міоцитів резистивних мезентеріальних артерій генетично гіпертензивних щурів, ніж у нормотензивних щурів.

Теоретична та практична цінність роботи. На основі отриманих даних можна припустити, що віднайдені зміни іонних струмів васкулярних міоцитів генетично гіпертензивних тварин можуть бути причиною підвищеного тонусу кровоносних судин, а отже і підвищенням артеріального тиску при розвитку гіпертензії. Нові дані, отримані в цьому напрямку, є важливими для формування більш повного уявлення про фізіологічні відмінності, які виникають при гіпертензії.

При розвитку гіпертензії відбувається підвищений вхід іонів кальцію через потенціалкеровані Ca2+ канали до міоцитів васкулярних гладеньких м'язів. Практична цінність роботи полягає в тому, що використання нових кальцієвих антагоністів може призводити до зменшення тонусу кровоносних судин. Оскільки у нашому випадку спостерігається зменшення 4-АП-чутливої компоненти потенціалкерованого калієвого струму, то використання специфічних активаторів калієвих каналів дозволять зменшувати тонус кровоносних судин та знижувати кров’яний тиск при гіпертензії. Пошук же нових активаторів потенціалзалежних К+ каналів може призвести до появи високоспецифічних вазодилаторів кровоносних судин.

Особистий внесок. Всі експерименти описані в дисертаційній роботі, розробка методики та виділення функціонально повноцінних міоцитів, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу були виконані особисто автором.

Дослідження участі потенціалзалежних калієвих каналів у регуляції мембранного потенціалу проводились разом з к.б.н. Белевічем А.Е.

В розробці концепції роботи активну участь брали інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались та обговорювались на ІІ з'їзді українського біофізичного товариства (Харків, 1998), на сесії українського біофізичного товариства (Одеса, травень, 2000), на семінарах відділу нервово м'язової фізіології та інститутському семінарі Iнституту фізіології ім О. О. Богомольця НАН України (1997, 1998, 1999).

Публікації. Матеріали роботи опубліковані в семи наукових статтях та трьох тезах доповідей

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 184 найменувань. Робота викладена на 112 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 24 рисунками та 4 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

       Основна частина експериментів виконана на поодиноких ізольованих міоцитах гілочок другого та третього порядку мезентеріальної артерії нормотензивних  та генетично гіпертензивних щурів. В експериментах використовувались дорослі (18-26 тижнів) тварини обох статей масою 200-350 г. Середній систолічний тиск становив у нормотензивних 118±±5 mm Hg, тоді як у гіпертензивних 169±±7 mm Hg. Міоцити отримували за допомогою методу ферментативно-механічної ізоляції. Для цього шматочки мезентеріальної артерії вирізали та відділяли від жирової та сполучної тканини в номінально безкальцієвому розчині Кребса при температурі 30 - 35 °°С. Після цього шматочки артерій клали до цього ж розчину, який містив колагеназу тип ХI (1 мг/мл), папаїн (0.25 мг/мл), бичачий сироватковий альбумін (1 мг/мл), дитіотреітол (0.1 мг/мл). В цьому розчині шматочки артерій інкубували протягом 20 - 30 хвилин при температурі +37 °°С. Функціонально повноцінні ізольовані міоцити резистивних артерій отримували після цього шляхом багаторазового пропускання шматочків артерій через пастерівську піпетку із свіжим номінально безкальцієвим розчином, який містив 0.1% бичачого сироваткового альбуміну. Частина експериментів була виконана на ізольованих гладеньком’язових клітинах із мезентеріальної артерії та сліпої кишки (taenia coli) морської свинки, а також сім’явидільних протоків щура, виділення міоцитів яких суттєво не відрізнялась від згаданої для мезентеріальних артерій.

Для дослідження іонних струмів через Са2+ канали ізольованих міоцитів застосовували модифікований "perforated patch-clamp" метод з використанням антибіотика амфоторіцина Б. Принцип методу полягав у створенні щільного (гігаомного) контакту між стінками кінчика піпетки та мембраною клітини з наступним перфоруванням ділянки мембрани під піпеткою амфоторіцином Б. Для дослідження К+ струмів застосовували классичну "whole cell" модифікацію методу "patch clamp". Принцип цього методу полягає в отриманні гігаомного контакту та наступного проривання ділянки мембрани під піпеткою короткими імпульсами негативного тиску. Мікропіпетки для вимірювання трансмембранних іонних струмів виготовлювали із м'якого молібденового скла за методикою описаною в роботі Hamil et al (1981). Вихідний зовнішній розчин для реєстрації калієвих струмів містив (мМ): NaCl 135, KCl 5.9, MgCl2 1.2, CaCl2 2.5, d-глюкоза 5, HEPES 10. Піпетковий розчин для реєстрації цих струмів мав такий склад: KCl 85, KH2PO4 30, MgSO4 5, EGTA 2, HEPES 10, MgATФ 5, Li3ГТФ 1. В якості носія струму через Ca2+ канали використовували іони Ва2+ (5мМ). Вихідний зовнішній розчин для реєстрації Ва2+ струму містив (мМ): CsCl 5.9, MgCl2 1.2, BaCl2 5, d-глюкоза 5, HEPES 10, 4-АП 5, ТЕА 10 мМ. Піпетковий розчин для реєстрації цих струмів був наступного складу: CsCl 140, MgSO4 2, EGTA 10, HEPES 10 мМ.

Фіксація потенціалу та реєстрація струмів здійснювилась за допомогою підсилювача PATCH-CLAMP L/M EPC 7 з опором зворотнього звязку перетворювача струм-напруга 500 МОм. Сигнал з виходу підсилювача потрапляв на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200A (Axon Instruments) та далі в комп'ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм "pCLAMP 5.5" та “Origin 5.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Характеристика трансмембранного струму міоцитів мезентеріальних артерій. В міоцитах мезентеріальних артерій у відповідь на ступінчате деполяризуюче зміщення мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу -80 мВ до рівнів більш позитивних, ніж –40 мВ виникав вихідний струм, який повільно активувався та досягав максимуму в проміжку 200 мс при тестуючому потенціалі –10 мВ (рис.1.А.). Кінетика активації та амплітуда струму зростали разом зі збільшенням величини деполяризації. При потенціалах від –30 до +30 мВ інколи ставав помітним вхідний струм, амплітуда якого звичайно не перевищувала 100 пА. В деяких міоцитах на 2-6 мс початку деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу з’являвся вихідний струм зі швидкою кінетикою активації та інактивації.

Дія ТЕА та 4-АП на вихідний струм. Додавання до зовнішнього розчину неселективного блокатора К+ каналів ТЕА в концентрації 10 мМ суттєво інгібувало, а подальше додавання неселективного блокатора К+ каналів 4-АП в концентрації 5 мМ майже повністю блокувало вихідний струм при підтримуваному потенціалі -80 мВ (рис 1.А). Струм, який залишався, лінійно залежав від мембранного потенціалу в області потенціалів від –40 мВ до +30 мВ і можливо представляє неспецифічний вихідний струм.

На рисунку 1.Б. представлені вольт-амперні характеристики (ВАХ) вихідного струму в контролі (51 клітина), в присутності 10 мМ ТЕА (12 клітин), в присутності 10 мМ ТЕА та 5 мМ 4-АП (6 клітин). Для побудови ВАХ використовували середнє значення струму за останні 100 мс 400 мілісекундного тестуючого імпульсу нормовані до значення ємності клітини (пФ), що дало змогу виключити вплив можливої різниці величини площі поверхні клітин на амплітуду струму.

Характеристика IK(Ca) струму міоцитів мезентеріальної артерії. Була досліджена дія харібдотоксину – селективного блокатора K(Ca) каналів великої провідності - на К+ струм (ІК) міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних щурів для кожного тестуючого потенціалу через кожні 10 мВ від –60 до +70 мВ при підтримуваному потенціалі –80 мВ (рис.2.А). На рисунку 2.Б. представлені відповідні ВАХ, побудовані як середні значення величин струму останніх 100 мс тестуючого імпульсу нормовані до 1. При тестуючому потенціалі +70 мВ 200 нМ харібдотоксину інгібувало вихідний струм у середньому на 63±±5 %. Збільшення концентрації харібдотоксину до 500 нМ не змінювало амплітудно- кінетичні характеристики струму. Виходячи з цього, вважали що 200 нМ харібдотоксину максимально блокує IK(Ca). В наших дослідженнях, проведених на інших об’єктах (taenia coli морської свинки та vas deferens щура), також виявлено, що харібдотоксин значно пригнічує вихідний струм. У той же час апамін (500 нМ), селективний блокатор K(Ca) каналів малої провідності, на відміну від клітин taenia coli морської свинки не виявляв блокуючої дії на ІК міоцитів мезентеріальних артерій щурів.

мембранного потенціалу до +60 мВ від підтримуваного –80 мВ. Отже в мембрані міоцитів мезентеріальної артерії є потенціалкеровані К+ канали, чутливі до 4-АП. Те, що 4-АП не усуває осциляції струму, може свідчити на користь того факту, що блокуюча дія 4-АП не розповсюджується на КСа канали, активність яких звичайно формує ці осциляції.

мМ ТЕА (8 клітин), в присутності 10 мМ ТЕА + 5 мМ 4-АП (6 клітин). Виявлено, що інгібуюча дія 5 мМ 4-АП була значно меншою у гіпертензивних тварин, що може свідчити про менший внесок 4-АП- чутливого компоненту струму в міоцитах генетично гіпертензивних щурів.

       Сумарна діаграма на рисунку 6 зображує  ефект зовнішнього ТЕА в концентрації 1 мМ, 10 мМ, та  10 мМ ТЕА та 5 мМ 4-АП на ІК міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів при підтримваному потенціалі –80 мВ та тестуючому до +40 мВ. По  осі   ординат   подано

Мебранний потенціал міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних щурів. Реєстрація потенціалу спокою ізольованих міоцитів мезентеріальної артерії проводилась за допомогою методики “patch clamp” в режимі “фіксація струму”. Всі тестовані міоцити нормотензивних щурів (н=106) мали потенціал спокою в області потенціалів від –70 до –10 мВ із середнім значенням –38 ±± 3 мВ (рис. 7.А). ТЕА в концентраціях 1 та 10 мМ, доданий до зовнішнього розчину не викликав зміни потенціалу спокою в клітинах з мембранним потенціалом –50 - -40 мВ, тобто в діапазоні, близькому до нормальних фізіологічних умов. ТЕА в концентрації 1  мМ значно пригнічував активність спонтанних  гіперполяризацій  в  клітинах, які мали потенціал вище ніж –30 мВ (рис 7.Б, В).

4-АП (5 мМ), доданий до зовнішнього розчину викликав деполяризацію мембрани міоцитів при потенціалах спокою -50 … -35 мВ (рис 7.Г). Цей ефект добре відмивався і потенціал мембрани повертався до попереднього рівня. Середнє значення деполяризуючої дії 4-АР становило 12±±1 мВ для 5 міоцитів мезентеріальної артерії.

Порівняльна характеристика Ca2+ струмів міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних  щурів. З метою збільшення вхідного струму через Ca2+ канали мембрани міоцитів мезентеріальних артерій замість іонів Ca2+, як носіїв цього струму, використовували іони Ва2+ (5мМ). Було показано, що в даних міоцитах вхідний Ва2+ струм (IBa) струм переноситься через Са2+ канали L- типу, які є високочутливі до дигідропіридинів.

Для того, щоб усунути можливу різницю в площі поверхні клітин величину IBa представляли як величину відносної густини струму – відношення амплітуди IBa до ємності мембрани клітини - пА/пФ. Ємність досліджуваних клітин не відрізнялась суттєво у нормотензивних та гіпертензивних тварин і становила відповідно 27.2±±0.2 пФ (n=18) та 26.1±±0.3 пФ (n=12). Це свідчило  також про незначну різницю в розмірах міоцитів гілочок другого та третього порядку мезентеріальної артерії щурів.

       Густина IBa була значно більшою у генетично гіпертензивних щурів і становила на максимумі ВАХ при підтримуваному потенціалі -80 мВ -3.8±±0.5 пА/пФ,

Була досліджена також стаціонарна активація (d∞Ґ) IBa для міоцитів нормо- та гіпертензивних тварин. Стаціонарну активацію виражали як провідність - GBa = IBa/(Ем-EBa), де IBa амплітуда струму для кожного командного потенціалу Ем; EBa -рівноважний

зображеним на рис.9.в. Крива стаціонарної інактивації IBa для міоцитів генетично гіпертензивних щурів була зміщена в область більш додатніх потенціалів у порівнянні з кривою для  міоцитів нормотензивних тварин. Криві стаціонарної інактивації IBa, описуються рівнянням Больцмана для клітин нормотензивних (12 клітин) та гіпертензивних (10 клітин) щурів з відповідними потенціалами половинної інактивації -24.2±±0.4 мВ і –21.4±±0.4 мВ та крутизною -8.3±±0.2 мВ і –8.7±±0.3 мВ.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Калієвий струм мембрани міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів. Основною метою дослідження К+ струму мембрани ізольованих міоцитів резистивних гілочок (діаметр 50- 400 мкм) мезентеріальної артерії нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів, було виділити компоненти цього струму та порівняти їх фармако-біофізичні властивості у нормотензивних щурів та тварин з генетично обумовленою гіпертензією. Об’єктом наших експериментів були міоцити резистивних артерій, які як відомо, відіграють чи не визначну роль у регуляції артеріального тиску, на відміну від більшості попередніх досліджень, які були проведених на міоцитах кондуктивних судинах.

В наших дослідах ТЕА (1мМ) блокує К+ струм подібним чином до 200 нМ харібдотоксину, що дає можливість стверджувати, що 1 мМ ТЕА блокує переважно IK(Ca) канали великої провідності. Відмінності між нормотензивними та генетично гіпертензивними щурами у величині компоненту K+ струму, який був чутливий до 1 мМ ТЕА, була незначною. Тобто, в міоцитах мезентеріальних артерій гіпертензивних щурів амплітуда IK(Ca) струму була майже такою ж, як і у нормотензивних тварин.

На противагу нашим результатам, дані отримані на аорті та мозкових судинах (Liu et al 1997, 1998, Rusch 1996) вказують на значне підвищення активності IK(Ca) каналів великої провідності за рахунок збільшення їх експресії в мембрані міоцитів судин. Автори вважають (Rusch 1996), що збільшення кількості каналів в мембрані міоцитів паралельно із зростанням артеріального тиску під час розвитку гіпертензії є фундаментальним адаптивним механізмом, оскільки IK(Ca) канали можуть служити зворотнім механізмом, тобто збільшення числа каналів призведе до пригнічення підвищеної скорочувальної активності при гіпертензії.

Струм, що який залишався після блокування значної компоненти харібдотоксином, відповідав характеристикам струму потенціалзалежного струму затриманого випрямлення (КV): активація струму прискорювалась зі збільшенням деполяризації мембрани міоцитів, досягнувши певної величини, струм повільно інактивувався, демонстрував потенціалзалежність, та низьку чутливість до блокуючої дії 1 мМ ТЕА. Тільки подальше додавання 10 мМ ТЕА до зовнішнього розчину інгібувало цей струм. Отже, в генерації даного струму беруть участь потенціалкеровані K+ канали затриманого випрямлення.

Криві стаціонарної інактивації сумарного вихідного К+ струму в контролі, в присутності ТЕА в концентрації 1 та 10 мМ помітно відрізнялись між собою, що підтверджує участь в його генерації принаймні двох типів потенціалкерованих калієвих каналів.

В міоцитах мезентеріальної артерії нормотензивних щурів ТЕА (1 мМ) не впливав на величину мембранного потенціалу спокою клітин з потенціалами, що знаходились в межах від –55 до -35, проте ТЕА інгібував спонтанні спайкоподібні гіперполяризації що виникали в міоцитах, з потенціалом спокою вище –30 мВ. Спайкоподібні гіперполяризації міоцитів інтактних артерій можуть підсумовуватися в суцільну гіперполяризацію. Допускається, що спонтанні гіперполяризації генеруються активацією IK(Ca) каналів, які в свою чергу активуються іонами Са2+, що вивільняються із внутрішньоклітинних депо.

4-АП (5 мМ) викликав деполяризацію міоцитів нормотензивних тварин, що мали потенціал спокою –50 - -40 мВ. Це могло свідчити про те, що 4-АП-чутливі К+ канали буруть участь у формуванні потенціалу спокою міоцитів мезентеріальних артерій. Проте 4-АП не деполяризував препарати базилярної артерії морської свинки (Fujivara 1983).

Таким чином, в міоцитах мезентеріальних артерій щура можна виділити такі основні компоненти потенціалзалежного вихідного К+ струму: 1) струм кальційзалежних калієвих каналів високої провідності (IK(Ca)), чутливий до блокуючої дії харібдотоксину та малих концентрацій ТЕА (1 мМ); 2) КV струм затриманого випрямлення, чутливий до блокуючої дії високих концентрацій ТЕА (10 мМ); 3) КV струм, чутливий до 4-АП; 4) неспецифічний компонент вихідного струму не чутливий до високих концентрацій ТЕА (10 мМ) та 4-АП (5 мМ). В межах близьких до потенціалу спокою міоцитів 4-АП- чутливі К+ канали беруть участь у формуванні цього потенціалу, тоді як КСа канали впливають на величину мембранного потенціалу тільки помітно деполяризованих міоцитів.

КV канали відіграють важливу роль у регуляції сумарної калієвої провідності мембрани міоцитів артерій, які не здатні генерувати потенціали дії. Активація каналів цього типу у відповідь на прикладення тиску чи вазоконстрікцію може протидіяти деполяризації мембрани. Так у деяких артеріях дія 4-АП може викликати скорочення артерій чи деполяризацію (Cox 1996, Harder 1984). Активність КV каналів може модулюватись вазоконстікторами та вазодилаторами; так в роботі Ishikawa et al (1993) 4-АП-чутливий струм в коронарній артерії кролика інгібувався агоністом гістамінових Н1 рецепторів. Це свідчить на користь того факту, що інгібування 4-АП-чутливого струму може бути викликане збільшенням [Ca2+]I внаслідок вивільнення із внутрішньоклітинних депо після активації агоністом.

Згідно нашим даним, величина 4-АП-чутливого компоненту К+ струму міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних щурів значно більша, ніж у генетично гіпертензивних тварин. Це означає, що стабілізуюча дія 4-АП чутливих К+ каналів на мембранний потенціал спокою васкулярних міоцитів гіпертензивних щурів може бути послаблена; міоцити легко піддаються деполяризації, що призводить до активації потенціалкерованих Ca2+ каналів, через які до міоцитів входять іони Ca2+, що беруть участь в активації скорочення, а може і в розвитку вазоконстрікції.

Кальцієвий струм мембрани міоцитів мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів. При розвитку генетичної гіпертензії спостерігається підвищений агоністактивований вхід Са2+ до васкулярних міоцитів (van Breеmen 1987), що може призвести до підвищення тонусу кровоносних судин, і в свою чергу до збільшення артеріального тиску. Крім того, в дослідах на смужках резистивних мезентеріальних артерій максимум сили скорочення, викликаного агоністом, був значно збільшений у генетично гіпертензивних тварин (Bendhack 1992). Оскільки основний вхід іонів Са2+ до васкулярних міоцитів відбувається через потенціалкеровані Са2+ канали L-типу, ми досліджували біофізичні властивості вхідного струму через потенціалкеровані Са2+ канали L-типу в 5 мМ Ва2+ (ІВа) міоцитів мезентеріальних артерій нормо- та генетично гіпертензивних щурів.

В наших експериментах до піпеткового розчину ми додавали амфоторіцин В для заміни іонів К+ протоплазми міоцитів відповідними іонами Сs+ піпеткового розчину. Амфоторіцин В утворює пори тільки для одновалентних катіонів та аніонів. Завдяки цьому зберігається природня концентрація Са2+ та уникається вимивання з клітини функціонально важливих ферментів, вторинних посередників та макромолекул.

Результати наших досліджень показали, що в мембрані міоцитів артерій гіпертензивних тварин відносна густина ІВа через потенціалкеровані Са2+ канали L-типу більша, ніж у нормотензивних тварин. Збільшення густини ІВа може відбуватися принаймні за двох основних причин: 1) за рахунок збільшення числа Са2+ каналів L-типу в плазматичній мембрані міоцитів генетично гіпертензивних щурів; 2) завдяки збільшенню частоти відкривання Са2+ каналів L-типу. Виявлене нами зміщення кривої стаціонарної інактивації ІВа міоцитів артерій гіпертензивних тварин свідчить на користь другої причини. Причиною збільшення активності Са2+ каналів можуть бути внутрішньоклітинні процеси в міоцитах гіпертензивних щурів. Заслуговує уваги на те, що в міоцитах гіперетензивних тварин частота відкритого стану поодиноких Са2+ каналів L-типу справді збільшується у порівнянні з нормотензивними тваринами (Ohya et al. 1998).

Отже надмірна активність Са2+ каналів L-типу васкулярних міоцитів гіпертензивних тварин призводить до збільшення входження зовнішньоклітинного кальцію до міоцитів, а отже і до зростання активації їх скорочення та вазоконстрікції.

Детальний аналіз отриманих кривих стаціонарної активації та стаціонарної інактивації ІВа дав змогу виявити область потенціалів на мембрані міоцитів, при яких ІВа взагалі не зазнає інактивації, тобто кальцієві канали залишаються відкритими, так званого “window current” в межах потенціалів від –30 мВ до +10 мВ. Зміщення кривої стаціонарної інактивації спостерігалось на протязі всього проміжку “window current” і при потенціалах -30, -20, -10 мВ відмінності були суттєвими (Р<0.05). Перемноження стаціонарної активації (d∞Ґ) на стаціонарну інактивацію (f∞Ґ) та на густину струму (IBa) для кожного потенціалу  показало, що величина “window current” у васкулярних міоцитах гіпертензивних тварин була більшою і становила відповідно на максимумі –0.14 пА/пФ у порівнянні з -0.09 пА/пФ у нормотензивних тварин. Відповідно до роботи McDonald et al (1994) величина “window current” на максимумі становить 1-10% максимального струму. У нашому випадку максимальна величина “window current” становила близько 3% від максимальної густини ІВа для міоцитів нормотензивних тварин і близько 3.7% для міоцитів гіпертензивних тварин. Отже густина ІВа, що не інактивується, приблизно на 25% збільшена у васкулярних міоцитів генетично гіпертензивних щурів.

Потенціал спокою міоцитів багатоклітинних препаратів резистивних мезентеріальних артерій звичайно знаходиться в межах –40 - -50 мВ. При дії агоніста (норадреналіну) виникає деполяризація, амплітуда якої може сягати 25 мВ, та відбувається одночасне збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію (Nilsson et al, 1998). Внаслідок використання 5 мМ Ва2+ в позаклітинному розчині поріг активації струму зміщувався в область додатних потенціалів (поріг активації для обох типів клітин становив близько –35 мВ); тоді як в присутності 2 мМ Са2+ для міоцитів малих резистивних мезентеріальних артерій поріг активації вхідного струму становив близько –50 мВ (Lozinskaya and Cox 1997). Співставлення наведених вище фактів з отриманими даними дає можливість стверджувати, що в фізіологічних межах мембранного потенціалу існує стаціонарний компонент кальцієвого струму, котрий не інактивується. Невелика величина “window current” може, проте, бути достатньою для помітного збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію: на міоцитах трахеї коня показано, що кальцієвий струм величиною приблизно 0.5 пА є достатнім для збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію на приблизно 100 нМ (Fleischmann et al. 1994). Збільшення густини стаціонарного компоненту вхідного кальцієвого струму в умовах природньої деполяризації може бути однією з причин підвищеної активації тонічної вазоконстрикції кровоносних судин при генетично зумовленій гіпертензії.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу “patch clamp” в конфігурації “current clamp” було показано, що міоцити мезентеріальних резистивних артерій нормотензивних щурів мали середній потенціал спокою –38 мВ та деполяризувались 4-АП, проте не деполяризувались ТЕА. 1 мМ ТЕА значно пригнічував спонтанні транзієнтні гіперполяризації.
2. Ємність, а отже й розміри досліджуваних міоцитів не відрізнялась суттєво для таких у нормотензивних і генетично гіпертензивних тварин.
3. Сумарний струм вихідного напрямку васкулярних міоцитів нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів частково блокувався 1 та 10 мМ ТЕА та 5 мМ 4-АП. Величини густини К+ струмів в контролі, чутливих до 1 та 10 мМ ТЕА не відрізнялись суттєво в міоцитах нормотензивних та гентично гіпертензивних щурів, проте величина густини 4-АП-чутливого струму була значно меншою в міоцитах гентично гіпертензивних щурів.
4. В міоцитах мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів присутній Са2+ залежний компонент К+ струму чутливий до харібдотоксину (200 нМ) та низьких концентрацій тетраетиламонію (1 мМ).
5. Вхідний струм міоцитів мезентеріальної артерії переноситься через Са2+ канали L-типу. Величина густини IBa була значно більшою в міоцитах генетично гіпертензивних щурів у порівнянні з нормотензивними.
6. Криві стаціонарної активації IBa не відрізнялись для міоцитів нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів. Крива стаціонарної інактивації IBa у міоцитів гентично гіпертензивних щурів була зміщена в сторону позитивних потенціалів
7. Величина стаціонарного компоненту IBa була на 25% більша в міоцитах генетично гіпертензивних щурів. За природніх умов більша величина Са2+ струму, що не інактивується, може бути однією з причин підвищеного тонусу кровоносних судин при гіпертензії.

Список опублікованих робіт здобувача за матеріалами дисертації.

1. О.Зима, А.Белевіч, О.Повстян, М.Хархун, Я.Цицюра, М.Шуба. “Механізм дії донорів окису азоту на потенціалкеровані кальцієві канали гладеньком’язових клітин судин” (1996). Нейрофізіологія, т. 28, № 6, 296-304.
2. Белевіч А.Е., Зима О.В., Хархун М.І., Шуба М.Ф. “Роль цАМФ, цГМФ і протеїнкінази С в регуляції Са2+-струму L-типу кальцієвих каналів електрозбудливої мембрани гладеньком’язових клітин” (1998). Нейрофізіологія т.30, №2, 83-90.
3. Белевіч А.Е., Зима О.В, Хархун М.І., Шуба М.Ф. “Механізми дії карбахоліну на Са2+-струм L-типу кальцієвих каналів в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки (1998). Фізика живого. т.5, №2, 61-68.
4. M.F. Shuba, A.E. Belevich, M.I. Harhun, A.V. Zima. “A regulation of L-type calcium channel activity in smooth muscle cells” The 76 Annual Meeting 11-15 of German Physiological Society, Rostok. Pfl. Arj., 1997, suppl. to vol.433, n6, R49, O-144.
5. Хархун М.І., Белевіч А.Е., Цицюра Я.Д., Цугорка Т., Шуба М.Ф., “Порівняльна характеристика Са2+ струмів мембрани гладеньком’язових клітин нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів”, Збірник тез доповідей, с. 72 // ІІ з’їзд Українського Біофізичного товариства, 29 червня - 3 липня, 1998, Харків, Україна.
6. Shuba M., Belevich A., Harhun M., Zima A. “Protein kinase regulation of calcium channel in gastrointestinal smooth muscle cells”. The Romanian - Hungarian Joint Meeting. Szeged, Hungary; Timisoara, Romania. 1996. Fizologia-Physiolozgy, vol.6, N 2(10), SM6, p.77.
7. Повстян О.В., Зима О.В., Хархун М.І., Шуба М.Ф., “Властивості харібдотоксинчутливого компонента кальційзалежного калієвого струму в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки”, Нейрофізіологія, 2000, т.32, № 1: 16-21.
8. Хархун М.І, Белевіч А.Е., Повстян О.В., Шуба М.Ф., “Роль потенціалзалежних калієвих каналів в формуванні мембранного потенціалу спокою міоцитів резистивних артерій щура”, Фізіологічний журнал, 2000, т 46, № 2: 91-97.
9. Повстян О.В., Зима О.В., Хархун М.І., Шуба М.Ф., “Властивості апамінчутливого компонента кальційзалежного калієвого струму в гладеньком’язових клітинах taenia coli морської свинки”, Нейрофізіологія, 2000, т.32, № 2: 89-95.
10. Хархун М.І., Белевіч А.Е., Цицюра Я.Д., Філіппов І.Б., Шуба М.Ф. “Характеристика L-типу Са2+ каналів міоцитів мезентеріальної артерії генетично гіпертензивних щурів. Нейрофізіологія, 2000, т.32, № 4: 300-308.

Хархун М.І. Характеристика потенціалкерованих іонних струмів мембрани міоцитів мезентеріальних артерій генетично гіпертензивних щурів. –Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня канадидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 –біофізика. –Інститут фізіологїї ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2000.

За допомогою методики “patch-clamp” було досліджено фармако-біофізичні характеристики потенціалкерованих іонних струмів резистивних мезентеріальних артерій нормотензивних та генетично гіпертензивних щурів. Вихідний калієвий струм (ІК) містив щонайменше дві компоненти: харібдотоксин-чутливий струм, який переноситься через кальційзалежні К+ канали великої провідності, та 4-амінопіридин (4-АП)- чутливий потенціалкерований струм затриманого випрямлення. Показано, що величина сумарного та кальційзалежного компонентів суттєво не відрізнялись в міоцитах нормотензивних та генетично гіпертензивних тварин, проте величина 4-АП чутливого компоненту була значно менша в міоцитах  генетично гіпертензивних тварин. Досліджувані клітини мезентеріальних артерій нормотензивних тварин мали середній потенціал спокою –38 мВ. Тетраетиламоній (1 та 10 мМ) не деполяризував клітини з потенціалом –40 … -50 мВ, проте значно інгібував спонтанні транзієнтні гіперполяризації. 4-АП (5 мМ), навпаки, викликав деполяризацію мембрани міоцитів нормотензивних щурів, які мали потенціал –35…-50 мВ. Зважаючи на те, що 4-АП викликав деполяризацію мембрани міоцитів із потенціалом близьким до потенціалу спокою цих клітин, зменшення компоненту 4-АП – чутливого струму при гіпертензії може призводити до деполяризації мембрани, і таким чином, до збільшення внутрішньоклітинного Са2+.

Було показано, що вхідний струм (в 5мМ Ва2+) переноситься через Са2+ канали L-типу. Відносна густина Ва2+ струму (ІВа) була значно збільшена в міоцитах генетично гіпертензивних щурів. Криві станціонарної активації ІВа не відрізнялись у нормо- та генетично гіпертензивних тварин. Криві стаціонарної інактивації ІВа, описані рівнянням Больцмана, статистично достовірно відрізнялись в потенціалі половинної інактивації, який становив відповідно –24.2±±0.4 мВ для нормотензивних тварин та –21.4±±0.4 мВ для гіпертензивних. Перетин кривих активації та стаціонарної інактивації IBa вказував на присутність стаціонарного компонента IBa (“window current”) в межах потенціалів від –40 мВ до 20 мВ, який був помітно збільшений у генетично гіпертензивних щурів. Виявлені зміни в густині сумарного IBa та у величині “window current” IBa можуть бути однією з причин  підвищеного тонусу кровоносних судин у гіпертензивних тварин.

Ключові слова: резистивні судини, мезентеріальна артерія, гіпертензія, кальцієвий струм, калієві струми, харібдотоксин, 4-амінопіридин.

Хархун М.И. Характеристика потенциалуправляемых ионных токов мембраны миоцитов мезентериальных артерий генетически гипертензивных крыс. –Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 –биофизика. –Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2000.

С помощью методики “patch-clamp” были исследованы фармако-биофизические характеристики потенциалуправляемых ионных токов резистивных мезентериальных артерий нормотензивных и генетически гипертензивных крыс. Выходящий  калиевый ток (ІК) состоял из как минимум двух компонентов: харибдотоксин-чувствительный ток, который переносится через кальцийзависимые К+ каналы большой проводимости и 4-аминопиридин (4-АП)- чувствительный потенциалуправляемый ток задержаного выпрямления. Показано, что величина сумарного и кальцийзависимого компонентов существенно не отличалась в миоцитах нормотензивных и генетически гипертензивных крыс, в то время как величина 4-АП-чувствительного компонента была значительно меньше в миоцитах генетически гипертензивных животных. Исследуемые клетки мезентериальных артерий нормотензивных животных имели средний потенциал покоя около –38 мВ. Тетраэтиламоний (1 и 10 мМ) не деполяризовал клетки с потенциалом –40 … -50 мВ, зато значительно ингибировал спонтанные транзиентные гиперполяризации. 4-АП  вызывал деполяризацию мембраны миоцитов нормотензивных крыс, которые имели потенциал –35…-50 мВ. Учитывая тот факт, что 4-АП вызывал деполяризацию мембраны миоцитов с потенциалом близким к потенциалу покоя, уменьшение компоненты 4-АП –чувствительного калиевого тока может приводить к деполяризации мембраны и, таким образом, к увеличению внутриклеточного Са2+.

Было показано, что входящий ток (в 5мМ Ва2+) переносится через Са2+ каналы L-типа. Относительная плотность Ва2+ тока (ІВа) была значительно увеличена в миоцитах генетически гипертензивных крыс. Кривые станционарной активации ІВа не отличались для миоцитов нормо- и генетически гипертензивных животных. Кривые стационарной инактивации ІВа, описанные уравнением Больцмана, статистически достоверно отличались в потенциале половинной инактивации, величина которого составляла соответственно –24.2±±0.4 мВ для нормотензивных животных и –21.4±±0.4 мВ для гипертензивных. Пересечение кривых активации и стационарной инактивации IBa указывало на присутствие стационарного компонента IBa (“window current”) в пределах потенциалов от –40 мВ до 20 мВ, который был заметно увеличен у генетически гипертензивных крыс. Обнаруженные изменения в плотности суммарного  IBa, и в величине “window current” IBa  могут быть одной из причин повышеного тонуса кровоносных сосудов у гипертензивных животных.

Ключевые слова: резистивные сосуды, мезентериальная артерия, гипертензия, кальциевый ток, калиевые токи, харибдотоксин, 4-амінопіридин.

Harhun M.I. The characterization of voltage-gated ionic currents of mesenteric artery myocytes membrane from genetically hypertensive rats. –Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 –biophysics. – Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2000.

Using conventional patch-clamp method the pharmacological and biophysical properties of the voltage-gated ionic currents of myocytes from resistance mesenteric arteries normotensive and genetically hypertensive animals have been studied. The summary outward potassium current of myocytes from mesenteric arteries (ІК) has at least two components: charibdotoxine-sensitive Ca2+-dependent K+ current (IK(Ca)) and voltage-gated 4-aminopyridine-sensitive delayed rectifier current. It was found no differences in the ІК and IK(Ca) from hypertensive and normotensive animals, but 4-AP-sensitive current was significantly less in the myocytes from hypertensive animals. Single cells from normotensive rats had a mean resting potential of –38 mV. TEA (1 and 10 mM) did not depolarize the cell’s membrane but significantly reduced the spikelike depolarizations. In contrast, 4-AP depolarized the myocytes from normotensive rats with resting membrane potential about –35… -50 mV. Thus, decreasing in 4-AP sensitive current that may play role in the regulation of the membrane potential can produce depolarization, and thus increasing in intracellular Ca2+ in the hypertensive rats vessels.

It was shown that inward current in the rat mesenteric artery is carried through the L-type of Ca2+ channels. The density of inward current (in 5 mM Ba2+) was significantly increased in resistance mesenteric arteries from hypertensive rats. The curves of activation were plotted as conductance-voltage relationships and had no significant difference in both type of cells. Steady-state inactivation curves of IBa distributed by Boltzman relation had difference in half-maximal voltage V0.5=-24.2±±0.35 mV for cells from normotensive animals and V0.5=-21.4±±0.4 mV SH cells (for steady-state inactivation Ca2+ channels L-type current at the potentials -30mV, -20mV, and -10mV value of P (two tailed ttest) was significant (P< 0.05)). The overlap of the activation and inactivation curves indicate the presence of a voltage window for IBa between -40mV and 20mV. The amplitude of the window current was increased in myocytes from hypertensive rats. These result suggest that increased activity of L-type of Ca2+ channels of resistance arteries in hypertensive rats may be related to the development of hypertension.

Key words: resistance vessels, mesenteric artery, hypertension, calcium current, potassium currents, charybdotoxin, 4-aminopyridin.