|
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ
ДEЙНEКА СВЯТОСЛАВ ЄВГEНОВИЧ
УДК 614.7:546.4/.5:611.018.1
ТОКСИКОЛОГО-ГІГІЄНІЧНІ АСПEКТИ
ЗАСТОСУВАННЯ МEТОДУ КУЛЬТУР КЛІТИН
ПРИ КОМПЛEКСНОМУ ВИВЧEННІ СПОЛУК МEТАЛІВ
ТА ОЦІНЦІ ЗАСОБІВ ЦИТОПРОТEКЦІЇ
14.02.01 - гігієна
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Київ, 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Науково-дослідному інституті мeдико- eкологічних
проблeм МОЗ України та Буковинській дeржавній мeдичній академії.
Науковий консультант: доктор медичних наук, професор
Проданчук Микола Георгійович,
Інститут екогігієни та токсикології
ім. Л.І. Медведя, директор.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Шафран Леонід Мойсейович, керівник відділу токсикології, Український НДІ медицини транспорту МОЗ України;
доктор медичних наук, професор Храпак Володимир Венедиктович, головний науковий співробітник, Інститут фармакології та токсикології АМН України;
доктор медичних наук, професор Волощенко Олег Гнатович, завідувач лабораторії гігієни нових хімічних матеріалів, препаратів та біомоніторингу, Український науковий гігієнічний центр МОЗ України.
Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О. Богомольця, кафедра гігієни праці, м. Київ.
Захист відбудеться 10.10.2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.554.01 при Інституті медицини праці АМН України за адресою: 01033, м. Київ-33, вул. Саксаганського, 75.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту медицини праці АМН України (01033, м. Київ-33, вул. Саксаганського, 75).
Автореферат розісланий 8.09. 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, к.мед.н. А.І.Ковальова
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Несприятлива, а в ряді регіонів України і катастрофічна екологічна ситуація характеризується високим рівнем забруднення довкілля шкідливими факторами різної природи. Згідно аналізу сучасного стану навколишнього середовища в Україні за критеріями пріоритетності небезпека шкідливих чинників довкілля знаходиться у такій послідовності: хімічне забруднення > біологічне забруднення > фізичне забруднення (Сердюк А.М., 1998.).
Серед хімічних речовин, що забруднюють різні об'єкти зовнішнього середовища, метали та їх сполуки утворюють значну групу токсикантів, яка багато в чому визначає антропогенний вплив на екологічну структуру навколишнього середовища і на стан здоров’я людини (Кундієв Ю.І., Трахтенберг І.М, 1991). Зростаючі масштаби світового виробництва та використання металів, їх висока токсичність, здатність накопичуватись в організмі людини та в ланцюгах живлення бiогеоценозiв, викликати шкідливий вплив навіть у порівняно низьких концентраціях чи дозах та спричиняти вiддаленi ефекти є обгрунтованою причиною для віднесення металів до пріоритетних забрудників виробничого та оточуючого середовища (Трахтенберг І.М., Луковенко В.П., 1990; Саto Таkаhiko, 1992; Трахтенберг І.М., Колесніков В.С., Луковенко В.П., 1994; Кундієв Ю.І., Трахтенберг І.М., 1997). В індустріально розвинутих країнах та регіонах за рахунок широкого промислового використання сполук металів, хімізації побуту, розвитку автомобільної індустрії забруднення довкілля металами, особливо свинцем та кадмієм, є досить значним, тому проблема впливу цих ксенобіотиків на живі істоти, у т.ч. і на людину, набула високої актуальності (Маршалл В., 1987; Fischebein A., 1992). У зв'язку з цим проводиться пошук критерiїв ранньої дiагностики їх патогенного впливу на органiзм (Tuormaa T.E., 1994; Голиков С.Н., 1995), а специфічна дія металів на органи і системи людини та тварин стала предметом інтенсивних досліджень вітчизняних (Чекунова М.П., Фролова А.Д., 1986; Полякова А.Н. та ін., 1995) та зарубіжних вчених (Olibet G., Coccini T., Rossi A.D. et all., 1995; Panariti E., Berxholi K., 1998).
Разом з тим, токсиколого-гігієнічні дослідження металів залишаються дещо обмеженими, оскільки важливими є не тільки гігієнічна оцінка цих сполук у навколишньому середовищі та виявлення їх дії на стан здоров'я людей, а все більшого практичного значення набуває необхідність розробки та наукового обгрунтування методів прискореного вивчення токсичних властивостей сполук металів та, особливо, пошуку засобів індивідуальної профілактики їх шкідливого впливу (Боднарчук Л. І., Кожура І.M., Якименко Д. M., 1998; Берестенко С.В., 1998). Останні ще не розроблені повною мірою і при їх скринінгових пошуках не використовуються альтернативні методи дослiдження in vitro, які в світовій науковій практиці широко впроваджуються в інших напрямках медико-біологічних досліджень завдяки своїй високiй чутливостi (Huber H.C.H., Huber W., Ritter U., 1990), iнформативностi (Borenfreund E., Puerner J.A., 1986), оперативності (Swisher D.A. et all., 1989), низькій собівартості (Guillouzo A.J., 1992), а також у зв’язку із збільшенням зацікавленості науковців та широкої громадськості в гуманнішому ставленні до тварин (Warren M., 1989) і скороченні їх використання в експериментах (Zbinden G.,1991; Balls M., Fentem J., 1997). Водночас, клiтинний рiвень дiї сполук металiв, дані лiтератури про клiтиннi мембрани як унiкальне мiсце прояву токсичних ефектiв цих ксенобіотиків (Тиунов Л.А., 1986; Фролова А.Д., 1990) обгрунтовують доцільність та можливість використання експериментів in vitro і, у тому числі, методу культур клітин для вивчення як токсичних властивостей потенційно небезпечних для здоров'я людини сполук металів, так і скринінгового пошуку засобів, які проявляють протективну активність стосовно токсичної дії вказаних хімічних сполук. У зв’язку з вказаним актуальними є подальші експериментальні дослідження, кінцевою метою яких є підвищення ефективності корекції та індивідуальної профілактики спричинюваної металами професійної та екозалежної патології (Длин В.В., Османов И.М., Юрьева З.А., 1998; Flora G.J.S., Kumar P., Seth P.K., Seth P.K., 1998).
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом галузевих пріоритетних НДР МОЗ України “Розробка методичних підходів до використання альтернативного методу дослідження in vitro на культурах клітин при комплексному вивченні ступеня токсичності та шкідливості потенційно небезпечних для здоров’я хімічних факторів навколишнього та виробничого середовища (на прикладі солей металів)” (номер держреєстрації 0193 U029774), “Вивчити поєднаний вплив несприятливих екологічних факторів та малих доз радіації на здоров’я дітей дошкільних установ з метою розробки заходів по зниженню їх захворюваності” (номер держреєстрації 0193 U029775), “Вивчити вміст солей важких металів у біосередовищах дітей, які мешкають в екологічно несприятливих регіонах Чернівецької області та провести імунологічний скринінг з метою розробки рекомендацій по вдосконаленню реабілітаційних заходів” (номер держреєстрації 0197 U000585).
Мета роботи. Підвищення ефективності профілактики та корекції спричинюваної металами професійної та екозалежної патології шляхом використання етіопатогенетичних протективних засобів, відібраних на основі поетапного пошуку з використанням культур клітин як тест-об’єкту для вивчення цитотоксичності сполук металів.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Експериментально вивчити in vitro цитотоксичну активність як неорганічних, так і органічних сполук металів по відношенню до перещеплюваних культур клітин Hep-2, Rh та HeLa.
2. Провести порівняльну характеристику цитоморфологічних та біохімічних показників при вивченні ступеня цитотоксичності сполук металів та дослідити кореляційні зв’язки між показниками цитотоксичності сполук металів для культури клітин та їх параметрами токсикометрії, отриманими в експериментах на лабораторних тваринах.
3. Встановити ефективність застосування культури клітин як тест-об’єкту для скринінгового пошуку in vitro речовин та факторів, які проявляють цитопротективну дію стосовно токсичного впливу металів.
4. В умовах свинцевої та кадмієвої експериментальних інтоксикацій дослідити на лабораторних тваринах протективну дію виявлених in vitro профілактичних засобів.
5. Встановити ефективність застосування досліджених in vitro та in vivo протективних засобів у комплексі профiлактично-реабiлiтацiйних заходiв серед дітей, у крові яких виявлені підвищені рівні свинцю.
Об’єкт дослідження: профілактика та корекція спричинюваної металами професійної та екозалежної патології. Предмет дослідження: поетапний скринінговий пошук етіопатогенетичних профілактичних засобів, які проявляють протективну активність стосовно токсичної дії сполук металів. Методи дослідження: експерименти in vitro на перещеплюваних культурах клітин, мікроскопічний, цитоморфологічний, біохімічний, токсикологічний, нейроповедінковий, гематологічний, імунологічний, гігієнічний, клініко-епідеміологічний, статистичний.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше науково обгрунтована та експериментально доведена можливість, доцільність та ефективність застосування культури клітин як тест-об’єкту для скринінгового пошуку in vitro речовин та факторів, які проявляють цитопротективну дію стосовно токсичного впливу металів. Доведено, що пошук етіопатогенетичних профілактичних засобів з цитопротективною дією повинен передбачати етап досліджень на клітинному рівні з моделюванням цитотоксичної дії металів.
Встановлена висока чутливість перещеплюваних культур клітин Hep-2, Rh та HeLa до дії як неорганічних, так і органічних солей металів. Показано, що широкий діапазон цитотоксичної активності солей металів зумовлений як природою металу, який входить до складу сполуки, так і її кислотним залишком.
Вперше проведено порівняльний аналіз критеріального значення цитоморфологічних та біохімічних показників при вивченні ступеня цитотоксичності солей металів. Найбільш критеріально значимими цитоморфологічними показниками визнано мітотичний індекс та відсоток клітин з низькою інтенсивністю накопичення барвника нейтрального червоного. Вперше встановлено, що основним біохімічним критерієм цитотоксичності металооксалатів є збільшення вмiсту в культуральнiй рiдинi креатинiну.
Вперше показано, що оцінка цитотоксичної дії солей металів повинна проводитись на основі комплексного цитоморфологічного дослідження культур клітин із враховуванням чотирьох типів їх ураження: порушень адгезії клітин до скла, незворотніх змін ядра, посилення мітотичної активності клітин культури та порушень накопичення вітального барвника.
Вперше встановлено, що екстракт обнiжжя бджолиного (пилку квіткового), настоянки ехінацеї пурпурової, болиголову плямистого та арнiки гірської, нова біологічно активна речовина Eрсол-1, низькоінтенсивне лазерне опромінення зменшують цитотоксичноий вплив сполук металів на iзольованi клiтини в культурi.
З використанням моделей субхронічної свинцевої та підгострої кадмієвої експериментальних інтоксикацій вперше показано in vivo здатність препаратів природного походження - суспензії обнiжжя бджолиного та настоянки ехінацеї пурпурової проявляти протективну активність стосовно токсичного впливу сполук металів.
Доведено, що введення щурам обнiжжя бджолиного запобігає порушенням діяльності судинно-клубочкового апарату нефрону і пошкодженню канальцевих структур нирок при підгострій інтоксикації тварин хлористим кадмієм.
Показано, що введення щурам з підгострою інтоксикацією хлористим кадмієм обнiжжя бджолиного попереджує порушення активності ферментативних систем необмеженого протеолізу і збільшує інтенсивність лізису депозитів фібрину в кортикальній тканині нирок.
Виявлено нефропротекторний ефект ехінацеї пурпурової при підгострій інтоксикації хлористим кадмієм, який полягає в попередженні розвитку порушень функції гломерулярного апарату нефрону і пошкодження канальцевих структур нирок, нормалізації активності ферментативних систем необмеженого протеолізу і збільшенні інтенсивності лізису депозитів фібрину в кортикальній тканині нирок.
Встановлено, що в здорових щурів діуретичний ефект обнiжжя бджолиного зумовлений зростанням швидкості клубочкової фільтрації і супроводжується каліуретичною реакцією, а зміни ниркового транспорту натрію зумовлені збільшенням фільтраційного заряду натрію і відзеркалюють реалізацію фізіологічного механізму канальцево-клубочкового балансу.
На основі вивчення динамiки пiзнавальних здiбностей дошкiльників, у крові яких виявлені підвищені рівні свинцю, вперше показано, що призначення поряд з традиційними заходами препаратiв ехiнацеї пурпурової і обнiжжя бджолиного спричиняє позитивний коригуючий вплив на розвиток пізнавальної діяльності дiтей, сприяє збільшенню екскреції свинцю та зменшенню концентрації дельта-амінолевулінової кислоти в сечі.
Практичне значення одержаних результатів. Науково обгрунтовані загальні принципи використання методу культур клітин при комплексному вивченні сполук металів та оцінці засобів цитопротекції. Застосування цих тест-об’єктів забезпечуватиме оперативність токсиколого-гігієнічного вивчення потенційно небезпечних для здоров'я людини сполук металів і пошуку засобів, які проявляють протективні властивості стосовно токсичної дії вказаних ксенобіотиків, та дозволить обгрунтовано скоротити використання в експериментах лабораторних тварин.
Препарати природного походження - суспензія обнiжжя бджолиного та настоянка ехінацеї пурпурової, протективна активність яких стосовно токсичного впливу сполук металів вперше виявлена in vitro на культурах клітин та доведена як в експериментах на лабораторних тваринах, так і при корекції спричинених свинцем порушень у дошкільників, можуть застосовуватись з лiкувально-профiлактичною метою при iнтоксикацiях металами рiзного генезу. Метод впроваджений в практичну охорону здоров’я.
Вперше експериментально виявлена протективна активність низькоінтенсивного лазерного імпульсного опромінення в інфрачервоній області спектру з довжиною хвилі 0,89 мкм, імпульсною потужністю 6-8 Вт, частотою імпульсів 80 Гц, часом впливу 64-128 с є основою для клінічної апробації застосування лазеротерапії при інтоксикаціях важкими металами.
Реалізація теоретичних положень та науково-практичних рекомендацій за результатами дисертаційної роботи здійснювалась у різних напрямках.
Складено, затверджено 28.11.94 р. проблемною комісією “Гігієна праці та профзахворювання” і видано інформаційний лист “Методологічні підходи до використання методу культур клітин при комплексному токсиколого-гігієнічному вивченні солей металів” (№ 157.95; Київ, РЦНМІ, 1995.- Вип. 4.- 2 c.).
Результати досліджень впроваджені в курсах лекцій і практичних занять на медико-профілактичному факультеті Харківської медичної академії післядипломної освіти, на кафедрі гігієни Вінницького державного медичного університету, кафедрі фітотерапії з курсом фармакогнозії Медичного інституту УАНМ, кафедрі загальної гігієни Тернопільської державної медичної академії, кафедрах клінічної імунології та алергології, загальної гігієни Львівського державного медичного університету та кафедрі гігієни та екології Донецького державного медичного університету.
Схема корекції обнiжжям бджолиним та ехінацеєю пурпуровою порушень пізнавальної діяльності в дітей дошкільного віку впроваджена в Чернівецькому обласному дитячому радіаційно-екологічному диспансері, Чернівецькій обласній клінічній дитячій лікарні, Сокирянській центральній лікарні Чернівецької області, центральній районній дитячій поліклініці Мінського району м. Києва, дитячій клінічній лікарні № 5 м. Києва, дитячій поліклініці № 4 м. Рівне, 2-й міській поліклініці м. Львова, міській дитячій лікарні м. Тернополя, 2-й міській дитячій лікарні м. Луганська, міській інфекційній лікарні м. Черкаси, дитячих дошкільних установах № 38 та 40 м. Чернівці, № 1 м. Заліщики та № 6 м. Тернополя.
Особистий внесок здобувача. Автор обгрунтував методологічну основу роботи, адекватну меті та завданням дисертації, особисто провів аналіз літературних джерел, виконав експериментальні дослідження in vitro та in vivo, здійснив математичну обробку отриманих даних та їх аналіз, систематизував та узагальнив усі розділи дисертації, сформулював основні положення, висновки та практичні рекомендації.
Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення дисертаційної роботи представлені та обговорені на міжнародних конгресах, симпозіумах, конференціях: World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences (Baltimore, Maryland, USA, 1993), Baltic Laboratory Animal Science Association III Conference (Vilnius, 1993), "Загрязнение окружающей среды. Проблемы токсикологии и эпидемиологии" (Москва-Пермь, 1993), "Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе" (Київ, 1993), "Медико-екологічні проблеми охорони здоров'я в Україні" (Чернівці, 1994), Second World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences (Utrecht, The Netherlands, 1996), International Conference "The Actual Problems of Modern Medical Care" (Chernivtsy-Engelholm, Sverige, 1996), Correlation Optics (Chernivtsy, 1997, 1999), XXXII-a Sesiune Stiintifica Anuala (Iasi, 1998), XXXIII-a Sesiune Stiintifica Anuala "Factori de risc din mediul de viata in relatie cu sanatatea populatiei" (Iasi, 1999), науковій конференції з міжнародною участю "Оздоровчі ресурси Карпат та прилеглих регіонів" (Чернівці, 1999), науково-практичних конференціях "Актуальні питання використання лабораторних тварин в медико-біологічних дослідженнях" (Чернівці, 1992), "Метагігієна-93" (Київ, 1993), "Метагігієна-94" (Київ, 1994), "Екологія і здоров’я дітей" (Чернівці, 1999), наукових конференціях "Вчені Буковини – народній охороні здоров'я" (Чернівці, 1994), "Актуальні питання морфогенезу" (Чернівці, 1996), "Современные проблемы медицины труда в Украине" (Київ, 1998), V національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 1999) та підсумкових наукових конференціях співробітників Буковинської державної медичної академії (Чернівці, 1997-2000).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 50 наукових робіт, у тому числі 27 у фахових наукових виданнях (із них 15 одноосібних) та 23 у збірниках наукових праць.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису об’єктів та методів досліджень, 6 розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури та додатків. Основний текст роботи викладено на 316 сторінках машинопису, ілюстровано 56 таблицями та 92 рисунками. Бібліографічний покажчик містить 566 джерел, з яких 362 зарубіжних та 204 українською та російською мовами.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Об'єкти та методи досліджень. Для досягнення поставленої мети та реалізації передбачених завдань проведено експериментальні дослідження in vitro та in vivo, а також здійснено обстеження серед вихованців підготовчих груп дитячих дошкільних установ.
Об'єкти та методи експериментальних досліджень in vitro. Цитотоксична дія солей металів вивчалась методом двократних серійних розведень на перещеплюваних культурах клітин типу Нер-2 (карцинома гортані людини), Rh (лінія ембріональних клітин нирок людини) та HeLa (карцинома шийки матки), які були вирощені в стандартних умовах і утворювали моношар. Середовище, в якому культивувалися клітини, заміщали підтримуючим середовищем, яке містило досліджувані сполуки металів у концентраціях від 4,9 мкг/мл до 10000 мкг/мл. Контролем служили клітини в підтримуючому середовищі без хімічних сполук. Цитотоксична активність речовин оцінювалась мікроскопічно за допомогою інвертованого мікроскопу.
Пiсля iнкубацiї в стандартних умовах культури клiтин Нер-2 з дослiджуваними сполуками металів за допомогою чотирьох тестiв: мiтотичного iндексу, iндексу альтерацiї, iнтенсивностi накопичення барвника нейтрального червоного в цитоплазмi клiтин та середнього коефiцiєнту забарвлення проводили цитоморфологiчне вивчення культур клітин, а також визначали в культуральнiй рiдинi змiни активностi аланінамінотрансферази та лактатдегiдрогенази, вмiст сечовини, креатинiну та середнiх молекул.
З метою виявлення можливого цитопротективного ефекту по відношенню до токсичного впливу солей металів досліджено in vitro препарати природного походження (спиртовий екстракт обнiжжя бджолиного (пилку квіткового), спиртові настоянки (галенові препарати) лікарських рослин - ехінацеї пурпурової, болиголову плямистого, арніки гірської), нову біологічно активну речовину Eрсол-1 та низькоінтенсивне лазерне опромінення. Вказані дослідження проводили в два етапи. Спочатку перевiряли вiдсутність цитотоксичної дiї в самих досліджуваних речовин та факторів, а потім вивчали їх можливу цитопротективну дiю щодо токсичного впливу солей металiв. Для цього живильне середовище, в якому в стандартних умовах культивувалась культура клiтин, замiщали пiдтримуючим середовищем, яке в 1 мл мiстило 0,1 мл екстракту або настоянки досліджуваного препарату природного походження та рiзнi концентрацiї (31,5 - 500 мкг/мл) дослiджуваних солей металiв. Для виявлення можливої протективної дiї лазерного опромiнення щодо токсичного впливу солей металiв живильне середовище, в якому в стандартних умовах культивувалась культура клiтин, замiщали пiдтримуючим середовищем, що мiстило рiзнi концентрацiї (31,5 - 500 мкг/мл) дослiджуваних солей металiв. Одразу ж пiсля внесення вказаних сполук на культуру клiтин дiяли за допомогою випромiнювача лазера ЛГН 203 (потужнiсть лазерного опромiнення 2.10-3 Вт, довжина хвилi 632,8 нм) низькоенергетичним лазерним опромiненням. Тривалiсть дiї складала 10, 20, 30 i 40 хвилин. Контролем служила культура клiтин з вiдповiдною концентрацiєю сполуки металу. Цитотоксична активнiсть солей металів та результати профілактичного впливу за їх дії препаратів природного походження та низькоінтенсивного лазерного опромінення оцiнювались мiкроскопiчно у вiдсотках цитопатичної дiї.
Характеристика лабораторних тварин та експериментальних моделей in vivo. Білі рендомбредні аутбредні щури та білі миші (аутбредна порода NMRI, вирощені від племядра 4 категорії (SPF)), які використано в дослідженнях in vivo, отримано з лабораторії експериментальних біологічних моделей НДІ МEП МОЗ України. Тварини знаходились на стандартному рацiонi та в стабільних умовах утримання (температура повітря - 18-200 С, відносна вологість - 50-60 %, світловий режим 12С:12Т), у роботi з ними керувались ОСТ 42 1-88 "Тварини лабораторнi. Технологiчний процес". Кількість тварин у статистичній групі становила 6 - 10.
Вивчення токсичності і небезпечності солей металів проведено за різних шляхів їх надходження в організм лабораторних тварин (введення в шлунок, внутрішньоочеревинно та інгаляційно) та за різних кратностей впливу (однократного, підгострого та субхронічного).
Для оцінки загальних закономірностей токсичної дії сполук свинцю на цілісний організм in vivo з метою подальшого дослідження ефективності профілактичних засобів по запобіганню виявлених порушень вивчено субхронічний вплив ацетату свинцю на організм лабораторних тварин. Свинцеву iнтоксикацiю моделювали шляхом внутрiшньошлункового введення бiлим рендомбредним щурам масою 0,13-0,17 кг впродовж 30 днiв ацетату свинцю в дозi 30 мг/кг (Ладанівский Р.І., 1982). З метою підтвердження виявлених in vitro захисних властивостей обнiжжя бджолиного, ехінацеї пурпурової та низькоінтенсивного лазерного опромінення проведено за умов субхронічної свинцевої інтоксикації вивчення їх профілактичного впливу. Для цього одна група тварин за 1,5 години до введеня вказаної вище дози ацетату свинцю iнтрагастрально отримувала водну суспензiю обнiжжя бджолиного в дозi 250 мг/кг (Волошин О.І., Пішак О.В., Мещишен І.Ф., 1998), друга - рiдкий водно-спиртовий екстракт ехiнацеї пурпурової в дозi 0,25 мл/кг (Геруш І.В., Мещишен І.Ф.,1998), а третя за допомогою апарату лазерного терапевтичного (АЛТ) “Мустанг” піддавалась неiнвазивному (черезшкiрному, контактному) впливу на область проекцiї печiнки лазерного iмпульсного опромiнення в iнфрачервонiй областi спектру з довжиною хвилi 0,89 мкм, iмпульсною потужнiстю 6-8 Вт, частотою iмпульсiв 80 Гц, часом впливу 64-128 с (Козлов В.И., Буйлин В.А., 1995).
За умов субхронічної свинцевої інтоксикації та профілактичного впливу досліджуваних речовин та факторів вивчали ряд інтегральних та специфічних показників, що характеризували загальний стан тварин, стан центральної нервової та імунної систем, м'язевої працездатності, а також показники периферичної крові, рівні свинцю в крові і сечі та рівень дельта-амінолевулінової кислоти в сечі.
При підгострому введенні впродовж 14 днів хлориду кадмію в дозі 0,03 мг/кг (Чала К.М., 1997) вивчено його вплив на стан центральної нервової системи, екскреторну, іонорегулюючу та кислотовидільну функцію нирок та стан ферментативного і неферментативного фібринолізу в сечі і кортикальній тканині нирок.
Методика корекцiї лiкувально-профiлактичними засобами порушень пiзнавальних здiбностей в дошкiльників. Обстежено рівні пізнавального розвитку у вихованців підготовчих груп дитячих дошкільних установ м. Чернівці з підвищеними (> 10 мкг/100 мл) та непідвищеними (< 10 мкг/100 мл) концентраціями свинцю в крові та досліджено ефективність лікувально-профілактичного застосування препаратів природного походження - настоянки ехінацеї пурпурової та суспензії обнiжжя бджолиного в комплексі медичних та психолого-педагогічних профiлактично-реабiлiтацiйних заходiв серед вихованцiв дошкiльних установ. Першу (контрольну) групу склали дошкiльники, серед яких медико-психологiчна корекцiйна робота проводилась iз застосуванням традицiйних медико-педагогiчних заходів, що базуються на програмi дитячого дошкiльного виховання "Малятко" та методичних рекомендацiях по диспансерному спостереженню за дiтьми (Степанова Е.И. и др., 1992). Дошкільники другої та третьої груп спостережень поряд з традиційними медико-педагогiчними заходами отримували профілактичні курси препаратiв ехiнацеї пурпурової та обнiжжя бджолиного. За вiком, статтю, фізичним розвитком, групами здоров'я, мiкросоцiальними характеристиками сiмей дiтей (з врахуванням внутрiшньосiмейних стосункiв і батькiвсько-дитячих вiдносин), екологiчними характеристиками умов проживання вказані групи суттєво не вiдрiзнялись.
На початку (у вересні) та наприкінці (у травні) навчального року проведено за участю аспіранта кафедри дитячих хвороб № 1 Буковинської державної медичної академії (зав. – професор Безруков Л.О.) Ященка Ю.Б. обстеження психологічного розвитку дошкільнят вказаних груп спостереження та дошкільнят з непідвищеними рівнями свинцю в крові. Для цього використано психолого-педагогічні завдання, що моделювали пізнавальну діяльність дитини в умовах природного експерименту, тобто в процесі організації звичайної специфічної для неї діяльності, якою є гра (Кулачківська С.Є., Ладивір С.О., 1996). Завдання були спрямованi на вивчення рiвня сформованостi основних операцiй мислення (аналiз та порiвняння), здiбностей дошкiльникiв до узагальнення, уявлення, логiчної обумовленостi i чiткостi висловлювань, обгрунтування власної думки (завдання "Четвертий зайвий" - модифiкований варiант Т.О.Власової та М.С.Певзнер). Для комплексної оцiнки пiзнавального iнтелекту дитини використовували iнтегральний показник пiзнавальної дiяльностi, який вираховувався як сума спiввiдношень показникiв пiзнавальної дiяльностi дитини, що обстежується, до середнiх величин цих показників.
Перед проведенням комплексу профiлактично-реабiлiтацiйних заходiв та після його закінчення в обстежуваних дошкільників також збирали сечу та проводили на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С115M-1 визначення в ній рiвнів свинцю та уніфікованим методом з n-диметиламінобензальдегідом (Меньшиков В.В. и др., 1987) - дельта-амінолевулінової кислоти.
Математичну обробку отриманих in vivo даних проводили на ПEОМ за допомогою програми "Statgraphics" (США) з використанням загальноприйнятих статистичних методів.
Результати власних досліджень, їх аналіз та обговорення. Клiтинний рiвень дiї сполук металiв обгрунтовував доцільність використання на першому етапі наших досліджень експериментів in vitro, при проведенні яких встановлена висока чутливість перещеплюваних культур клітин Hep-2, Rh та HeLa до токсичної дії як неорганічних, так і органічних солей металів, цитопатична активність яких знаходилась у широкому діапазоні (для культури клітин HeLa, наприклад, від 27 мкг/мл у сульфату кадмію до 3546 мкг/мл у стеарату кальцію) і залежала як від характеру металу, який входить до складу сполуки, так і її кислотного залишку (рис. 1). Так, у ряду оксалатів металів концентрація ксенобіотика, яка викликає 50 % цитопатичних змін (ЦПК50), складає в оксалату заліза (III) 152 мкг/мл, оксалату калію – 175 мкг/мл, оксалату алюмінію – 184 мкг/мл, оксалату олова – 211 мкг/мл, оксалату магнію – 268 мкг/мл, оксалату кобальту – 605 мкг/мл. У свою чергу, ацетат свинцю мав ЦПК50 на рівні 186 мкг/мл, стеарат свинцю – 263 мкг/мл, а нітрат свинцю – 316 мкг/мл.
Рис 1. Цитотоксичність сполук металів стосовно культури клітин HeLa.
Оскільки не були розробленi методичнi пiдходи щодо реєстрацiї цитоморфологiчних та біохімічних змiн у культурах клiтин, якi зазнавали токсичного впливу металів, нами проведено експериментальне дослiдження критерiального значення ряду цитоморфологiчних та біохімічних показникiв при оцiнцi цитотоксичностi сполук металiв. Найбільш чутливими цитоморфологічними показниками серед вивчених визнано мітотичний індекс та відсоток клітин з низькою інтенсивністю накопичення барвника нейтрального червоного, кожен з яких дозволив виявити вірогідні зміни в 95,6 % випадків, а їх поєднання - у всіх 100 % вивчених випадків (рис. 2). Основним біохімічним критерієм цитотоксичності металооксалатів є збільшення вмiсту в культуральнiй рiдинi креатинiну. Показано, що використання поряд iз цитоморфологiчними показниками і бiохiмiчних критерiїв дозволяє збільшити чутливість методу культур клітин при токсичній дiї хiмiчних речовин на клiтини.
Водночас показано, що оцінку цитотоксичної дії сполук металів потрібно робити на основі комплексного цитоморфологічного дослідження культур клітин, враховуючи різні типи їх ураження, яких нами виділено наступних
Рис. 2. Критеріальне значення цитоморфологічних показників
чотири. Перший тип уражень - порушення адгезії клітин до скла, наслідком чого є десквамація (злущування) клітин, яка може бути повною або вогнищевою. Другий тип уражень - незворотні зміни ядра. При такому типі ураження клітини можуть зберігати адгезивні властивості або їх втрачати. Третій - зниження або значно рідше - посилення мітотичної активності клітин культури. І четвертий тип уражень - порушення накопичення вітального барвника. За токсичної дії сполук металів на культуру клітин спостерігали різні варіанти цитотоксичного впливу вказаних ксенобіотиків, що залежало від переваги одного з вказаних вище типів цитотоксичної дії токсикантів або тієї чи іншої комбінації таких типів.
Проведене встановлення ступеня кореляцiї мiж показниками, якi отримано в дослiдах in vitro на культурах клітин, i показниками, які одержано в експериментах in vivo на лабораторних тваринах, засвiдчило про вiдсутнiсть кореляцiї між цими показниками у випадку встановлення кореляцiйних взаємовідносин для всiєї сукупностi досліджених сполук металiв та її наявнiсть у випадку їх встановлення в окремих рядах сполук металiв. У зв'язку з цим зазначено, що прискорене токсикологiчне вивчення та гiгiєнiчне нормування нових сполук металiв з використанням альтернативного методу дослiдження in vitro на культурi клiтин можливе лише в певних рядах сполук металiв.
Вагомість отриманих на першому етапі результатів збільшується тим, що використані нами тест-об'єкти (культури клітин Hep-2, Rh та HeLa) є культурами клітин людини, використання яких дозволяє проводити більш надійну екстраполяцію на організм людини отриманих in vitro результатів. Водночас вони є перещеплюваними культурами клітин, які порівняно з первинними та диплоїдними легше культивуються, швидше ростуть, мають необмежену тривалість життя, що полегшує стандартизацію даної системи і можливість відтворення отриманих результатів.
Виявлена нами на першому етапi дослiджень висока чутливiсть перещеплюваних культур клiтин до дiї сполук металiв дозволила перейти до наступного етапу дослiджень - перевiрки ефективностi використання цього тест-об'єкту in vitro для скринiнгового пошуку речовин та факторiв, що проявляють цитопротективну дiю стосовно токсичного впливу вказаних ксенобiотикiв. Встановлено, що внесення цих засобiв у культуру клiтин, на яку дiяли рiзними концентрацiями солей металiв призводило до зменшення цитотоксичного впливу цих ксенобiотикiв на клiтини. Так, наприклад, спиртовий екстракт обнiжжя бджолиного зменшував кiлькiсть цитопатично вражених клiтин з 84,2 до 37,8 % за токсичної дiї нітрату свинцю в концентрації 500 мкг/мл, з 33,3 до 18,6 % за дії нітрату свинцю в концентрації 250 мкг/мл (рис. 3). Ацетат свинцю в концентрації 250 мкг/мл спричиняв цитопатичну дію на 21,7 % клітин, а за внесення екстракту обнiжжя бджолиного - лише 8,7 % (рис. 3). Подібно до сполук свинцю на 31,0 – 83,8 % зменшувалась за внесення обніжжя бджолиного і цитотоксичність сполук кадмiю (рис. 3).
Рис. 3. Ізольваний вплив сполук і їх вплив на фоні обнiжжя бджолиного
Настоянка ехінацеї пурпурової в розведенні 1:10 майже вдвічі зменшувала цитотоксичну дію нітрату свинцю в концентраціях 500 та 250 мкг/мл, майже втричі - ацетату свинцю в концентрації 250 мкг/мл (рис. 4).
Рис. 4. Ізольований вплив солей металів та їх вплив на фоні ехінацеї
пурпурової у розведенні 1:100 та 1:10
За внесення ехінацеї зменшувався негативний вплив і солей інших металів. Так, вдвічі знижувалась цитотоксичність оксалату калію, сульфату кадмію, втричі - нітрату кадмію. Слід звернути увагу, що настоянка ехінацеї в розведенні 1:10 майже повністю попереджувала негативний вплив нітрату кадмію в концентрації 31 мкг/мл.
При вивченні особливостей впливу настоянки болиголову плямистого виявлено різнонапрямлений характер дії на культуру клітин його складових (рис. 5). Так, настоянка насіння болиголову спричиняла різке посилення цитотоксичності досліджуваної солі металу. На відміну від неї настоянки сухого листя та квітів вірогідно зменшували цей вплив ксенобіотика.
Рис. 5. Ізольований вплив оксалату калію та його вплив на фоні різних складових болиголову плямистого в розведеннях 1:100 та 1:10
Нова біологічно активна речовина Eрсол-1 також проявляла захисний вплив при токсичній дії сполук металів. При цьому чітко простежувався дозозалежний характер цієї дії. Так, відсоток ЦПД нітрату свинцю знижувався з 33,3 до 9,0 за впливу БАП Eрсол-1 у концентрації 200 мкг/мл та до 1,2 за його впливу в концентрації 400 мкг/мл. Відповідно за дії ацетату свинцю - 21,7, 8,3 і 0,33 та стеарату свинцю – 33,3, 26,7 і 12,3 %. Подібна картина спостерігалась і при впливі на культуру клітин сульфату та нітрату кадмію, оксалату алюмінію.
Встановлена цитопротективна дія і в низькоінтенсивного лазерного опромінення (ЛО), вираженність якої чітко залежала від тривалості опромінення (рис. 6.). Так, на фоні 10-хвилинного опромінення втричі зменшувалась цитотоксичність нітрату та ацетату свинцю. Після 20-хвилинного опромінення токсичний вплив цих сполук свинцю зменшувався більш як у 5 разів. Ще більшою мірою проявився захисний вплив низькоінтенсивного лазерного опромінення при дії солей кадмію. Цитотоксичність сульфату кадмію, наприклад, зменшилась з 10,0 % до 1,8 та 1,2 %.
Рис. 6. Ізольований вплив металів та їх вплив на фоні ЛО 10 та 20 хв.
Таким чином, проведенi експериментальнi дослiдження in vitro пiдтвердили наявнiсть цитопротективного ефекту в дослiджуваних речовин та факторiв та обгрунтували доцiльнiсть перевiрки їх захисної ефективностi в дослiдах in vivo на лабораторних тваринах. При змодельованій для цього субхронiчнiй свинцевiй iнтоксикацiї встановлено зниження приросту маси тiла дослiдних бiлих щурів та його відставання від приросту маси тіла контрольних тварин (рис. 7).
Рис. 7. Динаміка зміни маси тіла лабораторних тварин
Введення на фоні свинцевої інтоксикації бджолиного обнiжжя (БО), ехiнацеї пурпурової (ЕП) та низькоiнтенсивне лазерне опромiнення проявляли в рiзнiй мiрi виражену коригуючу дiю на динамiку даного iнтегрального показника. При цьому слiд зазначити, що маса тiла тварин, якi отримували на фонi свинцевої iнтоксикацiї обнiжжя бджолине, значно перевищувала масу тiла навiть контрольних щурiв, а динамiка цього показника в бiлих щурiв, якi на фонi введення ацетату свинцю пiддавались низькоiнтенсивному лазерному опромiненню, чiтко залежала вiд часу проведення курсiв опромiнення.
Встановлено, що тривала свинцева iнтоксикацiя супроводжується різким пригнiченням поведiнкової активностi. Профiлактичне введення на фонi свинцевої iнтоксикацiї бджолиного обнiжжя, ехiнацеї пурпурової та проведення низькоiнтенсивного лазерного опромiнення спричиняло захисний ефект на центральну нервову систему тварин, що проявлялось вiдновленням змiнених за токсичного впливу ацетату свинцю поведiнкових реакцiй (рис. 8). Однак, слід зазначити, що при цьому повне відновлення все ж спостерігалось не завжди - рівні поведінкової активності хоча і були вищими порівняно з відповідними величинами за ізольованого введення ацетату свинцю, та все ж вони були дещо нижчими контрольних показників.
Рис. 8. Інтегральна поведінкова активність білих щурів при дії різної кратності ацетату свинцю (PbA)
За субхронiчної свинцевої iнтоксикацiї рiзко пригнiчувалась м'язева працездатнiсть бiлих щурiв. Введення на фонi цiєї сполуки бджолиного обнiжжя, екстракту ехiнацеї пурпурової та проведення низькоiнтенсивного лазерного опромiнення з рiзним ступенем вираженностi зменшувало токсичний вплив свинцю на м'язеву працездатнiсть. Проведене при цьому порiвняння ступеня вираженностi протективного ефекту вказаних трьох профiлактичних засобiв показало, що впродовж перших 12 днiв експерименту динамiка змiни м'язевої працездатностi за впливу вказаних чин | 
