|
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
КОВАЛЬОВА ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА
УДК: 615.07.014:615.24:615.322:615.451.16:634.511
РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ТА ДОСЛІДЖЕННЯ
ПРОТИВИРАЗКОВОГО ЗАСОБУ – ГУСТОГО
ЕКСТРАКТУ ЛИСТЯ ГОРІХУ ГРЕЦЬКОГО
15.00.01 – технологія ліків та організація фармацевтичної справи
автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
ХАРКІВ - 2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі косметології і аромології Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.
Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор
БАШУРА ОЛЕКСАНДР ГЕННАДІЙОВИЧ,
Національний фармацевтичний університет,
завідувач кафедри косметології і аромології
Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор
СПИРИДОНОВ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ,
Державний науковий центр лікарських засобів
науковий редактор журналу “Фармаком”
кандидат фармацевтичних наук
БОКШАН ЄЛИЗАВЕТА ВАСИЛІВНА
Львівський державний медичний університет
ім. Данила Галицького
доцент кафедри технології ліків з курсом промислової
фармації
Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра технології
ліків та клінічної фармації
Захист відбудеться “ 13 ” грудня 2002 року о 2002 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий “ 9 ” листопада 2002 року.
Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради Малоштан Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема лікування і профілактики гастроентерологіч-них захворювань залишається актуальною, не зважаючи на наявність широкого арсеналу лікарських засобів і методів для її вирішення.
Важливим завданням сучасної вітчизняної фармації в даному напрямку є розширення номенклатури ефективних лікарських препаратів для терапії запальних та виразкових уражень шлунково-кишкового тракту (ШКТ) на основі субстанцій природного походження. Властивості цих препаратів – висока біологічна активність, практична відсутність токсичних властивостей – відіграють вирішальну роль при проведенні комплексної терапії при хронічних формах захворювання, а також на стадіях загострення та під час ремісій.
Перспективним та цінним джерелом біологічно активних речовин для розробки противиразкових препаратів рослинного походження є листя горіху грецького. Це обумовлено його унікальним хімічним складом, багаторічним досвідом його використання в народній медицині, підтверджено рядом досліджень біологічної активності та розробкою лікарських препаратів на його основі, достатньою сировинною базою України.
У зв'язку з цим актуальною є проблема створення, дослідження та стандартизація нового біологічно активного засобу – густого екстракту листя горіху грецького для подальшого його використання у виробництві дозованих лікарських форм.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідницьких робіт Національного фармацевтичного університету (№ держреєстрації 0198U007008) і проблемної комісії "Фармація" МОЗ України.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка та науково-експериментальне обгрунтування технології густого екстракту листя горіху грецького, а також його вивчення та розробка методів стандартизації.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
- проаналізувати та узагальнити сучасні дані літератури з питань етіології, патогенезу і медичних аспектів терапії виразкової хвороби;
- провести аналіз номенклатури та механізмів дії сучасних лікарських препаратів для лікування виразкових уражень шлунка та дванадцятипалої кишки, представлених на фармацевтичному ринку України;
- проаналізувати стан фітохімічного виробництва в Україні;
на підставі вивчення технологічних властивостей сировини та вибору оптимальних умов екстрагування науково обгрунтувати оптимальну технологію густого екстракту листя горіху грецького для терапії виразкової хвороби;
- вивчити фізико-хімічні та технологічні властивості екстракту;
- розробити методики якісного і кількісного аналізу запропонованого фітозасобу;
- вивчити стабільність густого екстракту в процесі зберігання;
- розробити нормативно-технічну документацію на засіб для представлення матеріалів до Державного Фармакологічного центру МОЗ України з метою отримання дозволу на проведення клінічних випробувань;
- провести мікробіологічні та фармакологічні дослідження розробленого фітозасобу.
Об'єкт дослідження. Об'єктами дослідження є листя горіху грецького, водно-спиртові витяги та густий екстракт, одержані з указаної сировини.
Предмет дослідження. Предметом дослідження є розробка оптимальної технології лікарського засобу на основі листя горіху грецького у формі густого екстракту для використання в гастроентерології.
Методи дослідження. При вирішенні поставлених у роботі задач були використовували наступні фізико-хімічні, технологічні та біологічні методи:
- спектрофотометричне визначення сполук поліфенольної природи та диференційна спектрофотометрія для визначення флавоноїдів у екстракті;
- окисно-відновне титрування (перманганатометрія) для визначення дубильних речовин (у перерахунку на танін);
- тонкошарова хроматографія, кольорові та осадові реакції для ідентифікації флавоноїдів на рівні індивідуальних сполук;
- гравіметричне визначення масової частки вологи;
- дробна мацерація, реперколяція та вакуум-фільтраційна екстракція для одержання лабораторних зразків лікарського засобу.
Для вивчення антимікробної активності препарату використовували мікробіологічний метод дифузії в агар - метод “колодязів”.
Встановлення токсичності екстракту проводили в дослідженнях з постановкою орієнтованого експерименту визначення середньолетальних доз за методом Штабського Б.М. з співавторами.
Обробку експериментальних даних здійснювали за допомогою методів математичної статистики.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на підставі результатів фізико-хімічних, технологічних, біологічних досліджень теоретично та експериментально обгрунтовано технологію отримання густого екстракту листя горіху грецького (ГЕЛГГ) як фітозасобу для лікування виразкової хвороби та рекомендовано технологічні параметри для підприємства-виробника.
Вивчені фізико-хімічні властивості засобу, стабільність в процесі зберігання та біологічна активність.
Вперше вивчені деякі технологічні параметри листя горіху грецького та вплив на повноту виходу біологічно активних речовин з сировини наступних чинників: ступеня подрібнення сировини, природи екстрагенту, співвідношення сировина-екстрагент, а також умови екстрагування.
Обгрунтовано метод отримання фітозасобу в промислових умовах.
Розроблено методики якісного і кількісного аналізу засобу для створення аналітичної нормативної документації на ГЕЛГГ.
Встановлено спектр фармакологічної активності ГЕЛГГ і доведено його фармакологічну нетоксичність.
Визначено оптимальні умови та термін зберігання густого екстракту, які забезпечують його стабільність протягом двох років.
Практичне значення отриманих результатів. Створено та досліджено новий лікарський фітозасіб “Густий екстракт листя горіху грецького” для лікування запальних уражень шлунково-кишкового тракту.
Розроблено та апробовано технологію густого екстракту листя горіху грецького в умовах промислового виробництва, що викладена в технологічному регламенті, на базі ВАТ “ФФ “Здоров'я” (Акт апробації від 24 грудня 2001 р.).
Розроблено методики контролю якості густого екстракту листя горіху грецького, які відображено в проекті аналітичної нормативної документації.
Проведено доклінічні випробування густого екстракту, які показали, що він є ефективним засобом для лікування виразкової хвороби, колітів, гастритів, ентеритів, може бути рекомендований для медичного застосування.
Матеріали підготовлено для подання до Державного Фармакологічного центру МОЗ України.
Фітозасіб “Густий екстракт листя горіху грецького” планується до промислового випуску на базі ВАТ “ФФ “Здоров'я”.
Фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу кафедри технології ліків та клінічної фармації Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика (акт впровадження від 20 квітня 2002 року) на циклі “Сучасні питання фармації”, кафедри технології ліків з курсом промислової фармації Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (акт впровадження від 17 січня 2002 року), кафедри технології готових лікарських засобів Ташкентського фармацевтичного інституту (акт впровадження від 12 березня 2002 року) з розділу “Екстракційні препарати”.
Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено:
- пошук і аналіз літературних даних з номенклатури та механізмів дії сучасних фітопрепаратів для терапії виразкової хвороби;
- технологічні дослідження властивостей листя горіху грецького та фізико-хімічне вивчення розробленого препарату;
- теоретично обгрунтовано і експериментально підтверджено технологію нового фітозасобу – густого екстракту листя горіху грецького;
- встановлено термін зберігання та розроблено методики контролю якості густого екстракту;
- на підставі проведених експериментальних досліджень створено проект аналітичної нормативної документації та промисловий регламент на виробництво густого екстракту листя горіху грецького;
- узагальнені результати експериментальних досліджень та сформульовані висновки.
В наукових працях, опублікованих із співавторами О.Г.Башурою, Є.В.Гладухом, Н.П.Половко, Л.М.Малоштан, Л.М.Бабковою, І.О.Журавель, дисертантом встановлено оптимальні умови одержання засобу, розроблено методики його стандартизації та вивчено біологічну активність і нешкідливість.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000), науковій конференції молодих вчених і студентів НФАУ (Харків, 2000).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 робіт, у тому числі 3 статті у наукових фахових виданнях України і 2 тези доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), об'єктів і методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Дисертація викладена на 129 сторінках машинопису, містить 10 рисунків, 35 таблиць і 7 додатків. Список використаної літератури включає 169 джерел, в тому числі 74 іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
При розробці технології фітозасобу в формі густого екстракту нами була використана лікарська рослинна сировина – листя горіху грецького (ТУ У 23766377.004-98), а також спирт етиловий 96% (ФС 42У-001-97), спирт етиловий 40% (ФС 42У-135/162-232-97) та вода очищена (ФС 42-2619-89).
При дослідженні густого екстракту листя горіху грецького були застосовані загальноприйняті методи органолептичних, технологічних, фізико-хімічних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень, які дозволили об'єктивно оцінювати якісні характеристики засобу.
Розробка технології та дослідження густого екстракту листя горіху грецького
При розробці технології фітозасобу завданням наших досліджень стало визначення таких умов процесу екстрагування даного виду сировини, які б забезпечували одночасно оптимальний вихід екстрактивних та діючих речовин.
Вивчення процесу екстрагування ми почали з дослідження певних технологічних параметрів сировини, які лежать в основі розробки раціональної технології більшості методів екстракції рослинної сировини. Для одержання об'єктивних і відтворюваних результатів при вивченні екстракційного процесу усі серії досліджень проводились на сировині одного характеру подрібнення. Такими параметрами стали: вологість (4,876±0,022 %), вміст загальної золи (11,75±0,35%) і золи, нерозчинної у соляній кислоті (1,78±0,17%).
Визначення екстрактивних речовин в перерахунку на абсолютно сухе листя горіху грецького проводили з використанням наступних екстрагентів: води, спирту етилового, н-бутанолу, хлороформу і етилацетату. Результати дослідження наведені в табл. 1.
Таблиця 1
Вміст екстрактивних речовин в листі горіха грецького (в % на абс. суху вагу)
Екстрагент Екстрактивні речовини, % Метрологічні характеристики
Вода н-бутанол Хлороформ Спирт ет. 40% Спирт ет. 96% Етилацетат 17,90±0,35 12,53±0,82 13,16±1,13 31,02±1,24 14,92±0,14 23,45±0,06 Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% Р=95% S =0,1276 S =0,2955 S =0,4080 S =0,4461 S =0,3452 S =0,0236 Е відн=1,98% Е відн=2,53% Е відн=2,62% Е відн=3,44% Е відн=2,19% Е відн=1,76%
З даних, наведених в таблиці 1 видно, що найбільшу кількість екстрактивних речовин 31,02±1,24% вилучає 40% етиловий спирт, а найменшу 12,53±0,82% вилучає н-бутанол. Водою вилучається лише 17,9±0,35% екстрактивних речовин, хоча вода є більш полярним екстрагентом з використаних для визначення.
Повнота вилучення діючих речовин є одним з найважливіших показників рівня технології лікарського препарату і залежить від багатьох чинників, у тому числі і від ступеня подрібнення сировини. У зв'язку з цим нами був проведений ряд дослідів, спрямованих на вивчення впливу ступеня подрібнення листя горіху грецького на вихід екстрактивних та діючих речовин. Для цього попередньо було здійснено приготування методом дробної мацерації експериментальних зразків густого екстракту листя горіху грецького, для якого використали сировину з різним ступенем подрібнення.
Екстрагування усіх серій лабораторних зразків проводилося за однакових умов: співвідношення сировина-екстрагент (1:10), в якості екстрагенту був використаний спирт 40%. Результати досліджень, що представлені у табл.2, свідчать про незначний вплив ступеня подрібнення на вихід екстрактивних та діючих речовин. Так, розбіжність у зразках ГЕЛГГ при виході екстрактивних речовин складає 0,07%, дубильних речовин – 0,18%, флавоноїдів – 0,22%. До того ж, висушене листя горіху грецького досить крихке, легко довільно подрібнюється при зберіганні та завантаженні до екстрактора і не потребує спеціальних засобів для подрібнення.
Таблиця 2
Вихід екстрактивних, дубильних речовин та суми флавоноїдів в залежності від ступеня подрібнення сировини
Діаметр частин, мм Екстрактивні речовини в перерахунку на суху сировину, % Вміст в ГЕЛГГ
Дубильні речовини, % Флавоноїди, %
Не подрібнена сировина 20,40±0,02 8,41±0,02 4,73±0,01
1-1.5 20,49±0,02 8,52±0,01 4,73±0,02
5-7 20,48±0,02 8,48±0,01 4,51±0,02
10 20,45±0,01 8,34±0,03 4,64±0,02
Керуючись даними проведених досліджень, доцільним вважаємо рекомендувати для виробництва ГЕЛГГ використання неподрібненої сировини. Даний факт дозволяє значно знизити витрати на процес промислового виробництва густого екстракту з листя горіха грецького шляхом зменшення витрат електроенергії на подрібнення, виключення з нього обладнання для подрібнення сировини і скорочення часу технологічного процесу.
Таким чином, в подальшому використовували неподрібнену сировину.
З метою вибору оптимального екстрагента в технології густого екстракту листя горіха грецького нами було розглянуто ряд розчинників. Оскільки комплекс діючих речовин листя горіху грецького представлений в основному дубильними речовинами і флавоноїдами, необхідно було вибрати розчинник, який би однаково повно вилучав з сировини обидві групи речовин і був придатний для виготовлення густого екстракту. Приймаючи до уваги дані чинники як критерії вибору розчинника та екстрагента діючих речовин з листя горіху грецького, ми зупинилися на ацетоні, спирті етиловому та етилацетаті. Під час вибору концентрації етанолу ми керувалися дослідженнями по вибору оптимального екстрагента для листя горіху грецького при створенні настойки 1:5, проведені раніше Кісельовою Н.П., які вказують на етанол 40%-ний.
Екстрагування листя горіху грецького різними розчинниками проводили за однакових умов (листя горіху грецького неподрібнене, вміст вологи не більше 5,0%, співвідношення сировина-екстрагент 1:10) при періодичному перемішуванні, переслідуючи мету покращання умов вилучення екстрактивних речовин. У одержаних різними екстрагентами екстрактах були визначені: масова частка екстрактивних речовин, дубильних речовин у перерахунку на танін та суми флавоноїдів у перерахунку на гіперозид. Результати наведені у табл. 3.
Таблиця 3
Порівняльна характеристика виходу екстрактивних, дубильних речовин та флавоноїдів (%) у густому екстракті листя горіху грецького, одержаному при екстрагуванні різними розчинниками
Розчинник Вихід, %
Екстрактивні речовини Дубильні речовини Флавоноїди
Ацетон 14,25±0,02 4,10±0,02 2,59±0,02
Етилацетат 18,45±0,02 2,92±0,05 3,57±0,02
Спирт етиловий 40% 20,36±0,03 8,41±0,03 4,72±0,02
Одержані експериментальні дані свідчать, що за здатністю екстрагувати комплекс біологічно активних речовин з листя горіху грецького значну перевагу має спирт етиловий 40%, який забезпечує максимальний вихід вказаних сполук.
Вибір даного екстрагенту обумовлений також його загальною технологічністю (високою змочуючою здатністю, яка забезпечує добре проникнення через пори сировини, невисокою температурою кипіння, леткістю, що суттєво при виробництві густого екстракту та легкою можливістю регенерації), здатністю перешкоджати розвиткові у вилученні мікрофлори та порівняною дешевизною і доступністю.
Дослідження впливу співвідношення сировина-екстрагент на повноту вивільнення екстрактивних та діючих речовин важливо і є одним з критеріїв оптимізації виробничого процесу. Для вирішення даного завдання за однакових умов було отримано ряд експериментальних зразків густого екстракту листя горіху грецького з різним співвідношенням сировина-екстрагент. В отриманих зразках густого екстракту визначали масову частку екстрактивних і дубильних речовин в перерахунку на танін та суму флавоноїдів у перерахунку на гіперозид. Результати визначень представлені в табл. 4.
Таблиця 4
Вихід екстрактивних та діючих речовин ГЕЛГГ в залежності
від співвідношення сировина-екстрагент
Показники Співвідношення сировина: екстрагент
1:5 1:7,5 1:10 1:12,5 1:15
Екстрактивні речовини, % 18,08±0,02 19,08±0,02 20,40±0,02 20,59±0,02 20,62±0,02
Дубильні речовини, % 7,86±0,02 8,04±0,02 8,41±0,02 8,42±0,01 8,43±0,02
Флавоноїди, % 4,14±0,02 4,43±0,02 4,73±0.01 4,75±0,01 4,76±0,03
Дані таблиці свідчать, що при отриманні ГЕЛГГ зростання вмісту екстрактивних, дубильних речовин та суми флавоноїдів спостерігається при збільшенні кількості екстрагенту. Проте з підвищенням масової частки екстрагенту у співвідношеннях вище 10 (1:12,5; 1:15) їх вихід збільшується незначно (екстрактивних речовин – на 0,22%, дубильних речовин – на 0,02% і флавоноїдів – на 0,03%), тому ми вважаємо економічно недоцільним проводити процес екстрагування з використанням таких пропорцій. Навпаки, при зменшенні частки екстрагента (співвідношення 1:7,5, 1:5) неможливо досягти повноти вилучення цільових сполук, що також вказує на недоцільність проведення екстракції з використанням вказаних співвідношень.
Таким чином, для промислового виробництва ГЕЛГГ можна рекомендувати співвідношення сировина-екстрагент 1:10.
Найважливішою умовою ефективності процесу екстрагування з рослинного матеріалу є його тривалість. Тому актуальним стало вивчення динаміки вилучення діючих речовин з листя горіху грецького в кожній зі стадій процесу екстракції з метою виявлення оптимального балансу часу. Для цього була проведена серія експериментів, в ході яких оптимальний час екстрагування визначали з інтервалом від 12 годин до 7 діб з інтервалом 24 години. Після екстрагування через 12, а далі через кожних 24 години в одержаних рідких екстрактах визначали вихід екстрактивних речовин, вміст дубильних речовин та суми флавоноїдів. Результати досліджень представлені на рис. 1 і свідчать, що максимум виходу екстрактивних речовин забезпечує настоювання сировини протягом 72 та більше годин. Причому екстрагування, що триває 96, 120, 144 та 168 годин, збільшує вихід екстрактивних речовин незначно порівняно з 72 годинами, що вказує на недоцільність подальшого процесу настоювання.
| 
