|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
БАРДАХІВСЬКА Квітослава Ігорівна
УДК 615.37:615.246.2:616-097
РОЗРОБКА ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ВУГЛЕЦЕВИХ ДНК-ВМІСНИХ ІМУНОСОРБЕНТІВ З ПІДВИЩЕНОЮ ПОТУЖНІСТЮ
03.00.09 – Імунологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є.Кавецького НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Ніколаєв Володимир Григорович,
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є.Кавецького НАН України, завідувач відділом фізико-
хімічних механізмів сорбційної детоксикації
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Холодна Лідія Степанівна,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
професор кафедри мікробіології та загальної імунології
біологічного факультету
доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН
України Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут
фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України,
завідувач лабораторії імунології
Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ
України, м.Київ
Захист дисертації відбудеться „24” січня 2006 р. о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, за адресою:
03127, м.Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд_____
Поштова адреса: 01033, м.Київ, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий „19” грудня 2005 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
к.б.н., доцент _______________Молчанець О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За останні десятиріччя помітно зросла кількість аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом: системного червоного вовчака (СЧВ), ревматоїдного артриту, псоріазу та псоріатичних артропатій, синдрому Шегрена, аутоімунних гепатитів та інших, які залишаються однією із найбільш складних проблем клінічної імунології (Дранник Г.Н., 2003; Фаворова О.О., 1998; Jacobson D.L. et al., 1997; Sinha A.A. et al., 1990).
Використання біоспецифічних сорбентів стає все більш розповсюдженим методом у комплексному лікуванні цих захворювань як у зв’язку з високою ефективністю, так і безпечністю їх застосування (Bosch T., 2003; Braun N., 2000; Gao C.L. et al., 1995; Howe R.B. et al., 1994; Julius U. et al., 1997; Levy J. et al., 2003; Nakaji S., 2001; Snyder H.W.Jr. et al., 1989). Синтезована велика кількість імуносорбентів, які здатні вилучати із крові конкретні білки, пептиди, ліпіди та їх похідні ( Nakaji S., 2001).
Окрему групу біоспецифічних селективних імуносорбентів складають ДНК-вмісні сорбенти, які вибірково вилучають з крові анти-ДНК антитіла, антитіла проти кардіоліпіну, циркулюючі імунні комплекси (ЦІК) при станах, пов’язаних з гіперпродукцією та нагромадженням цих речовин ( Амосова Е.Н. и др., 1997; Захараш М.П. и др., 1998; Li G. et al., 2002; Terman D.S. et al., 1977; Yang Y. et al., 1988). Крім цього, доведено, що вилучення антитіл із циркуляції не посилює їх синтез (Goldammer A. et al., 2002). На відміну від існуючих імуносорбентів, де для вилучення із плазми крові антитіл, компонентів комплементу, імунних комплексів тощо використовуються лише властивості іммобілізованого ліганду, синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти з підвищеною потужністю поєднують властивості вуглецевих матриць та ДНК. Така комбінація дозволяє використовувати їх для вилучення з плазми крові хворих не тільки анти-ДНК антитіл, а і білок-зв’язаних токсинів, речовин „середньої” молекулярної маси, прозапальних цитокінів.
Актуальним є також пошук методів поглиблення очистки плазми крові від анти-ДНК антитіл різної специфічності за рахунок розщеплення відповідних імунних комплексів.
Все це разом дасть змогу створити нову перспективну систему для екстракорпоральної терапії як аутоімунних захворювань, так і синдрому системної запальної реакції та інших станів, пов’язаних з гіперпродукцією прозапальних цитокінів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені дослідження є фрагментом науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України за темами: “Теоретичні аспекти вилучення білок-зв’язаних та ДНК-тропних речовин з плазми крові пацієнтів з печінковою недостатністю та деякими імунозалежними захворюваннями” (державна реєстрація №0100U000698, строки виконання 2000-2002 рр.) і “Розробка та експериментальна оцінка нових гемо-, плазмоімуносорбентів на основі суперактивних вуглецевих матриць” (державна реєстрація №0103U000789, строки виконання 2003-2005 рр.).
Мета і завдання досліджень. Мета роботи: синтез нового покоління ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих та високопористих гранульованих вуглецевих матриць та оцінка їх специфічних та неспецифічних сорбційних властивостей.
Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні завдання:
Синтезувати і оцінити специфічні та неспецифічні сорбційні властивості ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих і високоактивних гранульованих вуглецевих матриць.
Визначити концентрації антитіл проти нативної ДНК, денатурованої ДНК та ДНК-протеїнових комплексів, використовуючи метод твердофазного неконкурентного імуноферментного аналізу, в сироватках крові здорових донорів і хворих на деякі аутоімунні захворювання.
Дослідити вплив дилюції на ступінь адсорбції анти-ДНК антитіл.
Визначити властивості синтезованого високоактивного гранульованого імуносорбенту щодо вилучення прозапальних цитокінів.
Об’єкт дослідження: синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти на основі високодисперсних, волокнистих та високопористих гранульованих вуглецевих матриць, сироватка та плазма крові хворих та здорових донорів, модельні білок-вмісні суміші.
Предмет дослідження: специфічні та неспецифічні сорбційні властивості синтезованих ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю.
Методи досліджень. Імунологічні – для визначення рівнів анти-ДНК антитіл різної специфічності та прозапальних цитокінів методом твердофазного імуно-ферментного аналізу. Спектрофотометричні методи використовувалися для визначення неспецифічних сорбційних властивостей непокритих та покритих ДНК сорбентів та циркулюючих імунних комплексів в сироватці крові. Достовірність отриманих результатів досліджувалася статистичними методами з використанням t-критерію Стьюдента.
Наукова новизна одержаних результатів. Синтезоване нове покоління ДНК-вмісних вуглецевих сорбентів з підвищеною потужністю на основі високодисперсних, волокнистих і високопористих гранульованих вуглецевих матриць. Проведено вивчення властивостей одержаних сорбентів щодо вилучення анти-ДНК антитіл різної специфічності, білок-зв’язаних метаболітів, речовин “середньої” молекулярної маси, а також прозапальних цитокінів. Встановлений нелінійний характер відповіді концентрацій анти-ДНК антитіл на послідовні розведення сироваток або плазми крові хворих. Визначений вплив дилюції на ступінь адсорбції анти-ДНК антитіл.
Практичне значення одержаних результатів. Синтезовані ДНК-вмісні сорбенти на основі високодисперсних і високопористих вуглецевих матриць можуть використовуватися для лікування цілої ланки аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом. Комбінація ДНК-покриття і суперактивних вуглецевих матриць дає можливість ефективно вилучати із плазми крові як білок-зв’язані речовини, так і анти-ДНК антитіла, а також прозапальні цитокіни при станах, пов’язаних із розвитком синдрому системної запальної реакції.
Використання методу регіонарної гемодилюції дозволяє більш глибоко очищати плазму крові хворих від анти-ДНК антитіл за рахунок дисоціації відповідних імунних комплексів.
Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведений синтез нового покоління ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих і високопористих гранульованих вуглецевих матриць та визначені їх специфічні та неспецифічні сорбційні властивості, використовуючи спектрофотометричні та імунологічні методи досліджень. Самостійно досліджені рівні анти-ДНК антитіл у сироватці та плазмі крові здорових донорів та хворих. Проведена статистична обробка, узагальнення результатів досліджень, формулювання основних положень та висновків роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на 6-му Національному конгресі “Человек и лекарство”, Москва, 1999; на Міжнародному семінарі “Ендоекологія 2000”, Київ, 2000; на науково-практичній конференції “Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти”, Київ, 2003 та на двох міжнародних конгресах – 13-му Всесвітньому Конгресі Міжнародного товариства з штучних органів, Осака, Японія, 2001 і 9-му Конгресі Всесвітньої Асоціації з аферезу, Париж, Франція, 2002.
За матеріалами роботи була проведена доповідь на науковому семінарі у відділенні фармації та біомолекулярних наук в Університеті Брайтона, м. Брайтон, Великобританія, 2002.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, із них 6 статей та 8 тез доповідей.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 128 сторінках друкованого тексту та складається з вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та додатку А. Робота ілюстрована 23 таблицями і 18 рисунками. Список використаних джерел містить 261 найменувань: 39-кирилицею і 222 - латиницею.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Розділ дисертації, в якому наведено огляд літератури, складається із 5 основних підрозділів, у яких на підставі перегляду робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлені сучасні відомості про значення анти-ДНК антитіл та прозапальних цитокінів при аутоімунних захворюваннях та станах, пов’язаних із розвитком синдрому системної запальної реакції. Оглянуто використання неспецифічних та біоспецифічних, зокрема, ДНК-вмісних сорбентів, для екстракорпоральної терапії аутоімунних захворювань. Показано значення імуносорбції як самостійного методу, так і методу в комплексному лікуванні аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Характеристики матеріалів, що використовувалися для синтезу ДНК-вмісних імуносорбентів.
Для іммобілізації ДНК використовувалися високодисперсні, волокнисті та високопористі гранульовані вуглецеві адсорбенти.
Високодисперсний вуглецевий сорбент марки Norit A Supra являв собою порошок чорного кольору з розміром частинок 10-25 мкм і насипною масою 0,295 г/см3.
Волокнисті вуглецеві сорбенти марки АУВМ використовувалися 2 типів: 1 – мікроволокна з розміром 8x7x50 мкм і насипною масою 0,223 г/см3 та 2 – волокна довжиною 4-7 мм і насипною масою 0,07-0,09 г/см3.
Високопористі вуглецеві гранульовані сорбенти марки ГСГД мали насипну масу від 0,06 до 0,19 г/см3.
Для порівняння сорбційних властивостей застосовувалися також сорбенти марки СКН з насипною масою 0,4 г/см3 та Adsorba® (“Gambra Medical”, Швеція) з насипною масою 0,51 г/см3.
Для іммобілізації використовувалася нативна ДНК з тимусу телят (нДНК) фірми “Sigma” (США) з молекулярною масою 9 млн. Дальтон. Денатуровану ДНК (дДНК) отримували шляхом нагрівання нативної ДНК до 1000 С протягом 30 хвилин в присутності формальдегіду з подальшим її швидким охолодженням на льоду, або використовували дДНК фірми “Sigma” (США). В окремих дослідах для порівняння властивостей ДНК в залежності від джерела їх одержання для іммобілізації застосовувалася ДНК з молочок оселедця (“Sigma”, США).
Оцінка ефективності зв’язування ДНК з вуглецевою матрицею
Ефективність іммобілізаціі ліганду оцінювали за десорбцією ДНК із дослідних зразків у надосадову рідину після їх інкубації з фізіологічним розчином або дистильованою водою при струшуванні протягом 6 годин. Проби, які містили імуносорбенти на основі високодисперсних і волокнистих вуглецевих матриць, центрифугували при 3 - 8 тисяч об./хв. протягом 15-20 хвилин. та пропускали через фільтри Millipore 0,45 (“Millipore Corp.”, США). Вміст ДНК в надосадовій рідині визначали за методом Спіріна А.С. (1958).
Визначення вмісту анти-ДНК антитіл в сироватці та плазмі крові.
Обстежено 163 хворого на аутоімунні захворювання та 14 хворих пострадіаційною нейросоматичною поліпатією віком від 25 до 65 років. Серед хворих на аутоімунні захворювання було: 93 особи з системним червоним вовчаком (СЧВ), 13 – з псоріазом, 30 – з псоріатичною артропатією, 10 – з ревматоїдним артритом, 15 – з хронічним аутоімунним гепатитом. Діагнози хворих визначені на основі комплексу клінічних та лабораторних критеріїв. Контрольна група – аналогічна основним за віком та статтю – становила 22 клінічно здорових донорів.
Рівень антитіл проти нДНК, дДНК та ДНК-протеїнового комплексу (ДНП) в сироватці або плазмі крові хворих та донорів визначали методом твердофазного неконкурентного імуноферментного аналізу (Цебецауер Л., 1984, 1988)
Оцінка неспецифічних та специфічних властивостей синтезованих імуносорбентів
Неспецифічні поглинальні властивості адсорбентів вивчали в експериментах по кінетиці адсорбції маркерних сполук – з буферного розчину креатиніну (113 Да) та водного розчину вітаміну В12 (1355 Да). Початкові концентрації були: для креатиніну – 0,3 мг/мл; для вітаміну В12 – 1 мг/мл. Рівноваги досягали в статичних умовах протягом 1 години, при температурі 25оС та співвідношенні сорбент:розчин = 50 мг : 10 мл. Концентрацію сорбатів в розчині визначали на спектрофотометрі СФ-26 при довжинах хвиль 235 та 296 нм відповідно для креатиніну та вітаміну В12. Об’єм сорбційних пор вугілля визначали ексікаторним методом за бензолом, а питому площу поверхні пор - за методом теплової десорбції азоту (Бакалинская О.Н. и др., 1988).
Кольоровість та мутність суспензій непокритих та покритих ДНК високодисперсних вуглецевих сорбентів визначалася фотометрично порівнянням проб з дистильованою водою. Вимірювали оптичну густину на ФЕК при довжинах хвиль 340 нм та 540 нм відповідно для визначення кольоровості і мутності в кюветах з товщиною шару 10мм. Значення кольоровості виражали в градусах, а мутності – в мг/дм3 (ГОСТ 3351-74).
Запиленість непокритих та покритих нативною тимусною ДНК вуглецевих сорбентів на основі Norit A Supra і мікроволокон АУВМ вивчали в стандартних тестах вимірюванням оптичної густини надосадових рідин при довжині хвилі 630 нм на спектрофотометрі СФ-26. В якості контролю використовували дистильовану воду (ТУ 88 УССР 107.002-91).
Концентрацію загального білка у розчинах вимірювали загальноприйнятим біуретовим методом на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 540 нм.
При проведенні мікроколонкових експериментів використовували активну плазму хворих на СЧВ, псоріатичну артропатію та із синдромом Шегрена з підвищеними рівнями анти-ДНК антитіл (анти-нДНК, анти-дДНК, анти-ДНП антитіл), колонки об’ємом 2,5 см3 та перистальтичний багатоканальний насос LKB (Швеція).
Для визначення ЦІК в сироватці крові використовували метод Haskova V.(1977) з поліетиленгліколем (ПЕГ-6000, “Sigma”, США)
Для дослідження використовували прозапальні цитокіни ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б фірми "R&D Systems" (США): rh Il-1в Interleukin 1 beta recombinant human (E.coli derived), rh Il-6 Interleukin 6 recombinant human (E.coli derived), rh TNFб Tumor Necrosis Factor alpha recombinant human (E.coli derived). Суміш цитокінів ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б по 1000 пкг/мл в 3% розчині бичого сироваткового альбуміну ("Sigma", США) приводили в контакт з адсорбентами в мікроколонкових експериментах (об’єм колонок 2,5 см3, швидкість перфузії 0,2 мл/хв., об’єм перфузованого розчину цитокінів по 12,5 мл на колонку). Концентрацію цитокінів ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б до та після перфузії визначали за допомогою стандартних наборів для імуноферментного аналізу ("Diaclone Research", Франція). Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі 450 нм на спектрофотометрі “Multiscan Plus MK 11” (Великобританія).
Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми "Microsoft Excel": розраховували середнє арифметичне (М), середню квадратичну похибку (m). Вірогідність відмінностей визначали за t-критерієм Ст’юдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ
Синтез вуглецевих ДНК-вмісних імуносорбентів
Покращення ефективності сорбційних систем досягається кількома способами, а саме, зменшенням розмірів сорбційних елементів, підвищенням пористості вуглецевої матриці або збільшенням кількості іммобілізованої ДНК. Для синтезу ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю використовували високодисперсні, волокнисті та високопористі гранульовані вуглецеві матриці.
Кількість іммобілізованої ДНК з тимусу теляти становила від 1 до 64 мг на 1 г сорбентів. Слід відзначити, що для синтезу імуносорбентів можливе використання ДНК з інших джерел, зокрема, з молочок оселедця, що може значно зменшити вартість матеріалу при одночасному повному збереженні специфічних сорбційних властивостей синтезованих сорбентів щодо вилучення анти-нДНК, анти-дДНК та анти-ДНП антитіл.
Іммобілізацію ДНК проводили шляхом її адсорбції з водного розчину на поверхню вуглецевих матриць з подальшим висушуванням дослідних зразків у термостаті при 600С протягом 24 годин. Після інкубації отриманих сорбентів з фізіологічним розчином при кімнатній температурі протягом 6 годин спостерігалася десорбція ДНК в надосадову рідину, причому десорбція ДНК зростала із збільшенням адсорбованої на поверхні вуглецевих матриць ДНК. В зв’язку з цим, для отримання імуносорбентів з міцно зв’язаним біолігандом необхідна додаткова фіксація ДНК. З цією метою використовуються різноманітні фізичні або хімічні ініціатори. Застосування методу ультрафіолетового опромінення імуносорбентів в присутності 960 етиловому спирті протягом 30 хвилин давало можливість додатково фіксувати ДНК на поверхні вуглецевих матриць. Відсутність десорбції ДНК в надосадову рідину після інкубації імуносорбентів з фізіологічним розчином свідчила про міцність іммобілізації ДНК.
При електронному скануванні поверхні непокритих та покритих ДНК вуглецевих волокон було показано, з одного боку, гомогенність покриття сорбенту шаром ДНК, а з другого боку, те, що ДНК тільки частково покривала вхід в макропори на поверхні вуглецевого матеріалу (рис.1). Цим, імовірно, і обумовлено збереження неспецифічних властивостей високоактивних вуглецевих матриць поряд із специфічними сорбційними властивостями синтезованих імуносорбентів.
АУВМ+ДНК АУВМ
Рис.1 Зображення поверхні непокритих та покритих ДНК вуглецевих волокон
Вміст анти-ДНК антитіл та ЦІК в сироватці крові хворих та здорових донорів
В патогенезі багатьох аутоімунних захворювань значну роль відіграють антитіла проти ДНК, які вважаються надійними маркерами хвороби і часто виявляються ще до розвитку клінічних проявів імунопатологічного процесу. Було проведено дослідження вмісту анти-ДНК антитіл у сироватках пацієнтів (рис.2). Ступінь розведення сироваток становила 1:100, 1:200, 1:400, оскільки саме рівень виявлених антитіл при розведенні 1:120 і вище прийнято вважати позитивним. При цьому у хворих всіх досліджених груп в тій чи іншій мірі були виявлені підвищені концентрації всіх трьох типів анти-ДНК антитіл.
1 – здорові донори 5 – ревматоїдний артрит
2 – СЧВ 6 – хронічний аутоімунний гепатит
3 – псоріаз (шкірні форми) 7 – пострадіаційна нейросоматична поліпатія
4 – псоріатична артропатія
Рис.2 Вміст анти-ДНК антитіл в сироватці крові
Крім цього, при послідовному розведенні сироваток крові хворих в 100, 200 та 400 разів в усіх випадках спостерігався нелінійний характер відповіді концентрацій анти-ДНК антитіл, тобто, рівень цих концентрацій знижувався в меншому ступені, ніж цього можна було чекати, виходячи з пропорційної моделі дилюції. В той же час, в контрольній групі здорових донорів спостерігалася чітка лінійна залежність концентрацій анти-ДНК антитіл від ступеню розведення сироваток. Отримані дані вказують на те, що певна частина анти-ДНК антитіл в сироватці хворих, можливо, перебуває не у вільній розчинній формі, а у складі відповідних імунних комплексів, які здатні досить легко дисоціювати.
В сироватках хворих на системний червоний вовчак та псоріатичну артропатію визначалися концентрації циркулюючих імунних комплексів шляхом селективної преципітації імунних комплексів в ПЕГ-6000 (рис.3).
| 
