|
УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВИЙ ГІГІЄНІЧНИЙ ЦЕНТР
ДУГАН
ОЛЕКСІЙ МАРТЕМ’ЯНОВИЧ
УДК [576.851.94+375.113]614.7
СУМАРНА МУТАГЕННА АКТИВНІСТЬ ЯК
ІНТЕГРАЛЬНИЙ ПОКАЗНИК ОЦІНКИ ЕКОЛОГО-
ГЕНЕТИЧНОГО СТАНУ ДОВКІЛЛЯ
03.00.15 - генетика (біологічні науки)
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
КИЇВ - 1998
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Українському науковому гігієнічному центрі МОЗ України
Наукові консультанти:
Доктор медичних наук, професор Бариляк І.Р., Український науковий гігієнічний центр МОЗ Украіни, директор центру
Доктор медичних наук Прокопов В.О., Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, завідуючий лабораторією
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор Горова А.І., Інститут проблем природокористування та екології НАН України, завідуюча відділом
Доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Мацелюх Б.П., Інститут мікробіології і вірусології НАН України, завідуючий відділом
Доктор медичних наук Гаврилюк Ю.Й., заступник директора Львівського НДІ спадкової патології МОЗ України, завідуючий відділом
Провідна установа:
Національний університет ім. Т. Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики, м.Київ
Захист відбудеться "22" жовтня 1998р. о 1000 на засіданні спеціалізованої вченої ради при Українському науковому гігієнічному центрі за адресою: 252660, м.Київ-94, вул. Попудренка, 50.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Українського наукового гігієнічного центру, м.Київ-94, вул. Попудренка, 50.
Автореферат розісланий "19" травня 1998 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат медичних наук Б.Ю.Селезньов
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Для оцінки властивостей хімічних сполук запроповано біля 100 різних тест-систем, багато з яких добре розроблені в методичному плані і достатньо широко застосовуються як для виявлення мутагенів (скринінгові методи), так і для оцінки їх генетичної небезпеки для людини. Однак, велика кількість хімічних сполук, які вже містяться в різних об`єктах довкілля, а також явища трансформації їх в цих об`єктах, приводять до того, що традиційні методи аналізу нездатні дати заключення про реальну мутагенність забруднень цих об`єктів, що змушує шукати нові підходи до оцінки саме реальної (сумарної) мутагенної активності складних сумішей забруднень наколишнього середовища.
Один із таких підходів - тестування проб з об`єктів середовища з застосуванням біологічних тест-систем, який називають оцінкою сумарної мутагенної активності (СМА), сумарної мутагенності (СМ), дозволяє, по-перше, оцінити істинну мутагенність забруднень об`єкта довкілля в цілому і; по-друге, якщо активність виявляється підвищенною - проводити подальше вивчення таких забруднень шляхом фракціювання з наступною оцінкою мутагенності окремих фракцій і хімічного аналізу, що, в кінцевому результаті, дозволить виявити окремі хімічні сполуки, які обумовлюють мутагенність всього комплексу забруднень.
Оцінка потенційної СМ хімічних забруднень об`єктів середовища може стати (при умові введення показника СМ для апробації генетичної безпеки гігієнічних нормативів, для умов комбінованої дії хімічних речовин на організм. Подібні дослідження актуальні ще й тому, що є достатньо надійним, швидким і відносно дешевим індикатором генетичного (і онкологічного) неблагополуччя об`єктів навколишнього середовища. Підвищення ж показника СМ (відносно контрольних значень, встановлених нами в даному дослідженні) - сигнал до широкомасштабного проведення генетичного моніторингу, так як всебічна оцінка мутагенності комплексу хімічних забруднень із навколишнього середовища з метою виключення чи (у крайньому випадку) обмеження контакту їх з людською популяцією в деякій мірі здатна зменшити частоту самовільних викиднів і вроджених вад розвитку, що, в кінцевому результаті, покращить генетичне здоров`я населення України.
Це безпосередньо стосується атмосферного повітря і питної води великих промислових міст України, тому що викиди промислових підприємств значною мірою забруднюють повітря мутагенами, а використання хлору в якості дезинфектанту при водопідготовці “збагачує” питну воду новими хімічними сполуками, здатними втручатися в матеріал спадковості. Біотестування на мутагенність цих об`єктів середовища в Україні практично не велося, як і в бувшому СРСР. Це було пов`язано, з одного боку, з відсутністю відповідних фахівців, а, з другого, з недосконалістю методики вивчення і оцінки СМ в тесті Еймса. Поодинокі роботи в цій галузі стосувались окремих питань і не висвітлювали стану проблеми в цілому.
Ці дослідження були проведені в рамках державної програми “Захист генофонду населення України”.
Мета дослідження - розробити методичну схему вивчення і оцінки сумарної мутагенної активності хімічних забруднень навколишнього середовища на бактеріальних тест-системах і на основі цього показника встановити реальну генетичну небезпеку об`єктів довкілля для здоров`я населення.
Завдання дослідження.
1. Вдосконалити метод інтегральної оцінки мутагенності комплексу хімічних сполук, які циркулюють в об`єктах навколишнього середовища, на бактеріальних тест-системах.
2. Вивчити мутагенність води з різних джерел водопостачання (поверхневих, підземних), які відрізняються за ступенем антропогенного забруднення, і дати порівняльну оцінку ефективності видалення мутагенів у основному технологічному ланцюгу водопідготовки.
3. Виявити та оцінити потенційну мутагенність питної води при використанні нових способів водообробки.
4. Вивчити ефективність побутових водоочисних пристроїв, які рекомендуються для доочистки питної води, у відношенні видалення хімічних мутагенів.
5. Провести тестування на мутагенність газової і аерозольної компонент атмосферного повітря в містах з різним характером і рівнем промислового розвитку.
6. Обгрунтувати рекомендації по зниженню сумарної мутагенності об’єктів довкілля (води, атмосферного повітря) і попередженню їх впливу на генетичне здоров’я людей.
Наукова новизна дослідження полягає в тому, що
- запропонована нова методична схема вивчення та оцінки мутагенності комплексу факторів середовища (води, повітря) на бактеріальних тест-системах, які дозволяють уникнути псевдопозитивних і псевдонегативних результатів;
- встановлена ступінь мутагенності природних вод (підземних, поверхневих) і її залежність від інтенсивності антропогенної контамінації водних джерел з урахуванням сезонного фактору;
- отримані нові дані стосовно утворення мутагенно-активних хімічних сполук у воді при застосуванні в технології водопідготовки сильних окислювачів (хлор, озон), визначена роль первинного та вторинного хлорування (озонування) води в цьому процесі;
- встановлена залежність утворення мутагенів при взаємодії сильних окислювачів з органічними сполуками від кількості органіки в воді, дози окислювальної здатності хлору та озону;
- визначено вклад в зменшення початкової мутагенності води різних етапів традиційної технологічної схеми водоочищення, що використовується на водогінних станціях з річковими водозаборами;
- науково обгрунтовані шляхи підвищення якості очищення води від мутагенів на водогінних станціях (заміна хлорування на озонування, фільтри сорбційні на основі ГАВ) і в побутових умовах (водоочисні пристрої з сорбційними завантаженням);
- виявлені особливості і основні закономірності забруднення атмосферного повітря мутагенно-активними речовинами в містах з різним характером і рівнем промислового розвитку: визначений вклад в сумарну мутагенну активність аєрозольної і газової складової атмосферного повітря;
- проаналізована залежність між ступенем забруднення атмосферного повітря хімічними мутагенами і генетичною захворюванністю населення.
Теоретична значущість роботи полягає в:
- науковому обгрунтуванні методичних підходів до вивчення на бактеріальних тест-системах сумарної мутагенної активності хімічних забруднень об`єктів довкілля;
- розробці критеріальної шкали для оцінки ступеня генетичної небезпеки забруднення мутагенними агентами об`єктів середовища;
- встановленні особливостей і основних закономірностей утворення (і видалення) мутагенів при застосуванні традиційних і нових технологій підготовки питної води з поверхневих вододжерел і альтернативних методів (побутові доочисні пристрої) доочистки питної води;
- встановленні особливостей і основних закономірностей забруднення мутагенами повітряного середовища (газова та аерозольна компоненти) міст з різним рівнем промислового розвитку;
- виявленні кількісних залежностей між ступенем забруднення мутагенами атмосферного повітря і генетичного захворювання населення.
Практичне значення роботи полягає в тому, що:
- вдосконалена схема визначення на бактеріальних тест-системах сумарної мутагенної активності комплексу хімічних забруднень об`єктів довкілля;
- дана оцінка антимутагенної ефективності ряду нових вітчизняних та зарубіжних водоочисних пристроїв індивідуального призначення, що дозволило розширити показання до їх застосування з врахуванням регіональних особливостей якості питної води;
- проведено ранжування питних водогонів за ступенем мутагенної небезпеки, яка спадає в ряді: річковий водогін, змішаний артезіансько-річковий водогін, артезіанський водогін;
- показано можливість зниження до безпечних рівнів мутагенності питної води зі збільшенням в мережах водопостачання змішаних водогонів об`єму артезіанських вод;
- дана порівняльна оцінка методу прехлорування і преозонування природної води і встановлена роль кожного з них у процесі утворення мутагенів;
- обгрунтована можливість попередження утворення мутагенів на водогінних станціях з річковими водозаборами, де використовується прехлорування, або преозонування природної води шляхом введення в технологічну схему водопідготовки етапу фільтрації води через сорбційні завантаження (ГАВ);технологічної схеми підготовки питної води з поверхневих вододжерел і обгрунтовані шляхи досягнення максимальних антимутагенних ефектів на очисних спорудах річкових водогонів;
- проведене широкомасштабне тестування на мутагенність повітряного середовища (аерозольна та газова складові) великих міст України і ранжування їх за ступенем еколого-генетичної небезпеки;
Вправадження в практику. Отримані в результаті даного дослідження експериментальні дані лягли в основу розробки і видання чотирьох Методичних рекомендацій по стратегії і тактиці вивчення та оцінки мутагенної активності (МА) хімічних забруднень атмосферного повітря, питної води, лікарских препаратів, а також по математичній обробці результатів мутагенних досліджень.
Вдосконалена схема тестування СМ хімічних забруднень об`ектів довкілля впроваджена в роботу відповідних кафедр університетів і науково-дослідних інститутів України, які займаються генетичними аспектами охорони навколишнього середовища.
Матеріали дисертаційної роботи включені в лекційний курс екології Київського національного технічного університету і використовуються в робочих програмах при підготовці інженерів-екологів у післядипломному навчанні спеціалістів.
Отримані в дисертаційної роботі експериментальні дані по динаміці зміни СМ проб вод в основних технологічних ланцюгах водопідготовки використовуються при розробці нових технологій водообробки на Дніпровському та Деснянскому водогонах.
Основні положення, які виносяться на захист.
1. Нова схема тестування на мутагенність в методиці Єймса комплексу хімічних сполук із об`єктів навколишньго середовища.
2. Підготовка питної води з поверхневих і підземних вододжерел за традиційною технологічною схемою приводить до підвищення СМ природної води на етапі прехлорування; на наступних етапах водоочистки, при чіткій тенденції до зниження мутагенності води, повного видалення мутагенів не відбувається і частина їх надходить у питну воду.
3. Нові технології водопідготовки (з фільтрацією води через ГАВ) незалежно від виду і місця вводу дезинфектанта (хлору. озону) повністю знімають СМ питної води.
4. Газова та аерозольна складові атмосферного повітря промислово розвинутих міст України мають приблизно рівні ступені СМ, яка не залежить від стану системи метаболічної активації.
Особистий вклад автора полягає в тому, що на базі свого фактичного матеріалу розробив схему тестування комплексу хімічних сполук із об`єктів середовища на мутагенну активність. Організував відбір і підготовку проб вод і атмосферного повітря до дослідження. Провів всі експерименти на виявлення і оцінку мутагенних ефектів (МЕ) проб повітря та вод, провів обробку первинного матеріалу, підготував текст дисертації.
Апробація роботи. Основні положення дисертації викладені на:
- Всесоюзній конференції “Медичні аспекти охорони навколишнього середовища” (листопад,1986 р., Тарту);
- Засіданні секції генетичних аспектів “Людина та біосфера” (1988., Київ);
- Засіданні секції генетичних аспектів “Людина та Біосфера” (1988 р., Кемерово);
- ІІ Всесоюзній координаційній нараді “Еколого-генетичні наслідки впливу на навколишнє середовище антропогенних факторів” (березень, 1988 р., Сиктивкар)
- З`їзді генетиків України (1992 р., Полтава);
- Науковій конференції “Гігієна навколишнього середовища” (1994 р., Київ);
- V конгресі СФУЛТу (вересень, 1994 р., Дніпропетровськ);
- ІІ з`їзд медичних генетиків України (жовтень, 1995 р., Львів).
- Internationak Conference on Environmental and Occupational Cancer in Dеveloping Countries (august, 1998 Rio de Janeiro);
- Международной научно-практической конференции ВОДА И ЗДОРОВЬЕ - 98, Одесса, 1998.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 80 наукових робіт, з них 23 статті, 4 Методичні рекомендації.
Об`єм і структура дисертації. Дисертація написана російскою мовою, викладена на 309 сторінках машинопису і складається з вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів, 5 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку літератури, додатків. Текст дисертації ілюстрований 49 графіками, 20 таблицями. Список літератури містить 320 найменувань.
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. В якості об`єктів цих досліджень використовували:
1. Атмосферне повітря 18 міст України з різним рівнем і специфікою промислового виробництва - міста з переважно розвинутою металургійною промисловістю (“металургійні”) - Маріуполь, Запоріжжя, Донецьк, Кривий Ріг, Макіївка; міста з переважно розвинутою хімічною промисловістю (“хімічні”) - Северодонецьк, Лисичанськ, Рубежне, Кременчук, Черкаси, Чернігів, Суми, Полтава, Горлівка; умовно чисті міста - Севастополь, Сімферополь, Миколаїв, Житомир, Рівне.
Проби аерозольної компоненти атмосферного повітря відбирали в кожному місті один раз у тиждень на стаціонарних постах Укргідромету на фільтри АФА-ВП-20 з таким розрахунком, щоби протягом місяця було протягнено 100 м3 повітря. Фільтри, зібрані за місяць, об`єднували (середньомісячна проба) з наступною екстракцією хімічних речовин органічними розчинниками в апараті Сокслета за загальноприйнятою методикою (Хмельницкий Р.А., Бродский Е.С., 1984), паралельно в цих же пробах визначили мутагенно- активні сполуки. Тривалість експерименту - 12 місяців. Проби газової компоненти відбирали за допомогою пробовідбірників (концентраторів), заповнених полімерним сорбентом ПОЛІСОРБ-2. Пробовідбірники були виготовлені із скляних трубок зі зовнішнім діаметром 5,4 мм і внутрішнім - 4 мм; загальна довжина пробовідбірника - 160 мм, висота стовпа сорбенту - 80 мм. Сорбент перед засипкою його в пробовідбірники ретельно мили в апараті Сокслета послідовно гексаном і ацетоном. Остаточно заповнений пробовідбірник готовий до відбору проб після продувки його гелієм при підвищеній температурі (1500-1800). Відбір газової компоненти здійснювали в тому ж об`ємі.
2. Проби вод із джерел водопостачання з різним рівнем антропогенного забруднення (Дніпровська, Деснянська, вода з артезіанских свердловин); проби вод із основних технологічних ланцюгів водопідготовки Дніпровського та Деснянського водопроводів, проби вод із нових технологій водопідготовки, питні води змішаного водопроводу та профільтровані через індивідуальні побутові фільтраційні установи.
Нелегкі та обмежено легкі органічні сполуки природної води до та після обробки окислювальними агентами - активним хлором і озоном, а також за технологічною схемою водопідготовки добували з кислих розчинів за допомогою пористих полімерних сорбентів різної хімічної природи: ПОЛІСОРБ-1, ХАД-7, ХАД-8 (Мілюкін М.В., 1993, 1994).
Нові технології водопідготовки полягали в наступному:
а) природна вода (Дніпровська)+преозонування (доза поглинутого озону 4,25 мг/л, час контакту 5 хв.)+ коагулянт (45 мг/л), відстоювання 2години, фільтрація через піщаний фільтр+вторинне озонування (доза поглинутого озону 2,75 мг/л, час контакту 5 хв.) фільтрація через ГАВ+хлорування (доза активного хлору 1,5 мг/л) - проба А.
б) природна вода+прехлорування (доза активного хлору 10 мг/л, час контакту 10 хв.)+коагулянт (45 мг/л), відстоювання 2 години, фільтрація через піщаний фільтр, фільтрація через ГАВ+вторинне хлорування (доза активного хлору 1,5 мг/л) - проба Б.
Експериментальні дослідження проводили, використовуючи тест-штами Еймса: ТА 98 і ТА 100 (Ames et al., 1971) згідно методичних рекомендацій, розроблених при безпосередній участі автора (1986, 1989, 1990, 1996). Первинна статистична обробка полягала в розрахунку середньої арифметичної (-Х ): -
n
-Х= 1/nΣ - Xi ,помилки середньої аріфметичної (S-X):
i-1
S2 =
-X
Взаємоз’язок між показником забруднення довкілля (х) і показником СМА (у) визначалась за допомогою коефіцієнта кореляції:
rXY =
Враховуючи невеликий об’єм вихідної вибірки (n<100) для коефіцієнта кореляції використовувалась наступна поправка (rXY):
rXY = rXY
Помилка коефіцієнта кореляції розраховувалась за формулою:
Sr =
Достовірність коефіцієнту кореляції розраховувалась за критерієм Стьюдента:
tr = r
Для критерія Стьюдента розраховувалась достовірність Pr. Вклад факторів в зміну рівнів мутагенності визначали за допомогою коефіцієнта детермінації (D):
D = r2
XY
Вся математична обробка виконувалась на персональних комп’ютерах з використанням стандартних статистичних пакетів (Statgraphics, STATISTICA), а також спеціальних статистичних програм, розробленіх в УНГЦ (пакет МАГ-розробник Русакова Л.Т.).1)
В якості позитивних контролей використовували модельні мутагени, дози яких встановлені нами в експерименті.
Результати досліджень та їх обговорення
Вдосконалення схеми досліджень
Для тестування СМ проб із об`єктів навколишнього середовища необхідне обов`язкове виконання трьох умов: 1) коливання числа ревертантних колоній в контрольних варіантах у строго визначених межах (спонтанний фон мутування - СФМ - для кожного тест-штаму повинен бути стабільним); 2) чутливість тест-організму до мутагенних агентів; 3) оцінка мутагенних ефектів з мінімумом псевдо-результатів.
Аналіз літературних даних показав, що вищеперераховані умови варіюють у широких межах, тому розробка стандартної схеми досліджень є запорукою отримання об`єктивних результатів.
1. Щоб оцінити СФМ тест-штамів були проаналізовані коливання середньої кількості колоній-ревертантів “історичного” контролю при повній (МС+) і неповній (МС-) системі метаболічної активації. Розподіл дослідів по середньому числу колоній-ревертантів на чашку в контролі для тест-штамів представлено в таблиці 1.
Для обох тест-штамів емпіричний розподіл середнього числа колоній за даними всіх дослідів суттєво відхилявся від нормального. Таким чином, з результатів досліджень випливае, що для даних тест-організмів вихід ревертантних колоній у контрольних варіантах не залежить від стану системи метаболічної активації. Оскільки 95% значень середнього числа колоній було в межах -Х+2σ, то середнє число колоній на чашку в наших експериментах складало: для ТА 98 від 11 до 44 колоній, для ТА 100 від 41 до 94 колоній. Будь-які коливання середнього числа на чашку в контрольних варіантах, які виходять за встановлені межі, говорять про факт втрати мутації бактеріальним геномом, або про можливі методичні помилки. В цьому випадку необхідно проводити перевірку генотипу штаму, у якого має місце відхилення числа колоній в контролі.
2. Вище було обгрунтовано необхідність введення в систему скринінгу позитивних контролей. В таблиці 2 представлені експериментальні дані по вивченню мутагенності деяких потенційних позитивних контролей. Як видно, в якості позитивних контролей для ТА 98 може служити ДДДТДП у максимально ефективній дозі 500 мкг на чашку, відповідно для ТА 100 цією речовиною може бути біхромат калію в дозі 200 мкг на чашку. Контролем ефективності роботи мікросомальних ферментів - або бензідін (200 мкг/чашку для ТА 98), або циклофосфан (ТА 100, 200 мкг/ чашку). Всі позитивні контролі, які рекомендуються, дають стабільні, відтворювані від досліду до досліду позитивні мутагенні ефекти з чіткою залежністю ефекту від дози речовини.
Таблиця 1
Розподіл дослідів по середній кількості колоній Salmonella typhimurium на
чашку
3. При тестуванні на мутагенність в мікробних тест-системах можуть мати місце три ситуації: а) кількість колоній-ревертантів у дослідних варіантах по всіх досліджених дозах не відрізняється від СФМ відповідних штамів-тестерів; б) кількість колоній в досліді більша від спонтанного рівня в 1,2-2,0 рази; в) кількість колоній в досліді істотно (на порядок і більше) більша, ніж спонтанний фон (СФ) і спостерігається зростання їх із збільшенням дози мутагену.
Узагальнивши свій та прийнявши до уваги досвід попередніх дослідів по оцінці мутагенності, нами на базі власних дослідів було знайдено ту кратність перевищення числа колоній в досліді відносно контролю, при якій частка (%) значущих, перевищуючих контроль результатів буде складати 90% і більше. Для вироблення системи прийняття рішень про те, чи є та чи інша суміш хімічних речовин із об`ектів довкілля потенційно мутагенною, необхідно бути впевненим, що виявлені ефекти істинні у 100% випадків, тобто виключити псевдонегативні і псевдопозитивні результати. Наприклад, для штаму ТА 98 перевищення від 1,2 до 1,39 дає 3,7 % статистично значущих результатів, а для ТА 100 - 10%. Більш високий процент для ТА 100 пояснюється тим, що дисперсія досліду у цього штаму більша. По мірі збільшення співвідношення -Хд./-Хк. процент значущих результатів зростає і при 2,0 та більше для ТА 98 всі 100% результатів значущі. Для ТА 100 всі результати значущі при перевищенні 1,8 і більше. Таким чином, співставивши дані багаторічних власних досліджень, ми рекомендуємо проводити оцінку мутагенних ефектів наступним чином: незалежно від коливання дисперсії досліду мутагенний ефект вважати встановленим при перевищенні кількості колоній в дослідних варіантах відносно спонтанного контролю для ТА 98 в 2 рази, для ТА 100 - в 1,8 рази. Слабий ефект: -Хд./-Хк. - до 10 разів, середній ефект: -Хд./-Хк. від 10,0 до 100,0; сильний ефект:-Хд./-Хк. більш, ніж 100,0.
Таблиця 2
Мутагенна активність позитивних контролей
| 
