|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
__________________________________________________________________________________
ГІСЦЕВА Ольга Аркадіївна
УДК: 615.322.:582.734.4.
ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ ПАГОНІВ ОЖИНИ СИЗОЇ ТА СТВОРЕННЯ НА ЇЇ ОСНОВІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ
15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор
КОВАЛЬОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ
Національний фармацевтичний університет,
завідувач кафедри фармакогнозії.
Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор
СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ
Національний фармацевтичний університет,
завідувач кафедри медичної ботаніки;
доктор фармацевтичних наук, професор
ДОЛЯ ВІКТОР СЕМЕНОВИЧ
Запорізький державний медичний університет,
завідувач кафедри фармакогнозії
Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика,
Кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії
Захист відбудеться “_25” листопада 2005 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002 м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий “22” жовтня 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої ради,
д. біол. н.,проф. Л.М Малоштан .
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Пошук та створення лікарських препаратів рослинного походження - одна з найважливіших задач фармацевтичної науки. Цілеспрямований пошук природних біологічно активних субстанцій, вивчення їх фізико-хімічних та фармакологічних характеристик є головним напрямком вирішення цієї проблеми. Використання лікарських рослин у вигляді настоїв та відварів для лікування і профілактики хронічних захворювань у людей похилого віку особливо актуально в зв’язку зі змінами вікової структури населення. За прогнозами ВООЗ до кінця 2005 року 45% населення будуть складати жінки в періоді менопаузи. В клімактерії, в період переходу від зрілості до похилого віку, на фоні змін в організмі виникає необхідність прийому фітопрепаратів, які діють м’яко, не викликають побічних дій та підтримують стійкий фармакологічний ефект. Частим ускладненням клімаксу є ациклічні маткові кровотечі. Пошук альтернативних методів лікування клімактеричних розладів проводиться постійно. У рослинах біологічно активні речовини (БАР) знаходяться у оптимальних співвідношеннях, що створювалися в процесі еволюції при взаємодії організму з навколишнім середовищем.
Основний фармакологічний ефект може потенціюватися речовинами первинного біосинтезу – вуглеводами, білками та ліпідами, - а також продуктами вторинного біосинтезу. До них належать різні хімічні групи: фенольні сполуки, терпеноїди, які беруть участь у процесах обміну речовин та виконують важливі для рослин функції.
З літературних даних відомо, що рослини роду Rubus містять дубильні речовини, фенолкарбонові кислоти та флавоноїди, які мають широкий спектр фармакологічної активності. Флавоноїди та поліфеноли мають тенденцію до накопичення у значних кількостях, що дає можливість розглядати рослини як джерело цих речовин.
Необхідність комплексного використання рослин та наявність достатньої сировинної бази пояснює зацікавленість до вивчення дикоростучих рослин, а також недостатнє хімічне та фармакологічне вивчення надземної частини стали підставою для проведення наших досліджень. У зв’язку з цим як об’єкт дослідження нами була обрана рослина – Ожина сиза (Rubus caesius L.) родини розових (Rosaceae).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету за темою “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих і дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008) і проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення біологічно активних речовин пагонів ожини сизої та створення на їх основі лікарського засобу кровоспинної дії.
Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:
- проаналізувати та узагальнити сучасні дані літератури з питань лікування маткових кровотеч в період менопаузи;
- провести аналіз асортименту фітопрепаратів для профілактики та лікування ускладнень в клімактеричний період;
- провести фітохімічне вивчення якісного складу і визначити кількісний вміст основних груп БАР в пагонах ожини сизої;
- виділити індивідуальні природні сполуки та встановити їх структуру;
- одержати природні комплекси з пагонів ожини сизої та вивчити їх біологічну активність;
- визначити амінокислотний та мікроелементний склад досліджуваної сировини;
- встановити морфолого-анатомічні ознаки пагонів ожини сизої;
- розробити збір з досліджуваної сировини, методи його ідентифікації та аналізу, вивчити його фармакологічну активність;
- розробити проекти АНД на сировину пагонів ожини сизої, сухий екстракт та збір кровоспинний.
Об’єкти дослідження. Рослинний комплекс з пагонів ожини сизої, фітозасоби на її основі.
Предмет дослідження. Вивчення хімічного складу та фізико – хімічних властивостей БАР, визначення фармакологічної активності природних комплексів БАР у водних витягів з сировини; встановлення морфолого-анатомічних ознак пагонів ожини сизої.
Методи дослідження. Якісний і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, використовували тонкошарову хроматографію (ТШХ) і паперову хроматографію
(ПХ), застосовували специфічні якісні реакції. Для розділення БАР використовували коло-ночну хроматографію на поліамідному сорбенті і препаративну хроматографію на папері. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі їх хімічних перетворень, а також з використанням даних УФ- та ІЧ-спектрів. Фармакологічні дослідження проводили in vivo. Анатомічне вивчення та фотографування зрізів вегетативних органів досліджуваної сировини проводили під мікроскопом МБІ-6 з подальшим фотографуванням фотоапаратом “ФЕД-5В” на плівці “Мікрат-200”, “Мікрат-300”.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне і фармакологічне вивчення пагонів ожини сизої флори України. Визначено присутність вуглеводів, амінокислот, аскорбінової кислоти, фенольних сполук: гідроксикоричних та фенолкарбонових кислот, флавоноїдів, дубильних речовин.
В індивідуальному стані з вегетативних органів ожини сизої виділено 16 речовин, які відносяться до похідних гідроксибензойної кислоти (2), гідроксикоричних кислот (6), флавоноїдів (8).
Вперше визначений кількісний вміст БПСК, хлорофілів, амінокислот, жирних кислот, аскорбінової кислоти, мікро- та макроелементів, гідроксикоричних та гідроксибензойних кислот, суми поліфенолів, що окиснюються, флавоноїдів у пагонах ожини сизої.
Вперше проведено вивчення вмісту основних груп біологічно активних речовин пагонів ожини сизої в залежності від строку заготівлі і місця зростання рослини. Встановлені основні анатомо–діагностичні ознаки пагонів ожини сизої.
Розроблена технологія одержання фармакологічних комплексів з пагонів ожини сизої – сухого екстракту та кровоспинного збору, проведено визначення в них кількісного вмісту деяких груп БАР. Вивчена капілярозміцнювальна, мембраностабілізувальна та гемостатична дія in vivo водних витягів сировини та збору. Новизна досліджнь підтверджена та захищена деклараційним патентом України на винахід № 58820А від 15.08.2003р. (Бюл. №8).
Практичне значення отриманих результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість застосування пагонів ожини сизої, сухого екстракту і збору для лікування і профілактики клімактеричних ускладнень.
За результатами вивчення накопичення біологічно активних речовин розроблена інструкція із заготівлі та сушці сировини.
За результатами проведених досліджень розроблені проекти АНД на “Пагони ожини сизої”, “Сухий екстракт” та “Кровоспинний збір”.
Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Національного фармацевтичного університету на кафедрах медичної ботаніки, хімії природних сполук; Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації НФаУ на кафедрі якості, стандартизації та сертифікації ліків; фармацевтичних факультетів Запорізького державного медичного університета, Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова.
Особистий внесок здобувача:
- проведений аналіз літературних даних по розповсюдженню, хімічному складу та використанню пагонів ожини сизої;
- виділені та визначені основні групи БАР: амінокислоти, гідроксикоричні та фенолкарбонові кислоти, флавоноїди, дубильні речовини, визначена динаміка накопичення флавоноїдів, аскорбінової кислоти та поліфенолів, що окиснюються;
- встановлено кількісний вміст білково-полісахаридного комплексу, амінокислот, хлорофілів. аскорбінової кислоти, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, флавоноїдів.
- ідентифікована та встановлена будова 16 речовин фенольної природи;
- вивчена морфолого-анатомічна будова вегетативних органів ожини сизої
- визначена динаміка накопичення основних груп БАР у сировині
- отримано та проаналізовано сухий екстракт з цієї сировини;
- розроблено кровоспинний збір з пагонами ожини сизої;
- розроблені проекти АНД на “Пагони ожини сизої”, “Сухий екстракт”, “Кровоспинний збір”.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговорені на науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”, матеріали V національного з’їзду фармацевтів України (Харків, 1999), “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002), Науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю (Вінниця, 2004), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100- річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (Запоріжжя, 2004), науково – практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), матеріали VI національного з’їзду фармацевтів України (Харків, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, в тому числі 4 статті у фахових наукових виданнях та 6 тез доповідей, 1 патент.
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, 3 розділів власних досліджень, загальних висновків, списку використаних літературних джерел, додатків. Робота ілюстровано 39 таблицями, 3 схемами, 39 рисунками. Бібліографія включає 188 джерел літератури, у тому числі 49 іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Ботанічна характеристика, хімічний склад і застосування у науковій і народній медицині ожини сизої.
Проведений аналіз літературних даних свідчить, що хімічний склад вегетативних органів ожини сизої (Rubus caesius L.) флори України практично не вивчений, не визначено оптимальні терміни заготівлі ЛРС. Пагони ожии сизої використовують в народній медицині як кровоспинний, антисептичний засіб. Найбільше інформації існує про хімічний склад плодів ожини, які використовують як харчовий та дієтичний продукт. Фармакогностичне вивчення цієї сировини з метою створення лікарських засобів має теоретичний та практичний інтерес.
Використання зборів з ЛРС є перспективним напрямком у лікуванні та профілактиці маткових кровотеч у клімактеричний період. Актуальною проблемою є розробка методів аналізу та стандартизації сировини та кровоспинних зборів .
Попереднє визначення, виділення та хімічне вивчення біологічно активних речовин ожини сизої
Об’єктом наших досліджень були пагони ожини сизої, які заготовлені у різних регіонах України: Харківська область, Карпати, Крим протягом 1999 – 2004 р.р.
За результатами фітохімічного аналізу в пагонах ожини сизої флори України встановлена наявність каротиноїдів (9), серед яких 5 належить до похідних β-каротиноїдів та 4 до похідних ксантофілу, хлорофілів (2), гідроксикоричних кислот (6), вільних амінокислот (16), вільних (6) та зв’язаних цукрів (4), гідроксибензойних кислот (2), флавоноїдів(8).
Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні сполуки використовували методи рідинної екстракції, колонкової хроматографії на силікагелі, поліаміді, паперову, тонкошарову та препаративну хроматографію. Виділено і встановлена будова 16 речовин: 2- похідні гідроксибензойної кислоти, 6- похідні гідроксикоричної кислоти, 8- похідні флавоноїдів
Фізико-хімічні властивості виділених речовин наведені у табл.. 1.
Таблиця 1
Фізико-хімічні властивості речовин, виділених з пагонів ожини сизої
*Системи розчинників: А-н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); Б-15%-оцтова кислота; В-2% оцтова кислота.
Структуру виділених речовин встановлено на підставі фізичних, фізико-хімічних та хімічних методів аналізу
Гідроксибензойні кислоти. Речовини 2.12 та 2.13 за допомогою якісних реакцій, даних хроматографічного аналізу, хімічних перетворень віднесені до похідних галової кислоти, що підтверджується даними УФ – спектрів. На підставі фізико-хімічних досліджень ідентифікували речовину 2.12 як 3,4,5 – тригідроксибензойну кислоту або галову кислоту, речовину 2.13 як ділактон гексагідроксидифенової кислоти або елагову кислоту.
Похідні гідроксикоричної кислоти. Речовини 2.14-2.19 дають позитивну реакцію з розчином хлориду заліза (ІІІ), що свідчить про їх фенольну природу. При хроматографуванні речовини 2.14 - 2.19 мають в УФ-світлі блакитне забарвлення різної інтенсивності, яке змінюється в зелене-блакитне під дією парів аміаку, що характерно для похідних гідроксикоричної кислоти. Належність цих речовин до гідроксикоричних сполук підтверджена даними спектральних досліджень в УФ-області з характерними для цієї групи максимумами поглинання у діапазоні хвиль при 310-325 та 228-245 нм.
В продуктах лужної деструкції речовин 2.14 (кофейна кислота), 2.16 (хлорогенова кислота), 2.17 (неохлорогенова кислота), 2.18 (ізохлорогенова кислота) знайдено 3,4-діоксибензойна (протокатехова) кислота, речовини 2.15 (ферулова кислота) – ванілінова кислота, речовини 2.19 (n-кумарова кислота) - n -гідроксибензойна кислота. Лужний гідроліз речовин 2.16, 2.17, 2.18 приводить до утворення еквімолекулярних кількостей кофейної і D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної кислоти встановлено лактонізацією речовин 2.16, 2.17, 2.18.
На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовина 2.14 ідентифікована як 3,4-дигідроксикорична кислота (кавова кислота), 2.15 – ідентифікована як 3-метокси –4 – гідроксикорична кислота (ферулова кислота), речовина 2.16 - ідентифікована як 5-0-кофеїл-D-хінна кислота ( хлорогенова кислота), речовина 2.17 - 3-0- кофеїл-D-хінна кислота (неохлорогенова кислота), речовина 2.18 - 4-0-кофеїл-D-хінна кислота (ізохлорогенова кислота), речовина 2.19 – 4 – гідроксикорична кислота (n - кумарова кислота).
Похідні флавоноїдів. Флавоноїдна природа речовин 2.20-2.27 підтверджується ІЧ – спектрами, у яких відмічені смуги поглинання в області 3370-3200 см-1(фенольні гідроксигрупи), 1659 – 1665 см-1 (карбонільна група γ - пірону) 1615,1600,1568 і 1510 см-1(валентні коливання ароматичних кілець).
Результати якісних реакцій та УФ – спектроскопії свідчать про належність досліджуваних речовин до похідних флавоноїдів.
За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників та за результатами ціанідінової проби за Бріантом речовини 2.20 – 2.22 віднесені до агліконів, речовини 2.23-2.27 – до глікозидів. Схема хімічних перетворень на прикладі речовини 2.25 представлена на рис.1.
Рис 1. Схема хімічних перетворень моноглікозидів флавонолу на прикладі кемпферол-3-0-α-L-арабофуранозиду (речовина 2.25)
Таким чином, за даними фізико – хімічних досліджень, УФ – та ІЧ – спектроскопії, аналізу продуктів лужної деструкції, кислотного гідролізу, ацетилювання, метилювання ідентифіковано в порівнянні з вірогідними зразками: речовину 2.20 як 3,5,7,4'-тетраоксифлавон (кемпферол), речовину 2.21 як 5,7,3',4'-тетраоксифлавон (лютеолін), речовину 2.22 як 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавон (кверцетин), речовину 2.23 як кверцетин-3-0-β-D-глюкопіранозид (ізокверцитрин), речовину 2.24 як кемпферол – 3-0-β-D-глюкопіранозид (астрагалін), речовину 2.25 як кемпферол – 3-0-α-L-арабофуранозид, речовину 2.26 як кверцетин-3-0-β-D-галактопіранозид (гіперозид), а речовину 2.27 як кверцетин-3-0-β-D-рутинозид (рутин). Вперше з виду Rubus caesius виділені речовини 2.20-2.27.
Визначення кількісного вмісту деяких груп біологічно активних речовин в пагонах
ожини сизої
Вперше визначений кількісний вміст БПСК, амінокислот, аскорбінової кислоти, хлорофілу, гідроксикоричних кислот, суми поліфенолів, що окиснюються, флавоноїдів.
Визначено кількісний вміст 16 амінокислот у 3 зразках сировини. Результати досліджень наведені в таблиці 2.
Таблиця 2
Кількісний вміст амінокислот у пагонах ожини сизої.
Як видно з таблиці 2, домінуючи амінокислоти для пагонів ожини сизої у 3 зразках є пролін (1,48% - 3,37%), глутамінова кислота (1,22% - 1,39%) та аспарагінова кислота (0,71% - 1,19%).
Загальний вміст амінокислот в пагонах ожини сизої коливається від 10,25% до 12,04%, вміст незамінних амінокислот 4,2% - 4,43%, замінних амінокислот 5,82% - 7,84%.
Методом атомно – абсорбційної спектроскопії визначений якісний склад та кількісний вміст мінеральних сполук в пагонах ожини сизої. Встановлений вміст - 22 мікро - та макроелементів. Дані аналізу наведені в таблиці 3
Серед ессенціальних елементів у сировині було визначено присутність: Mn, Cu, Pb, Ni, Co, Mo, Zn, Sr, Fe, Sn, Ag, Cd, As, Hg, Cr. Як видно з таблиці 3, вміст заліза коливається від 260 до 320мкг/кг. Найбільший вміст заліза зафіксовано у сировині, що була заготовлена в Криму. Вміст марганцю склав від 60 до 70 мг/кг. Вміст цинку – від 35 до 40 мг/кг; вміст стронцію – від 25 до 30 мг/кг, вміст міді – 16-20 мг/кг. В слідових кількостях знайдено кобальт, сурму, срібло, кадмій, ртуть та миш’як. У незначній кількості знайдено свинець (0,5 – 1 мг/кг), нікель (до 1 мг/кг), молібден (0,2 – 0,3 мг/кг) та хром (1 – 1,2 мг/кг).
Таблиця 3.
Елементний склад пагонів ожини сизої.
Примітка: зразок №1 – Харківська область, зразок №2 – Карпати, зразок №3 – Крим.
Вперше встановлено якісний склад та кількісний вміст жирних кислот пагонів ожини сизої. Дані аналізу наведені в таблиці 4
Таблиця 4
Склад жирних кислот ліпофільного комплексу з пагонів ожини сизої.
Встановлено, що переважає кількісний вміст ненасичених жирних кислот – 57,94 %, серед яких значну частину складає α- ліноленова кислота – 40,82%. На вміст ненасичених жирних кислот олеїнової та лінолевої припадає 1,97% та 9,68% відповідно. Серед насичених жирних кислот найбільша кількість припадає на лауринову кислоту–15,95% та міристинову кислоту – 16,04%.
Визначено кількісний вміст БАР у пагонах ожини сизої. Встановлено, що вміст цих сполук залежить від району заготівлі та відмінності кліматичних умов. Результати дослідження наведені у табл. 5
Таблиця 5
Кількісний вміст груп БАР у пагонах ожини сизої
| 
