|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
КУЧКОВ ІГОР МИКОЛАЙОВИЧ
УДК: 615.361.013.11.014.413
Функціональні і біохімічні характеристики сперміїв людини при кріоконсервації в умовах понадшвидкого охолодження
03.00.19 – кріобіологія і кріомедицина
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2000
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі кріофізіології клітини Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник:
академік НАН України Грищенко Валентин Іванович
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, Гордієнко Євген Олександрович завідуючий відділом низькотемпературної консервації інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Доктор біологічних наук, професор, Гладкова Алла Іванівна, завідуюча лабораторією репродуктивної ендокринології (Український НДІ фармакотерапії ендокринних захворювань ім. В.Я. Данилевського)
Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра біології
Захист відбудеться 24.10. 2000 року о 14 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. при
Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України
61015, Харків – 15, вул. Переяславська, 23
Автореферат розісланий 22.09. 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
докт. мед. наук, професор Гольцев А.М.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Репродукція людини має загальну з всією органічною природою біологічну основу. На відміну від тваринного і рослинного миру це біологічне начало в людському суспільстві опосередковано соціальними чинниками. Серед чинників, що впливають на демографічні процеси, нарівні з віково-статевою і шлюбною структурою населення, важлива роль відводиться проблемі неродючості.
Забезпечення умов для збереження репродуктивного здоров'я є одним з найважливіших критеріїв стратегії стійкого розвитку суспільства. Демографічні показники [Іванюта Л.І. 1996] свідчать про формування в Україні стійкої тенденції до старіння населення, зростання в його структурі питомої ваги людей старечого віку. Ці тенденції в поєднанні з підвищенням нинішніх вимог до рівня якості життя загалом і статевого життя зокрема зумовлюють високу актуальність вивчення проблеми неродючості у чоловіків.
Прогрес в лікуванні вказаної патології в останнє десятиріччя в певній мірі пов'язаний із застосуванням кріометодів в терапії цього захворювання. Саме тому кріоконсервація репродуктивних клітин людини стала зараз однією з актуальних проблем сучасної кріобіології. Організація кріобанків сперми людини вирішує проблему народження повноцінних дітей при зайнятості батьків в небезпечних галузях виробництва науки і техніки, пов'язаних з можливістю променевої поразки, хімічної інтоксикації, загибеллю і іншими несприятливими впливами. Інсемінація кріоконсервованою спермою використовується також при хірургічних операціях на статевих органах, що вимушено або спеціально (стерилізація) приводять до неродючості. Кріобанки сперми дають також можливість контролю якості еякулятів, що має актуальне значення в зв'язку із збільшенням зон підвищеної радіації і епідеміологічною ситуацією, що гіршає. Незважаючи на прогрес, в проблемі низькотемпературного зберігання сперми людини, засоби кріоконсервації, які традиційно застосовуються для цих клітин, недостатньо ефективні. Тим часом результати понадшвидкого охолоджування зразків сперми дозволили авторам побачити певні перспективи в плані поліпшення якості відігрітого матеріалу по ряду морфологічних і біохімічних показників [Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А. 1994]. Потрібно зазначити, що метод понадшвидкого охолодження дозволяє піддавати кріоконсервації сперму при деяких видах патології (астеноспермія, олігоастеноспермія).
Астеноспермія, що характеризується низьким рівнем рухливості сперміїв в еякуляті, є сьогодні однією з головних причин, що приводять до неродючості у чоловіків. Кількість безплідних шлюбів, зумовлених астеносперміею, зростає з кожним роком.
У зв'язку з цим надзвичайно актуально дослідити стан біохімічного метаболізму сперміїв, що перенесли кріиоконсервування в умовах понадшвидкого охолоджування, і можливість його коректувати за допомогою хімічних агентів. Доцільним уявляється стимулювати клітини при нормоспермії і астеноспермії. Серед запропонованих стимуляторів рухливості сперміїв особлива увага приділяється сьогодні похідним метилксантина (кофеїн, теофілін, пентоксифілін) [Shen M.R., Chiang P.H. 1991 Yovich J.L. 1993]. Однак дія цих біологічно-активних речовин на спермії людини після їх кріоконсервації вивчена недостатньо [Hammit D.G. Bedia Е 1989, Hellstrom W.J.G., Sikka S.C. 1989]. Роботи по дослідженню впливу похідних метилксантина на спермії людини при їх кріоконсервації в умовах понадшвидких швидкостей охолоджування на даний момент повністю відсутні.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт за темою: "Вивчити механізми підвищення фертильності гамет та стійкості фетальних клітин людини та тварин при дії низьких температур в поєднанні з іншими физичними та хімічними факторами" (шифр - 2.6.66.), затвердженої президією НАН України, де автор виконував самостійний розділ.
Мета і задачі дослідження:
Метою даної роботи є стимуляція біологічно-активними речовинами деяких фізіологічних та біохімічних параметрів сперміїв людини в нормі і при астеноспермії до і після кріоконсервації.
Предмет дослідження. Визначення стану фруктоліза та вмісту макроергичних сполук в сперміях людини при їх охолодженні в умовах надшвидкого
Відповідно до поставленої мети роботи малося намір вирішити наступні задачі:
1. Визначити мінімальні концентрації кофеїну і пентоксифіліну, необхідні для стимуляції нативних і кріоконсервованих сперміїв людини в нормі і при астеноспермії.
2. Дослідити вплив стимулюючих факторів на вміст АТФ і креатинфосфату в сперміях людини в нормі і при астеноспермії до та після кріоконсервації з використанням понадшвидких швидкостей охолодження.
3. Дослідити вплив кофеїну і пентоксифіліну на динаміку утилізації фруктози сперміями людини в нормі і при астеноспермії до та після кріоконсервації з використанням надшвидких швидкостей охолодження.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показана можливість використання метилксантинів як стимуляторів рухливості для нормальних і астенічних сперміїв людини, кріоконсервованих в умовах понадшвидких швидкостей охолоджування з метою підвищення їх біоенергетичних характеристик.
Вперше доведені принципові відмінності в динаміці споживання фруктози і концентрації макроергичних сполук в нативних і кріоконсервованих сперміях людини, инкубованих в розчинах що містять кофеїн і пентоксифілін.
Вперше показана модулююча дія понадшвидких швидкостей охолоджування на морфофункціональні характеристики сперміїв при астеноспермії, що приводить до зниження ефективної концентрації пентоксифіліна в середовищі інкубації.
Експериментально обгрунтована доцільність використання стимуляторів рухливості сперміїв після відігріву. Обговорені можливі перспективи створення кріобанка клітин при патоспермії і шляху їх практичного використання для програм штучної інсемінації і запліднення in vitro.
Практичне значення отриманих результатів. Використані нові підходи до вивчення патоспермії, шляхом аналізу змін біоенергетичних параметрів сперміїв у відповідь на стимулюючий вплив.
Потрібно зазначити, що використання біостимуляторів по відношенню до сперміїв людини можливо здійснювати вже на етапах їх підготовки до заморожування аж до включення в склад кріозахисної середи. Дана перспектива, треба вважати, дозволить значно збільшити сумарний позитивний ефект біостимуляторів і збільшить шанси запліднення яйцеклітини. Комплексні дослідження по вивченню морфофункціональних властивостей репродуктивних клітин, підданих глибокому заморожуванню в умовах їх стимуляції після відігріву, можуть служити основою для створення високоефективних і простих в реалізації способів їх кріоконсервації для клінічної практики.
Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, які стосуються теми дисертації, відображають результати загального планування експериментів і підготовки матеріалів до друку.
Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки до роботи.
Випробування результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи докладалися і обговорювалися на Конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (1999 р., Харків).
Публікації. По матеріалах дисертації опубліковано 4 роботи, 3 з яких в центральних фахових журналах, отриман один патент на винахід.
Об'єм і структура дисертації.
ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика і основні методи дослідження.
Визначення концентрації фруктози і динаміки її утилізації сперміями проводили фотоколориметричним методом, в основі якого лежить реакція Селіванова на фруктозу з резорцином в кислому середовищі, використовуючи прилад КФК-3 при 520 нм. Понадшвидке охолоджування зразків сперми, що заморожуються, здійснювали за допомогою методу, розробленого співробітниками ІПКіК НАН України [Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А., 1998]. Абсолютний показник живучості визначали за В.К. Міловановим [Милованов В.К., 1959]. Статистичну обробку результатів проводили по методу Стьюдента-Фішера.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив кофеїну і пентоксифіліну на кінетичну активність сперміїв людини до і після кріоконсервації
Штучна стимуляція функціональної активності нативних і кріоконсервованих сперміїв людини вимагає ретельного визначення ефективної концентрації біостимулятора в середовищі інкубації. У разі використання інгібіторів фосфодіестерази цей аналіз ускладнений тією обставиною, що рухливість сперміїв починає змінюватися при наявності мінімальних доз метилксантинів в зразку.
У зв'язку з цим нами були поставлені експерименти, що стосуються вивчення зміни кінетичних характеристик сперміїв при їх інкубації в розчинах, що містять кофеїн і пентоксифілін в широкому діапазоні мілімолярних концентрацій. Зокрема, нами було досліджено вплив вказаних похідних метилксантина на рухливість нормальних і астенічних сперміїв після відтавання з метою виявлення можливого впливу процесу заморожування-відігріва на цей інтегральний показник. Встановлено, що інкубація нативних сперміїв людини до і після кріоконсервації протягом 6 годин в розчинах, що містять кофеїн в концентрації від 2 до 12 мМ з кроком 2 мМ, приводила до максимальної рухливості кліток при концентрації стимулятора 6 - 8 мМ (рис 1).
Таким чином, цитотоксичність кофеїну почала виявлятися при його вмісті в середовищі більше за 8 мМ. Внаслідок проведених досліджень встановлено, що доцільним представляється використати для стимуляції сперміїв людини кофеїн в концентрації 7 ± 1 мМ.
Вплив ПФ на спермії людини до і після кріоконсервації був вивчен аналогічно і оцінювалася по характеру і тривалості рушення сперміїв. Встановлено, що ПФ в концентраціях 2 - 4 мМ не надає цитотоксичного ефекту на спермії людини при їх інкубації протягом 6 годин (рис 2).
Збільшення вмісту ПФ в суспензії гамет вище за 4 мМ спричиняло достовірне зниження рухливості і тривалості життя сперміїв в порівнянні з контролем. Аналіз результатів експериментів, в яких використовувався пентоксифілін, показав, що при астеноспермії після відігріву спостерігалося достовірне збільшення кінетичної активності кліток при вмісті цього стимулятора в середовищі інкубації 2 мМ (рис 3).
Внаслідок проведених досліджень встановлено, що доцільним уявляється використати для стимуляції сперміїв людини пентоксифілін в концентрації 3 ± 1 мМ.
Концентрація АТФ і креатинфосфата в нативних і кріоконсервованих сперміях при наявності кофеїну і пентоксифіліну в середовищі інкубації
Порушення бар'єрної функції цитоплазматичної мембрани сперміїв людини є головним виявом ушкоджуючої дії заморожування-відігріва. Виникаючий при цьому вихід внутрішньоклітинних метаболитів у зовнішню середу є, на думку ряда авторів [Белоус А.М., Грищенко В.И. 1986, Bosman Е., du Toit D., 1994], вирішальним чинником, по якому можна судити про збереження морфофункціонального статусу клітин після кріоконсервації.
Основним джерелом енергії для поступального рушення сперміїв є АТФ. Загальний пул АТФ необхідний також для функціонування основних іонних градієнтів, він є також субстратом для синтезу цАМФ. Таким чином, досліджуючи вміст АТФ в сперміях можна судити про стан метаболізму цих кліток, порушення цілісності цитоплазматичних мембран, стійкість до процесів заморожування-відігріва і, в кінцевому результаті, про запліднюючу здатність.
Результати визначення АТФ при нормоспермії і астеноспермії подані в таблиці 1. Як видно з даних таблиці, достовірно низький вміст АТФ при астеноспермії - 2,5 ± 0,7 нмоль/108 клітин в порівнянні з нормою - 4,7 ± 0,64 нмоль/108 клітин свідчить про можливе переваження її розпаду над синтезом або порушення здатності сперміїв синтезувати АТФ при цій патології. Після відігріву кліток достовірних змін концентрації АТФ для нормо- і астеноспермії в порівнянні з контрольними значеннями до заморожування не виявлено. Цей результат свідчить про високе збереження цитоплазматичних мембран сперміїв людини, що перенесли кріоконсервування в умовах понадшвидкого охолоджування.
Таким чином, незважаючи на збільшення рухливості сперміїв, стимульованих із застосуванням похідних метилксантина, вміст АТФ в них залишається на постійному рівні. Наші дослідження показали, що вміст в сперміях креатинфосфату (КФ) в шість разів вище, ніж кількість АТФ. При астеноспермії, до заморожування, рівень креатинфосфата був нижчим і складав - 11,04 ± 0,85 нмоль/108 кліток, що однак також перевищує вміст АТФ при цій патології. Після відігріва сперміїв, рівень КФ в них підвищувався, що, на нашу думку, пов'язано з активацією енергетичного обміну клітки для репараційних процесів після стресу.
Як показали експерименти, при астеноспермії, для якої характерне зниження біоенергетичних показників сперміїв, насамперед змінюється вміст КФ. Причому, після кріообробки і стимуляції сперміїв пентоксифіліном, концентрація КФ в них була значно вище в порівнянні з клітками, що зазнали стимуляції без заморожування-відігріва. Є підстави вважати, що причиною змін в рухливості і вмісті макроергичних сполук є знижена базальна активність фосфодіестерази в клітинах при астеноспермії.
Таблиця 1
Вміст АТФ і креатинфосфата (нмоль /108 кліток) в сперміях людини до и після кріоконсервації з використанням похідних метилксантину в середовищі інкубації (М ± m, n=6)
Еякулят Стимулятор Нативна суспензія Кріоконсервована суспензія
АТФ КФ Рухливість, % АТФ КФ Рухливість, %
Нормоспермія контроль 4,7 ± 0,6 28,8 ± 0,6 52 ± 4,0 4,0 ± 0,3 30,9 ± 0,41 47 ± 3,0
6 мМ кофеїн 4,7 ± 0,7 33,3 ± 0,4 69 ± 7,0 4,6 ± 0,4 36,3 ± 0,51 55 ± 4,0
3,5 мМ ПФ 4,9 ± 0,4 42,2 ± 0,3 70 ± 9,0 4,7 ± 0,2 41,6 ± 0,2 60 ± 3,0
Астеноспермія контроль 2,5 ± 0,72 11,0 ± 0,82 36 ± 5,0 2,1 ± 0,12 12,2 ± 0,42 33 ± 2,0
6 мМ кофеїн 3,0 ± 1,12 13,9 ± 0,6 50 ± 6,0 2,8 ± 0,32 17,6 ± 1,11 43 ± 5,0
3,5мМ ПФ 2,7 ± 0,92 16,4 ± 0,3 53 ± 3,0 2,7 ± 0,12 23,1 ± 0,41 57 ± 6,0
Достовірність відмін по відношенню до: 1 – нативної суспензії кліток; 2 – контрольних значень при нормоспермії; р < 0.05.
Концентрація фруктози в спермальній рідині при інкубації сперміїв в розчинах, які містять кофеїн і пентоксифілін до і після заморожування
До теперішнього часу є достатній об'єм експериментальних даних, які свідчать про те, що в сперміях людини, кріоконсервованих по загальноприйнятих режимах заморожування, може порушуватися цілісність цитоплазматичної мембрани, в зв'язку з чим знижується рівень енергетичного обміну, що, в свою чергу, приводить до зниження рухливості і запліднюючої здатності сперміїв і створює певні труднощі при їх клінічному використанні з лікувальною метою [Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А.].
У ході досліджень гліколітичної функції сперміїв встановлено, що найбільше споживання фруктози нативними сперміями в нормі і при астеноспермії відбувалося в перший час інкубації. Динаміка споживання фруктози протягом другого часу інкубації так само показала відсутність достовірних змін у швидкості розпаду фруктози для обох груп клітин. Таким чином, для астеноспермії потрібно визнати відсутність кореляції між низькою рухливістю клітин і вмістом фруктози в еякуляті.
Після кріоконсервування кількість фруктози в спермальній рідині достовірно не змінилася, оскільки обмінні процеси в заморожених сперміях були відсутні, однак споживання її знизилося як в нормі, так і при астеноспермії. Внаслідок проведених досліджень нами було визначено, що максимальний фруктоліз при інкубації сперміїв в розчинах, що містять 6 мМ кофеїна, спостерігався в нативних зразках при астеноспермії в перший час інкубації і в нормоспермічних зразках після відігріву, але у другий час інкубації. Досліджуючи споживання фруктози в присутності 3,5 мМ пентоксіфиліна ми знайшли, що ПФ підтримував утилізацію фруктози кріоконсервованими сперміями протягом двох часів інкубації, на відміну від нативних зразків, де до кінця другої години він знижувався до рівня відповідного фруктолізу клітинами до стимуляції (рис. 5, 6).
Рис. 5 — Вплив кофеїну і пентоксифіліну на швидкість розпаду фруктози нативними сперміями людини при нормоспермії (А) і астеноспермії (Б)
Рис. 6 — Вплив кофеїну і пентоксифіліну на швидкість розпаду фруктози кріоконсервованими сперміями людини при нормоспермії (А) і астеноспермії (Б)
ВИСНОВКИ
1. У дисертації дан новий підхід до кріоконсервації сперміїв людини в умовах надшвидкого охолодження з застосуванням похідних метилксантина в якості стимуляторів біохімічних процесів на етапі відігріва клітин. Після заморожування сперміїв з швидкостями біля 3000 ОС/хвл, коли виникаючі морфофункціональні порушення мінімальні, додання похідних метилксантина після відігріву дає змогу, змінюючи функціональний стан біоенергетики, підвищіти рухливість сперміїв, що сприяє запліднюючій здатності гамет.
2. Спермії людини, кріоконсервовані з використанням режиму надвшвидких (біля 3000 °С/хв) швидкостей охолоджування, не змінюються морфологічно і практично не втрачають функціональної активності, що вказує на збереження мембранних структур і ключових біохімічних процесів.
3. Отримані в роботі результати свідчать про доцільність застосування режиму надшвидких швидкостей охолоджування для кріоконсервації сперми людини і використання похідних метілксантина для реабілітації відігрітих астенічних і нормальних сперміїв.
4. Встановлені мінімальні рівні концентрацій інгібіторів цАМФ-фосфодіестерази - кофеїну (7 ± 1 мМ) і пентоксифіліну (3 ± 1 мМ), при яких ці речовини надають максимальний стимулюючий ефект на функціональну активність нативних сперміїв людини.
5. Встановлено, що для стимуляції відігрітих сперміїв мінімальна концентрація пентоксифіліну може бути знижено в два рази в порівнянні з тією, що визначена для нативних кліток.
6. Показане зростання кількості креатинфосфату в сперміях при доданні похідних метілксантина на фоні стабільної кількості АТФ при нормо- і астеноспермії.
7. Похідні метілксантина підвищують швидкість утилізації фруктози астенічними сперміями до рівня нормоспермії і збільшують швидкість утилізації фруктози нормальними сперміями.
Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації
1. Лучко Н. А., Кучков И. Н. Влияние производных метилксантина на некоторые биоэнергетические параметры спермиев человека до и после криоконсервации// Пробл. Криобиол. – 1998. - №4. – С. 48-53.
2. Лучко Н.А, Кучков И.Н. Влияние кофеина и пентоксифиллина на гликолитическую функцию спермиев человека, криоконсервированных в условиях сверхбыстрых скоростей охлаждения// Пробл. Криобиол. – 1999 - №4. – С. 8-13.
3. Грищенко В.И., Чуб Н.Н., Крамар М.И., Терпячая И.В., Тодоров П.Т., Черепанова Т.А., Кучков И.Н. Морфофункциональные характеристики спермиев человека, хранившихся при низких положительных температурах// Пробл. Криобиол. – 1998 - №4. – С. 63-64.
4. Патент № 27004 Украина, МПК 6 А61К31/52, АО1N1/02 Спосіб підвищення рухливості сперміїв людини/ Лучко Н.А., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Інститут Проблем Кріобіології і Кріомедицини НАН України, Заявлено 01.12.1998. Опубл. 28.02.2000. Бюл.№ 1, с. 3.1.31.
АННОТАЦІЯ
Кучков І.М. "Функціональні і біохімічні характеристики сперміїв людини при кріоконсервації в умовах понадшвидкого охолодження". - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків 2000.
Дисертація присвячена вивченню вплива надвисоких (біля 3000 °С/хвл) швидкостей охолоджування сперміїв людини на стан фруктоліза, вміст АТФ і креатинфосфата, а так само рухливість сперміїв при наявності кофеїну і пентоксифіліна в середовищі інкубації. Отримані в роботі результати дозволяють зробити висновок про те, що стан фруктоліза, а так само вміст АТФ і креатинфосфата в сперміях до і після кріоконсервації знаходиться на високому рівні про що свідчить здатність сперміїв відповідати на стимулюючу дію метилксантинів.
Ключові слова: рухливість сперміїв, понадшвидке охолоджування, АТФ, креатинфосфат, кофеїн, пентоксифілін.
АННОТАЦИЯ
Кучков И.Н. "Функциональные и биохимические характеристики спермиев человека при криоконсервировании в условиях сверхбыстрого охлаждения" - Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков 2000.
Спермии являются уникальной моделью для изучения процессов криоповреждения и криозащиты, так как любые нарушения, вызванные действием химических факторов или понижением температуры, влекут за собой изменение их основных функций. Такая высокая чувствительность к изменяющимся условиям среды (осмотическое давление, рН, температурный шок) в сочетании с легкостью наблюдения и фиксации происходящих изменений, сделали спермии классическим объектом криобиологических исследований.
Диссертация посвящена изучению влияния сверхбыстрых (около 3000 °С /мин) скоростей охлаждения спермиев человека на состояние фруктолиза в них, содержание АТФ и креатинфосфата, а так же подвижность гамет при наличии кофеина и пентоксифиллина в среде инкубации. Объектом исследования служили спермии и эякулят, полученные от доноров при нормоспермии и астеноспермии.
В нашей работе для криоконсервации спермы был применён щадящий метод сверхбыстрого замораживания. Кроме того, для реабилитации использовали биологически-активные химические соединения из ряда метилксантинов, способные, по данным литературы, увеличивать естественный уровень энергетического метаболизма большинства видов клеток животных. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о том, что искусственная стимуляция функциональной активности даже нативных сперматозоидов требует тщательного определения эффективной концентрации биостимуляторов в среде инкубации.
Реакцию спермиев на холодовый стресс нам удалось зафиксировать только по данным содержания креатинфосфата, содержание которого достоверно возрастало как при нормоспермии, так и при астеноспермии. Следовательно, процесс замораживания-отогрева приводит к некоторой мобилизации биоэнергетических процессов в спермиях, что выражается в увеличении синтеза АТФ и накоплении в спермиях креатинфосфата. Наши исследования показали, что эффект стимулирования активности спермиев ингибиторами цАМФ-фосфодиэстеразы проявляется как в норме, так и при патологии сперматогенеза. Изучение закономерностей стимулирующего действия метилксантинов на активность спермиев до и после криоконсервации позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что астенические спермии, возможно, обладают изначально повышенной базальной активностью цАМФ-фосфодиэстеразы. Это предположение основывается на полученных данных о повышении содержания макроэргических фосфатов и кинетической активности спермиев до уровня этих показателей в нативных клетках при инкубации с ингибиторами цАМФ-фосфодиэстеразы.
Содержание фруктозы в семенной плазме при нормоспермии составляло в среднем 300 мг%, что почти на треть превышало ее содержание в плазме при астеноспермии (210 мг%). Высокая скорость утилизации фруктозы в течение первого часа была отмечена нами также при использовании 3,5 мМ пентоксифиллина для стимуляции спермиев как при нормо- так и при астеноспермии. В течение второго часа инкубации гамет с ПФ только у нормальных спермиев продолжала расти скорость утилизации фруктозы, в то время как у астенических спермиев наблюдалось её уменьшение. Проведенная нами оценка динамики скорости утилизации фруктозы спермиями до и после криоконсервации показала, что потребление этого моносахарида после отогрева снизилось как при нормо- так и при астеноспермии. Кофеин и пентоксифиллин увеличивали интенсивность фруктолиза в спермиях после отогрева до уровня нативных гамет, а в некоторых случаях и выше этого уровня. После отогрева замороженных клеток мы наблюдали в них отличную от нативных образцов динамику скорости утилизации фруктозы. В частности, при добавлении ПФ и кофеина у нативных спермиев увеличение распада этого сахара в течение первого и второго часа инкубации было достоверно выше, чем у криоконсервированных спермиев, причём отогретые спермии сохраняли высокую скорость утилизации фруктозы только при добавлении кофеина. Для суспензии спермиев, инкубированных с 3,5 мМ пентоксифиллина, интенсивность скорости потребления фруктозы не снижалась на протяжении двух часов.
Ключевые слова: подвижность спермиев, сверхбыстрое охлаждение, АТФ, креатинфосфат, кофеин, пентоксифиллин.
SUMMARY
Kuchkov I.N. "Functional and biochemical characteristics of human sperm on their cryopreservation under the superfast cooling". - Manuscript.
The thesis for scientific degree of a candidate's biological sciences on speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2000.
The thesis is devoted to the study of influence of superfast (3000 K/min) cooling speeds on human sperm fructolysis, АТP and creatine phosphate content, and sperm motility under caffeine and pentoxifylline presence in the incubation medium. The results obtained allow to suggest that, fructolysis rate and АТP and creatine phosphate content in sperm before and after cryopreservation are on the high level which is testified by the ability of the sperm to answer the stimulation by methylxantines.
Key words: sperm motility, superfast cooling, АТР, creatine phosphate, caffeine, pentoxifylline.
| 
