Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

КРИСЬКО
ОКСАНА МИХАЙЛІВНА

УДК 577.13+615.356+577.3:546.173

РОЛЬ КАРНОЗИНУ У ПОПЕРЕДЖЕННІ МЕТАБОЛІЧНИХ
ПОРУШЕНЬ В ПЕЧІНЦІ ЩУРІВ ПРИ ДІЇ НІТРИТУ НАТРІЮ

03.00. 04 – Біохімія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського державного університету ім. Івана Франка.

Науковий керівник – кандидат біологічних наук, доцент

Коробов В’ячеслав Миколайович,
Львівський державний університет ім. Івана Франка,
доцент кафедри біохімії.

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович
Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України
завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
Артюх Валерій Петрович
Український науковий гігієнічний центр МОЗ України,
провідний наук. співр. лабораторії біохімічної генетики.

Провідна установа – Чернівецький державний університет ім. Юрія Федьковича,
кафедра біохімії.

Захист відбудеться « 25 » жовтня 1999 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат розісланий « 16 » вересня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук                                                        КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Нітрити потрапляють до організму людини з водою, їжею, повітрям, як лікарські препарати і викликають розвиток метгемоглобінемій, які відносять до типу токсичних інтоксикацій екзогенного походження (Ажипа Я.И. и др., 1990; Середенко М.М., 1987; Иваницкая Н.Ф.; 1975). Оскiльки вся життєдiяльнiсть клiтини пов'язана із затратою енергiї, то недостатнє надходження кисню внаслідок посиленого метгемоглобіноутворення в першу чергу позначається на функцiональному станi мiтохондрiй. Дестабiлiзацiя кальцiєвого гомеостазу внаслiдок пошкодження системи мiтохондрiального транспорту електронiв викликає виснаження внутрiшньоклiтинного запасу АТР (Шостаковская И.В., 1984). Це приводить до зростання навантаження на кисневоутилiзуючу систему.

З другого боку, ланцюговий процес окислення оксигемоглобіну приводить до нагромадження активних кисневих метаболітів - О2-, ОН., НО2., Н2О2 (Шугалей И.В. и др., 1998) та вільних радикалів, утворених при відновленні нітрит-іонів - NO та NO2 (Реутов В.П., 1995). Зміна стаціонарних концентрацій вільних радикалів приводить до інтенсифікації процесів перекисного окислення ліпідів (Бурлакова Е.Б.и др., 1998; Евстигнеева Р.П. и др., 1998). В ноpмальних фізіологічних умовах швидкість пpотікання вільноpадикальних пpоцесів і, відповідно, pівень пpоміжних і кінцевих пpодуктів пеpекисного окислення pегулюється складною багатокомпонентною системою антиоксидантного захисту оpганізму, яка включає в себе як феpменти-антиоксиданти, так і низькомолекуляpні інгібітоpи вільноpадикального окислення (Yu B., 1994). В умовах гіпоксії навантаження на дану систему pізко зpостає, а глибина пошкоджень, викликаних патологічними пpоцесами, буде залежати, в кінцевому pахунку, від функціональної активності окpемих ланок антиоксидантної системи.

Пошкодження, спричинені вільними радикалами, можуть бути усунуті екзогенними сполуками, які захищають організм від наслідків вільнорадикального окислення. Перевага надається природним антиоксидантам, оскільки використання синтетичних препаратів лімітується побічними негативними ефектами (Костенко Л.Х., 1990). Вiдома роль гістидинвмісного дипептиду карнозину як мембранопротектора i низькомолекулярного неферментативного антиоксиданта (Болдырев А.А и др., 1992, 1993; Клебанов Г.И. и др., 1998) спонукала дослiдити його вплив на систему утилізації кисню та антиоксидантну систему печінки за умов нiтритної iнтоксикацiї.

Глибоке дослiдження протiкання нiтритної iнтоксикацiї викликане не лише потребою у з'ясуваннi детальних ланок впливу NO2--iонiв на рiзнi метаболiчнi системи, але й пов'язане з необхiднiстю вивчення процесiв перетворення нiтрит-iонiв у циклі окcиду азоту, функцiонування якого позначається на всіх системних рівнях організму. У циклі беруть участь нітрит-іони, гемвмiснi бiлки, зокрема, гемоглобін та окремі низькомолекулярні антиоксиданти (Реутов В.П., 1995), проте на даний час залишається нез’ясованим питання участі у цьому процесі водорозчинного антиоксиданта карнозину. Тому були проведенi дослiдження з метою з’ясування ролі дипептиду у циклi оксиду азоту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дана робота є частиною фундаментальних дослiджень кафедри біохімії та науково-дослiдної лабораторiї молекулярної та радіаційної біохімії Львiвського державного унiверситету iм. Iвана Франка за темами: "Низькомолекулярнi природнi метаболiти в корекцiї гiпоксичних станiв органiзму" (№ держ.реєстрації 0197V018113) та "Дослідження механізму дії карнозину на метаболічні реакції в умовах гіпоксії різної етіології" (№ держ. реєстрації 0195V026232).

Мета та завдання дослідження.

Метою даної роботи було вивчення впливу гiстидинвмiсного природного дипептиду карнозину на процеси перекисного окислення лiпiдiв i функцiонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ) печiнки та дослiдження параметрiв дихання i окисного фосфорилювання мiтохондрiй печiнки за умов нiтритної iнтоксикацiї, а також вивчення ролi карнозину у функцiонуваннi циклу оксиду азоту.

1. Дослідження впливу карнозину на процеси перетворення нітрит-іонів за участю гемоглобіну.
2. Дослiдження вмiсту продуктiв перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та активностi ферментiв АОЗ у печiнцi щурiв за умов нiтритної iнтоксикацiї, індукованої введенням нітриту натрію.
3. Вивчення впливу карнозину на протiкання процесiв ПОЛ i функцiонування АОЗ та системи утилiзацiї кисню в печiнцi щурiв за умов нiтритної iнтоксикацiї.
4. Дослідження ролі карнозину у функціонуванні каталази при дії нiтриту натрiю.
5. Дослiдження параметрів дихання та окисного фосфорилювання мiтохондрiй печiнки щурiв при введеннi нiтриту натрiю.

Наукова новизна отриманих результатів.

У представленій роботі вперше показано, що карнозин впливає на процеси утворення нітрозильованих комплексів гемоглобіну, приводячи до змін інтенсивності ЕПР сигналів Hb(FeIII)- та Hb(FeII)-комплексів. Обгрунтована участь дипептиду у функціонуванні циклу оксиду азоту.

Вперше продемонстровано корегуючий вплив карнозину на інтенсивність процесів ПОЛ та функціонування ферментів антиоксидантного захисту організму при розвинутій введенням NaNO2 нітритній інтоксикації. Виявлена неоднозначність впливу карнозину in vitro та in vivo на активність каталази при дії нітриту натрію.

Отримані результати показали, що карнозин інтенсифікує процес дихання у мітохондріях печінки щурів за умов нітритної інтоксикації при використанні α-кетоглутарату як субстрату окислення.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів.

Отримані дані розширюють уявлення про механізм впливу нітриту натрію як екзогенного джерела оксиду азоту на функціонування кисневоутилізуючої та антиоксидантної систем печінки щурів за умов нітритної інтоксикації.

Результати дослідження впливу карнозину in vitro на активність каталази в присутності нітриту натрію дозволяють обгрунтувати антиоксидантну роль карнозину в умовах нітритної інтоксикації.

Дані, що стосуються утворення комплексів гемоглобіну з оксидом азоту, дають змогу обгрунтувати роль карнозину у функціонуванні циклу оксиду азоту в організмі ссавців.

Результати досліджень приводять до принципово нових уявлень щодо регуляції метаболічних порушень, спричинених NaNO2 і створюють теоретичну основу для практичних розробок нових лікарських засобів на основі гістидинвмісного природного дипептиду карнозину для корекції метаболічних порушень, що виникають при гіпоксичних станах організму.

Особистий внесок дисертанта.

У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно проаналізовано значний об’єм вітчизняної та закордонної літератури для планування та коректного виконання наукових експериментів. Визначення активності ферментів антиоксидантного захисту і вмісту продуктів ПОЛ в печінці, а також проведення модельних експериментів, пов’язаних з дослідженням каталітичних та спектральних характеристик препарату каталази гриба Penicillum vitale та дослідження впливу карнозину на фізико-хімічні властивості гемвмісних білків проведені особисто. Дослідження параметрів дихання та окисного фосфорилювання мітохондрій печінки проведено спільно зі співробітниками НДЛ-40 кафедри фізіології людини і тварин Львівського державного університету імені Івана Франка. Реєстрація спектрів ЕПР проведена кандидатом фізичних наук Падляком Б.В. спільно із співробітниками кафедри біофізики Медичної Академії імені Людвіка Ридигієра м. Бидгощ (Польща). Аналiз та обговорення результатiв дослiджень проведено спiльно з науковим керiвником, доцентом Коробовим В.М.

Апробація результатів дисертації.

Результати дисертацiї були представленi на 18-й Конференції з питань магнітного резонансу (м. Познань, Польща, 1999); 2-й Мiжнароднiй Парнасiвськiй конференцiї (м. Гданськ, Польща, 1998); на V Мiжнароднiй конференцiї "Биоантиоксидант" (м. Москва, Росiя), на 2-му Мiжнародному симпозiумi "Биохимические механизмы эндогенной интоксикации" (м. Гродно, Бєларусь, 1997); на VII-му Українському бiохiмiчному з'їздi (м. Київ, Україна, 1997); на V Всеукраїнськiй студентськiй науковiй конференцiї "Охорона навколишнього середовища i рацiональне використання природних ресурсiв (Донецьк, Україна, 1995); на доповiдi-семiнарi "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, Росiя, 1996); на Мiжнародному симпозiумi "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, Бєларусь, 1996); на Мiжнародному симпозiумi "Аминокислоты и их производные" (Гродно, Бєларусь, 1996).

Структура та обсяг дисертації

Дисертація складається з вступу, трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати та їх обговорення), висновків та списку використаних джерел, який містить 233 найменування. Обсяг роботи становить 129 сторінок. Дисертація проілюстрована 15 таблицями та 13 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто основні причини виникнення і розвитку гемічної гіпоксії, індукованої нітритом натрію та описано механізми дії нітриту натрію на гемоглобін. Висвітлено питання протікання вільнорадикальних процесів та стану антиоксидантної системи за умов гіпоксичного стресу, а також впливу активних форм кисню на функціонування дихального ланцюга мітохондрій. Описані будова, поширення, можливі механізми дії природного гістидинвмісного дипептиду карнозину, звернуто увагу на спряженість локалізації та функцій карнозину.

Матеріали і методи досліджень. Об’єктом досліджень була печінка та кров щурів, масою 180-220 г, у яких викликали нітритну інтоксикацію. Її моделювали підшкірним введенням нітриту натрію у дозі 50 мг/кг маси тварини (Иваницкая Н.Ф., 1975). Розвиток нітритної інтоксикації контролювали за зростання вмісту метгемоглобіну у крові досліджуваних тварин, який визначали за допомогою п’ятихвильового методу визначення співвідношення лігандних форм гемоглобіну (Сухомлинов Б.Ф., 1988). Ефект дії карнозину на протікання нітритної інтоксикації досліджували при його пероральному введенні у дозі 70 мг/кг маси одноразово та щоденно протягом 9 днів перед нітритною інтоксикацією. Об'єктами модельних експеpиментів служив розчин кристалiчного препарату каталази, видiленої з гриба Penicillum vitale (Каменський дослідний біохімічний завод).

Дослідження спектральних характеристик гемоглобіну та каталази проводили методом адсорбційної спектроскопії з використанням спектрофотометра «Specord M-40» (Німеччина) та ЕПР-спектроскопії з використанням радiоспектрометра типу RADIOPAN SE/X-2544 (Польща).

У модельних експериментах по інкубації каталази з карнозином в присутності NaNO2 кристалiчний фермент розчиняли в 0.02 М K-Na фосфатному буферi (рН 7.0); оптична густина розчину становила 0.600 при 406 нм. В пробу вносили карнозин i NaNO2 в рiзнiй послiдовностi та iнкубували 10 хв при температурi 37оС (їх концентрацiя в реакцiйному середовищi становила 1.2 мг/мл i 0.37 мг/мл вiдповiдно). Сумiш карнозину i NaNO2 отримували при 10-хвилиннiй iнкубацiї цих сполук в еквiмолярних кiлькостях.

Активнiсть супероксиддисмутази (СОД) визначали за допомогою реакцiї вiдновлення нiтротетразолiю синього до нiтроформазану (Чевари С., 1991), каталази - з використанням реакцiї Н2О2 з молiбдатом амонiю (Королюк М.А., 1988). Вмiст дiєнових кон'югатiв визначали за iнтенсивнiстю поглинання кон'югованих дiєнових структур гiдропероксидiв лiпiдiв в областi 232-234 нм (Гаврилов М.И., 1983), рiвень ТБК-позитивних продуктiв за iнтенсивнiстю забарвлення комплексу МДА з тiобарбiтуровою кислотою (Тимурбулатов Р.А., 1981). Активність каталази в експериментах in vitro проводили, використовуючи спектофотометричний прямий метод розкладу пероксиду водню каталазою (Bergmeyer H.U., 1974). Фільтрати каталази, інкубованої з карнозином та нітритом натрію, отримували центрифугуванням при 7000g протягом 30 хв при температурі 4°С. У фiльтратi визначали концентрацiю гiстидинвмiсних сполук методом Паулi (Кучеренко Н.Е., 1988). Швидкість дихання та окисного фосфорилювання у мітохондріях печінки щурів визначали за допомогою хроноамперометричного методу (Франк Г.М., 1975; Коваленко Е.А., 1975).

Результати та їх обговорення.

1. Вплив карнозину на фiзико-хiмiчнi властивостi гемоглобiну за умов нiтритної iнтоксикацiї. Першою ланкою, яка зазнає пошкоджень при дії нітрит-іонів є гемоглобін. Дія метгемоглобіноутворювача проявляється перш за все в окисленні оксигемоглобiну до метгемоглобiну, що, в першу чергу, вiдображається у змiнах конформацiйного стану цього гемопротеїну. З представлених на рисунку 1.1а електронних спектрiв видно, що одноразове попереднє вживання карнозину при наступному введенні нітриту натрію приводить до зниження інтенсивності поглинання світла при 505 нм та 630 нм порівняно з відповідними ділянками електронних спектрів гемолізатів еритроцитів тварин, яким перед нітритною інтоксикацією не вводили карнозин. Збільшення терміну введення дипептиду до 9 днів викликає зростання інтенсивності поглинання світла у проаналізованих вище ділянках електронного спектру (рис. 1.1б). Виявлений ефект свiдчить про те, що карнозин при нiтритнiй iнтоксикацiї iндукує значнi змiни в електронному спектрі гемоглобіну.

Доступність гемової кишені зовнішнім окисникам (у наших дослідженнях NO2--іонам), в основному, пов’язана із протонуванням дистального гістидину гему гемоглобіну. Як свідчать результати наших експериментів, карнозин може безпосередньо впливати на процес протонування дистального гістидину гемоглобіну. Дипептид може зв’язувати протони (Скулачов В.П., 1992), концентрація яких зростає внаслідок розвитку ацидозу при введенні нітриту натрію (Середенко Н.Н., 1990). Очевидно, внаслідок зв’язування H+-іонів карнозином сповільнюватиметься процес протонування дистального гістидину та знижуватиметься вміст метгемоглобіну у крові досліджуваних тварин, які отримували карнозин перед нітритною інтоксикацією в порівнянні з тваринами, яким

Рис. 1.1. Електронні спектри гемоглобіну гемолізатів еритроцитів інтактних щурів (1); щурів, які отримували карнозин (2); яким за 50 хв до декапітації вводили NaNO2 (3); яким вводили NaNO2 після попереднього введення карнозину (4).

а - одноразове введення карнозину; б - 9-разове введення карнозину.

вводили нітрит натрію без попереднього вживання дипептиду. Однак слід зауважити, що зниження процесу метгемоглобіноутворення спостерігалось при одноразовому вживанні карнозину, тоді як 9-денне введення дипептиду приводило до інтенсифікації процесу окислення оксигемоглобіну при дії нітриту натрію. Очевидно, неоднозначність отриманих результатів можна пояснити не тільки різним терміном введення дипептиду, але й складним до кінця не з’ясованим метаболізмом карнозину в організмі. Виявлений ефект пiдсилення метгемоглобiноутворення при 9-денному введеннi карнозину може реалiзуватись шляхом безпосередньої взаємодiї одного з продуктiв розщеплення карнозину - L-гістидину з гемовою компонентою Hb (Кочетков Н.К., 1985). Гiстидин, що утворюється при розщепленні карнозину, легко проникає через мембрану еритроцита, він може конкурувати за перерозподiл електронiв з дистальним гiстидином гемопротеїну в доступнiй для розчинника областi гему, а це, в свою чергу, приводитиме до деформацiї вихiдної координацiйної сфери гемового залiза і буде проявлятись як посилене метгемоглобiноутворення.

Отримані результати корелюють із даними ЕПР-спектроскопії.

Як видно з представлених на рис. 1.2 спектрів ЕПР у крові інтактних щурів та щурів, яким вводили лише розчин карнозину, ЕПР сигнал був відсутній.

Рис. 1.2. ЕПР спектри крові щурів, зареєстровані при T=77K: інтактних тварин(а); після перорального введення карнозину (доза - 70 мг/кг маси тварини) (б); після введення NaNO2 (доза - 50 мг/кг маси тварини) (в).

Після введення NaNO2 у ЕПР спектрі крові з’являється 2 типи сигналів ЕПР. У низькопольовій області спектру спостерігається сигнал із g=6.00±0.01, характерний для FeIII (6S5/2, 3d5) метгемоглобіну (рис. 1.3а). Широкий сигнал з g=2.030+0.001 у високопольовій частині триплет відповідає комплексам гемоглобіну з окcидом азоту (рис. 1.3а).

При 9-денному введенні карнозину інтенсивність сигналу, що стосується Hb(FeIII), незначно зростала в порівнянні з величиною, яка реєстувалась у ЕПР спектрах крові щурів, яким вводили нітрит натрію без попереднього вживання карнозину (рис. 1.3б). Спостережуваний у високопольовій області ЕПР-сигнал характеризується зростанням iнтенсивностi сигналу нітрозильованих комплексів порівняно із величиною сигналу у крові тварин, яким вводили NaNO2 без попереднього введення дипептиду. Такий тип сигналу вiдповiдає Hb-NO комплексам у R- та Т-станi (рис. 1.3б).

У представленому на рис. 1.3б ЕПР спектрі інтенсивність сигналу, що відповідає високоспіновому залізу метгемоглобіну при одноразовому введенні карнозину перед нітритною інтоксикацією знижується порівняно з величиною інтенсивності сигналу, яка спостерігається при введенні NaNO2 без карнозину (рис. 1.3а). За таких умов спостерігається зменшення інтенсивності сигналу Hb-NO комплексів (рис. 1.3в). Такий тип сигналу вiдповiдає комплексам гемоглобіну з оксидом азоту у Т-станi.

Рис. 1.3. ЕПР спектри крові щурів, зареєстровані при T=77K: після введення NaNO2 (а); після попереднього 9-разового введення карнозину на фоні нітритної інтоксикації (б); після попереднього 1-разового введення карнозину на фоні нітритної інтоксикації (в).

Зміни інтенсивності сигналу ЕПР, який відповідає високоспіновому залізу метгемоглобіну, очевидно, пов’язані із впливом карнозинового гістидину, який містить третинний азот i може дiяти як σ- i π-донор, на окисно-відновний стан гемового заліза. Суттєве зменшення інтенсивності сигналу у низькопольовій області при одноразовому введенні карнозину ми пов’язуємо із впливом карнозину на відновлення Fe3+ до Fe2+. Зауважимо, однак, що 9-разове введення карнозину практично не змінює інтенсивність сигналу високоспінового заліза порівняно з величиною для крові щурів з нітритною інтоксикацією, яким не вводили карнозин. Очевидно, такий термін введення карнозину не достатній для процесу відновлення Fe3+ метгемоглобіну.

Представлені вище дані ЕПР-спектроскопії та результати адсорбційної спектроскопії свідчать про безпосередній вплив дипептиду на молекулу гемоглобіну. Ми припускаємо, що такий вплив може реалізуватися через втручання карнозину у координування зв’язку Fe-NO. В результаті додаткового перерозподілу електронної густини в гемовій кишені гемоглобіну на гістидин карнозину відбувається послаблення зв’язку Fe-NO, а час життя Hb-NO комплексів знижується. Враховуючи встановлений нами факт впливу карнозину на тривалість життя нітрозильних комплексів гемоглобіну, можна пояснити деякі фізіологічні ефекти, які спостерігаються при використанні карнозину для корекції метаболічних порушень, що спостерігаються при гіпоксичних станах. Карнозин проявлятиме регуляторну функцію, впливаючи на утворення короткоживучих Hb-NO комплексів з наступним вивільненням оксиду азоту з цих комплексів, подібно до того, як спостерігається вплив 2,3-бісфосфогліцерату на RТ перехід нітрозильованих комплексів гемоглобіну (Henry A., 1996), регулюючи таким чином концентрацію оксиду азоту в організмі. Досліджувані ефекти карнозину мають важливе значення для з’ясування ролі дипептиду у функціонуванні циклу NO.

3. Перекиснi процеси у тканинi печiнки щурiв за умов нiтритної iнтоксикацiї при попередньому пероральному введеннi карнозину. NO2--iони, окислюючи атом залiза молекули гемоглобiну, позбавляють її здатностi зворотньо зв'язувати кисень, що, в свою чергу, приводить до зниження рО2 i розвитку гiпоксiї в тканинах. При такому впливi використання кисню в клiтинi зсувається в бiк активацiї процесiв ПОЛ. Про це свiдчать наведені у табл. 2.1 данi збiльшення вмiсту ТБК-позитивних продуктiв та проміжних

Табл. 2.1 Активності ферментiв АОС та вмiст продуктiв ПОЛ у печiнцi щурiв при 1- та 9- разовому введеннi карнозину за умов нiтритної iнтоксикацiї (n=8-12)

* - різниця вірогідна порівняно із контролем (інтактні тварини), p<0.05

**- різниця вірогідна порівняно із нітритною інтоксикацією, p<0.05

продуктiв ПОЛ - дiєнових кон'югатiв (ДК) - у гомогенатах печiнки щурiв з розвинутою нiтритною iнтоксикацiєю. Iнтенсивне утворення вiльних радикалiв i метаболiтiв кисню та надлишкове накопичення продуктiв ПОЛ спряжене з iнгiбуванням ферментної системи АОЗ - каталази та супероксиддисмутази (СОД), про що свідчать дані, представлені у табл. 2.1. Враховуючи вiдомi шляхи перетворення NO в органiзмi, спостережуванi нами змiни активностей каталази i СОД можуть визначатися впливом оксиду азоту на активнi центри ферментiв. Зокрема, не виключено, що NO може безпосередньо взаємодiяти iз Сu2+ (Костенко В.О., 1995) в активному центрi СОД. Крім того, зниження активності СОД може бути пов’язане із взаємодією нітрит-іона з міддю фермента, оскільки саме атом міді відповідальний за прояв супероксиддисмутазної активності (Маркосян К.А. и др., 1978, 1981).

Утворення гем-NO комплексiв перешкоджатиме зв'язуванню Н2О2 в активному центрi каталази, а також його розкладу, що проявлятиметься у зниженнi активностi ферменту. Нами встановлено, що введення NaNO2 щурам пiсля одноразового та 9-разового попереднього вживання карнозину приводить до зниження iнтенсивностi протiкання процесiв ПОЛ в гомогенатах печiнки порiвняно iз групою тварин, якi пiддавались лише дiї NaNO2 (табл. 2.1). Виявленi змiни, очевидно, пов'язанi iз здатнiстю карнозину нейтралiзувати утворенi продукти ПОЛ, безпосередньо взаємодiючи з ними. Ми показали, що вживання водного розчину карнозину щурами приводить до підвищення активностi каталази і СОД порiвняно з активностями ферментів при введеннi NaNO2 і наближається до вихідних значень, характерних для інтактних тварин, що пов’язано із здатністю карнозину прямо взаємодіяти з вільними радикалами.

3. Вплив карнозину на спектральні та каталітичні характеристики каталази гриба Penicillum vitale при дії нiтрит-iонів та карнозину. Змiни електронних спектрiв гемоглобiну пiд впливом карнозину свiдчать про широкий спектр дiї дипептиду на гемвмiснi бiлки, що позначається на їх функцiонуваннi. Нами були проведенi дослiдження спектральних та каталiтичних характеристик гемопротеїну каталази, який є одним з найважливiших ферментiв антиоксидантної системи, що зазнає значного впливу пiд дiєю NaNO2.

Як видно з представлених на рисунку 3.1 електронних спектрiв, iнкубацiя каталази з карнозином приводить до змiни форми пiку Соре та появи гіпохромного ефекту у цiй областi спектру в порiвняннi iз спектром каталази. Зниження оптичної густини свiдчить про часткове розгортання бiлкової глобули дослiджуваного фермента по аналогiї з iншими гемвмiсними бiлками (Стародуб Н.Ф. и др., 1992). Виявленi змiни в електронному спектрi вказують на те, що дипептид приводить до перерозподiлу електронної густини в оточеннi гемової компоненти гемопротеїду. Такi змiни, очевидно, можуть бути викликанi можливим впливом карнозинового гістидину на координування дистальним гістидином каталази зв’язку заліза гему фермента з субстратом. Можливість такого зв’язування карнозину з каталазою підтверджується зменшенням його вмісту у фільтрованому зразку, який отримували після інкубації карнозину з каталазою (табл. 3.1). При цьому спостерігається зниження активностi фермента.

Присутнiсть карнозину позначається на каталітичних властивостях каталази (табл. 3.1) при дії нітриту натрію. Нiтрит-iони здатнi безпосередньо зв’язуватись із залізом гему каталази (Ажипа Я.И.,1983), що приводить до значного падіння активності фермента (табл. 3.1). Карнозин, доданий до каталази після інкубації ферменту з NaNO2, практично не перешкоджає зниженню активностi фермента порiвняно iз каталазою, iнкубованою з NaNO2. Нiтрит-iони, зв'язуючись безпосередньо iз залiзом, блокують доступ субстрату (Н2О2) до гему каталази, тоді карнозиновий гiстидин не впливатиме суттєво на перерозподіл електронної густини гемової компоненти ферменту.

Рис.3.1.Електронні спектри каталази гриба Penicillum vitale (1); каталази, інкубованої з карнозином з використанням інкубаційного середовища як контролю (2); з використанням карнозину як контролю (3).

При аналізі даних, що стосуються активностей каталази, які визначались у гомогенатах печінки щурів із розвинутою ніт-ритною інток-сикацією на фоні попереднього введення карнозину і порівнянні їх з активностями фермента, отриманими в мо-дельних експериментах при інкубації каталази з NaNO2 і карнозином, прослідковується неоднозначність змін каталітичних властивостей ензиму в умовах in vitro та in vivo.

Табл. 3.1 Вмiст карнозину (нг/мл проби) та активність каталази (МО/мг білку) у середовищi пiсля iнкубацiї каталази з NaNO2 i карнозином (n=4)

*- рiзниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

Очевидно, це пояснюється неоднаковим механізмом дії карнозину: за умов нітритної інтоксикації дипептид проявляє антиоксидантні функції, безпосередньо взаємодіючи з вільними радикалами, таким чином не відбуватиметься їх надмірне накопичення і фермент не інгібуватиметься вільними радикалами по типу зворотнього зв’язку. В умовах in vitro спостерігатиметься прямий вплив карнозину на каталазу, який пояснюється вище і антиоксидантна здатність дипетиду не проявляється.

4. Дослiдження впливу карнозину на процеси дихання та окисного фосфорилювання мiтохондрiй печiнки щурiв за умов нiтритної iнтоксикацiї. Враховуючи функціональний зв’язок між системою транспорту кисню та його утилізацією, нами були проведені дослідження параметрів дихання та окисного фосфорилювання при попередньому введенні карнозину у мітохондріях печінки - органу, який вiдповiдає за детоксикацiю NaNO2 в умовах нiтритної iнтоксикацiї.

Як видно з представлених у таблиці 4.1 результатів, введення нітриту натрію приводить до зростання швидкостi дихання, стимульованого АDP (V3) при окисленні сукцинату, при цьому швидкість контрольованого після

Табл. 4.1 Вплив карнозину на окислення сукцинату (0.5 мМ) та α-кетоглутарату (1.0 мМ) в мiтохондрiях печiнки щурiв за умов нiтритної iнтоксикацiї при 1- та 9-разовому пероральному введеннi карнозину.(n=5-10)

* - різниця вірогідна порівняно з контролем (iнтактнi тварини), p<0.05

**- різниця вірогідна порівняно із нітритною інтоксикацією, р<0.05

додавання ADP дихання (V4) практично не змінюється (табл. 4.1). Зростання швидкості стимульованого ADP дихання спостерігається і при окисленні α-кетоглутарату (табл. 4.1). Такі зміни показників дихання можна пояснити, виходячи з теорії адаптаційного синдрому, як неспецифічну реакцію організму, яка проявляється при введенні NaNO2. При цьому більш потужним енергетичним субстратом виявляється сукцинат. Як видно з даних, представлених у таблиці 4.2, спостерігається зростання величини ADP/O при окисленні доданого до мітохондрій сукцинату за умов нітритної інтоксикації. При цьому знижується час фосфорилювання (табл.4.2). Отримані дані свідчать про економне використання кисню за рахунок підвищення ефективності окисного фосфорилювання та посилене спряження дихання і синтезу ATP.

Табл. 4.2 Вплив карнозину на показники фосфорилювання ADP у мiтохондрiях печiнки щурiв при 1-та 9-разовому введеннi карнозину за умов нiтритної iнтоксикацiї при окисленнi сукцинату (0.5мМ) та α-кетоглутарату (1.0мМ) (n=5-10)

* - різниця вірогідна порівняно з контролем (iнтактнi тварини), p<0.05;

**- різниця вірогідна порівняно із нітритною інтоксикацією, p<0.05.

Застосування сполук-коректорiв порушень енергетичного обмiну сприяє пiдвищенню потужностi функцiонування дихального ланцюга та iнтенсивностi енергетичного обмiну, посилюючи резистентнiсть органiзму до дiї несприятливого фактора. Причому доза i тривалiсть дiї сполуки-коректора може суттєво позначатись на метаболiчних реакцiях у вiдповiдь органiзму на вплив гiпоксичного чинника. Нами дослiджувався вплив гiстидинвмiсного дипептиду карнозину на процеси дихання та ОФ при 1- та 9-разовому пероральному введеннi карнозину у дозi 70 мг/кг маси при нiтритнiй iнтоксикацiї. Така доза була апробована ранiше i виявляла позитивний ефект на збалансування антиоксидантних та вiльнорадикальних процесiв за умов гiпоксичної гiпоксiї (Стволинский С.Л., 1995).

Як видно з даних, поданих у табл. 4.1, при одноразовому введенні карнозину за умов нітритної інтоксикації швидкість АDР-стимульованого дихання при окисленні сукцинату мітохондріями залишається високою порівняно з контрольною. При такому введенні час фосфорилювання знижений, високою залишається швидкість фосфорилювання порівняно з відповідними величинами у контролі (табл. 4.2). При цьому швидкiсть нестимульованого (V3), контрольованого (V4) та ADP-стимульованого дихання достовірно не відрізнялась від контролю (табл. 4.1). В бiльшiй мiрi вираженим є вплив карнозину на показники дихання при окисленнi NAD-залежного субстрату α-кетоглутарату. При одноразовому та 9-денному введеннях карнозину за умов нiтритної iнтоксикацiї швидкість стимульованого ADP дихання достовірно зростає порівняно з контролем (табл.4.1). При цьому спостерігається зниження часу фосфорилювання та ефективності фосфорилювання при обох типах введення (табл. 4.2).

Отриманi результати корелюють iз даними, приведеними у роботi Коробова В.М. та спiвавторiв (1993), у якiй описано застосування карнозину за умов гiпобаричної гiпоксiї. Показано, що присутнiсть карнозину iнтенсифiкує процеси дихання та окисного фосфорилювання через пiдвищення використання α-кетоглутарату, притiк якого пiдсилюється внаслiдок пiдключення аспартатамiнотрансферазної реакцiї.

ВИСНОВКИ

1. Отримані результати доповнюють і розвивають постульовані в літературі механізми функціонування ферментативної антиоксидантної системи печінки при дії нітриту натрію та формують уявлення про роль гістидинвмісного дипептиду карнозину у запобіганні метаболічних порушень, спричинених NaNO2.
2. Підшкірне введення NaNO2 у дозі 50 мг/кг маси тварини приводить до появи двох типів сигналів ЕПР гемоглобіну в крові щурів: сигналу, що відповідає високоспіновому залізу метгемоглобіну у низькопольовій області спектру та сигналу Hb-NO комплексів у високопольовій ділянці спектру.
3. Виявлено, що одноразове введення карнозину перед нітритною інтоксикацією приводить до зниження інтенсивності ЕПР-сигналів Hb(FeIII)- та Hb(FeII)-комплексів, тоді як дев’ятиразове введення дипептиду збільшує інтенсивність цих сигналів.
4. Введення нітриту натрію індукує перекисне окислення, що супроводжується зниженням активності ферментів антиоксидантної системи - супероксиддисмутази та каталази у печінці щурів.
5. Карнозин за умов нітритної інтоксикації пригнічує процеси перекисного окислення ліпідів та нормалізує активність ферментів антиоксидантного захисту у тканині печінки щурів.
6. Виявлено, що інкубація каталази з карнозином приводить до зниження активності фермента в присутності нітриту натрію за умов in vitro.
7. Спостерігається інтенсифікація процесів дихання та окисного фосфорилювання у мітохондріях печінки щурів за умов нітритної інтоксикації при окисленні сукцинату і α-кетоглутарату.
8. Карнозин при введенні нітриту натрію посилює спряження дихання та окисного фосфорилювання при окисленні в мітохондріях α-кетоглутарату і не впливає на ці процеси при окисленні сукцинату.

Список опублiкованих праць здобувача.

1. Крисько О.М., Кащак Н.І., Федорович А.М., Коробов В.М., Бойко М.М. Вплив карнозину на перетворення нітриту натрію в присутності каталази в умовах in vitro // Укр. біохім. журн.- 1999.-Т. 71, № 1.-С.86-89.
2. Крисько О.М., Климишин Н.І., Коробов В.М., Великий М.М. Дослідження перекисних процесів у тканині печінки щурів за умов нітритної інтоксикації при попередньому введенні карнозину // Експерим. та клін. фізіологія і біохімія.- 1999.-№ 1.-С.23-26.
3. Коробов В.М., Крисько О.М., Бойко М.М., Великий М.М., Федорович А.М. Вплив карнозину на утворення комплексів гемоглобіну з оксидом азоту у крові щурів при нітритній інтоксикації // Наук. записки Тернопільського державного педагогічного університету. Серія: Хімія. - 1999.- Вип. 3.-С.56-60.
4. Крисько О.М. Пpо можливу участь каpнозину в пеpетвоpенні нітpиту натpію в пpисутності дезоксигемоглобіну // Експериментальна та клiнiчна фiзiологiя i бiохiмiя.- 1997.-Т. 2.-С. 227-231.
5. Korobov V., Krys'ko O., Boyko M., Padlyak B., Gutsze A., Gornicki A., Fedorovych A Effect of Carnosine on the Hb-NO-formation Complexes in Blood During Nitrite Intoxication // 18-th Conference of the Modern Magnetic Resonance.-Poznan-Kiekrz (Poland).- 1999.
6. Korobov V., Krys'ko O., Bojko M. Role of carnosine in NO-cycle functioning in animals // 2-Parnas conference.-Gdansk (Poland).- 1998.
7. Коробов В.Н., Крысько О.М., Сибирная Н.А., Климишин Н.И., Мирошниченко Л.В., Хороший П.В., Федорович А.Н. Антиокислительная и эритропоэтинстимулирующая роль карнозина в условиях гипоксического стресса // Труды V Междунар. конференции «Биоантиоксидант».-Москва (Россия).- 1998.-С.142-143.
8. Крысько О.М., Сибирная Н.О., Климишин Н.И., Коробов В.М. Влияние карнозина на эритрон и систему антиоксидантой защиты в условиях гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия // Труды 2-ого белорусско-российского симпозиума "Биохимические механизмы эндогенной интоксикации".-Гродно (Беларусь).- 1997. -С.113.
9. Крисько О.М., Федорович А.М. Вплив NaNO2 i карнозину на електроннi спектри дезоксигемоглобiну здорових донорiв // Праці VII Укр. бiохiм. з'їзду.-Київ (Україна).- 1997.-Ч. 3.-С.126.
10. Koробов В.Н., Крысько О.М., Кащак Н.И., Бойко М.Н., Игнатенко Ю.В. Роль карнозина в превращении нитрита натрия // Труды совещания-семинара заведующих кафедрами биофизики и преподавателей, читающих курс "Биофизика", "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации".-Воронеж (Россия).- 1996 .-С.68-69.
11. Крысько О.М., Бойко М.Н., Кащак Н.И., Дудок К.П., Игнатенко Ю.В., Федорович А.Н., Коробов В.Н. Антиоксидантные свойства карнозина при нитритной интоксикации // Труды Междунар. симпоз. "Кислород и свободные радикалы".-Гродно (Беларусь).- 1996.-С.52-53.
12. Коробов В.Н., Крысько О.М., Кащак Н.И., Бойко М.Н., Игнатенко Ю.В. О возможном участии карнозина в процессах превращения нитрита натрия // Труды Междунар. симпоз. "Aминокислоты и их производные".-Гродно (Беларусь).- 1996.-С.63.
13. Коробов В.Н., Тымочко М.Ф., Крысько О.М., Климишин Н.И., Павлюк Н.В., Кобылинская Л.И. О возможной адаптогенной роли карнозина // Труды Междунар. симпоз. "Aминокислоты и их производные ".-Гродно (Беларусь).- 1996.-С.64.