|
КОММЕДБІОПРОМ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ
На правах рукопису
Для службового користування
Примірник №
ШОВКОВИЙ Андрій Віталійович
УДК 615.2 : 547.466 ].07
РОЗРОБКА МЕТОДІВ АНАЛІЗУ НОВИХ БІОЛОГІЧНО
АКТИВНИХ СПОЛУК У РЯДУ ПОХІДНИХ АМІНОКИСЛОТ
ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦІЇ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ НА ЇХ
ОСНОВІ
15.00.03 – стандартизація та організація виробництва лікарських засобів
Автореферат
диссертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії фізико-хімічних процесів Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків), Коммедбіопром, Національна академія наук України.
Науковий керівник: доктор хімічних наук
Ковальов Іван Петрович,
Державний науковий центр лікарських засобів, завідувач
лабораторії фізико-хімічних процесів.
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Болотов Валерій Василійович,
Українська фармацевтична академія,
Завідувач кафедри аналітичної хімії
Доктор фармацевтичних наук, професор,
Петюнін Генадій Павлович,
Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач
кафедри клінічної біохімії та судебно-медичної токсикології
Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика,
кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії, Міністерство охо-
рони здоров`я України, м. Київ.
Захист відбудеться “ 29 ” жовтня 1999 р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.817.01 при Державному науковому центрі лікарських засобів (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ДНЦЛЗ (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
Автореферат розісланий “ 28 ” вересня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор фармацевтичних наук, професор М. О. Казарінов
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність дослідження. В останні роки велика увага приділяється створенню нових лікарських засобів на основі амінокислот, які поєднують у собі як пластичні, так і регуляторні функціі і можуть проявляти різноманітну лікувальну дію на людський організм, а при тривалому застосуванні бути цінними профілактичними засобами.
Аналіз стану виробництва амінокислотних препаратів у країнах із розвинутою медичною промисловістю показує, що їх випуск із року в рік неухильно зростає. Так, за прогнозами на 1999 р, обсяг світового продажу амінокислотних препаратів повинен становити 5 – 6 млрд. дол. США.
В Україні виробництво препаратів на основі амінокислот, за виключенням таблеток “Аспаркам”, було практично відсутнім. Тому, починаючи з другої половини 80-х років, в ДНЦЛЗ розроблюються препарати як на основі індивідуальних амінокислот, так і препарати, діючими речовинами яких є нові, оригінальні субстанції. Це водорозчинні солі амінокислот і біологічно активних сполук (L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів). Як показали фармакологічні і клінічні дослідження одержаних сполук, вони є не тільки водорозчинними аналогами природніх речовин (байкалін, есцин), але і мають значно ширший спектр біологічної дії, у порівнянні з вихідними продуктами.
У зв`язку з цим виникла необхідність розробки науково-технічної документації (НТД) на нові субстанції і препарати на їх основі, що неможливо зробити без доказу будови сполук, а також без застосування сучасних методів аналізу якості як субстанцій, так і готових лікарських форм.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відпо-відності з планом науково-дослідних робіт Державного наукового центру лікарських засобів (№ держ. реєстрації 0288.0069232; 0189.0061283; 0193U041088).
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – доказ будови нових біологічно активних сполук в ряду похідних амінокислот, розробка методик аналізу препаратів як на основі нових сполук, так і препаратів на основі суміші індивідуальних амінокислот і комбінованих амі-нокислотних препаратів, а також вивчення метрологічних характеристик розроблених ме-тодик.
У зв`язку з цим нами були поставлені такі завдання дослідження:
- вивчення фізико-хімічних характеристик та біологічної дії амінокислот, флаво-ноїдів та тритерпенового глікозиду – есцину;
- доказ будови нових водорозчинних солей: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів з використанням ІЧ-,УФ-спектроскопії, спектроскопії ПМР та ВЕРХ;
- вибір ефективних методів аналізу препаратів, які створені на основі нових суб-станцій;
- розробка методик аналізу амінокислот і препаратів, діючими речовинами яких є су-міші індивідуальних амінокислот;
- вибір умов проведення аналізу препаратів, які є сумішшю амінокислот і інших дію-чих речовин;
- вивчення метрологічних характеристик розроблених методик.
Наукова новизна одержаних результатів.
- Доведена будова нових біологічно активних сполук: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів;
- вибрані ефективні методи аналізу препаратів на основі вищенаведених субстанцій;
- вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчена фракція флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської. Вивчена хроматографічна поведінка флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської;
- розроблені методики аналізу індивідуальних амінокислот і препаратів на їх основі. Вивчена хроматографічна поведінка 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот;
- науково обгрунтовані умови контролю препаратів, які містять суміші амінокислот та інших активних речовин;
- вивчені метрологічні характеристики розроблених методик аналізу препаратів.
Практичне значення одержаних результатів.
Одержані 4 нові сполуки: L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів, які завдяки тому, що розчиняються у воді, значно перевищують за своєю біологічною дією байкалін, есцин, суміш флавонових глюкуронідів. На основі цих сполук, а також індивідуальних амінокислот розроблено 12 препаратів та 10 методик контролю якості препаратів, які введені у нормативно-технічну документацію:
ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат
Проект ТФС 42У- L-гістидину байкалінат
ТФС 42У-11/37-160-95 L-лізину есцинат
Проект ТФС 42У- Розчин L-лізину байкалінату 20 % для ін`єкцій
Проект ТФС 42У- Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою
ТФС 42У-11/37-1085-99 Розчин L-лізину есцинату 0,1 % для ін`єкцій
Проект ТФС 42У- Таблетки “СпермАмін”
Проект ТФС 42У- Капсули “Октамін плюс”
Проект ТФС 42У- Поліамін – У
ТФС 42У-15/37-253-96 Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою
Проект ТФС 42У- Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою
Проект ТФС 42У- Таблетки “Факовіт”
Перелічені препарати впровадженні у виробництво на АТ “Фармацевтична фабрика Здоров`я”, АТ “Київмедпрепарат”, ВАТ “Луганський ХФЗ” та АТ “Галичфарм”. Випуск препарату “Поліамін-У” планується на ЗАТ “Біолек”.
Особистий внесок здобувача полягає в отриманні наукових результатів, які викладені у дисертації, плануванні експерименту, апробації розроблених методик контролю якості лікарських засобів та участі у розробці 12 НТД на препарати, одними із основних діючих речовин яких є амінокислоти.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені і обговорені на республіканській науково-практичній конференції “Наукові дослідження і проблеми вироб-ництва лікарських засобів” (Харків,1995), на Всеукраїнській конференції по аналітичній хімії (Ужгород, 1998), на Міжнародній науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття: іновації та традиції” (С.-Петербург, 1999).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт. З них 5 статей у наукових фахових виданнях та 3 тези доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, трьох розділів власних експериментальних досліджень, загальних висновків, списку використаних джерел та додатків. Викладена на 180 сторінках машинопису (149 сторінок основного тексту), містить 38 рисунків, 51 таблицю. Список використаної літератури містить 213 джерел, у тому числі 116 зарубіжних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Доказ будови i складу нових бiологiчно активних сполук.
З метою збiльшення бiодоступностi природних сполук, таких ях байкалiн, есцин, сумiш флавонових глюкуронідiв i розширення спектру iх фармакологiчноi дii, були отриманi такi сполуки: L-лiзину байкалiнат, L- гiстидину байкалiнат i L-лiзину есцинат, сумiш лiзинових солей флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської.
Для доказу будови сполук нами були вивченi ІЧ-, ПМР-, УФ-спектри, хроматографiчна поведiнка цих речовин, а також вихiдних речовин – L-лiзину, L-гiстидину, байкалiну, есцину i сумiші флавонових глюкуронідів.
Характерною особливістю ІЧ-спектрів нових сполук є відсутність смуги поглинання карбоксильної групи глюкуронової кислоти, яка присутня в спектрах байкаліну, есцину та суміші флавонових глюкуронідів при ~ 1740 см-1, а також наявність двух інтенсивних смуг при 1615 та 1410 см-1, які належать асиметричним та симетричним валентним коливанням карбоксилат-іону глюкуронової кислоти. Треба відзначити, що дві останні смуги складні і включають як смуги карбоксилат-іону глюкуронової кислоти, так і карбоксилат-іону амінокислоти, яка створює внутрішню соль.
Те, що до складу речовин входять амінокислоти і біологічно активні сполуки, було доказано також методами ПМР, УФ-спектроскопії та ВЕРХ.
На основi проведених дослiджень було встановлено, що одержанi нами сполуки – солi i мають такi cтруктурні формули:
L-лізину байкалінат
4 - α, ε - дiамiно-капронової кислоти -5,6,7- триоксифлавон-7- 0-β-0– глюкуронiдат
L-гістидину байкалінат
4 - α - амiно - β - iмiдазолiлпропiонової кислоти - 5,6,7 - триоксифлавон - 7 - 0 - β - 0 – глюкуронiдат
L-лізину есцинат
4 - α, ε - дiамiнокапронової кислоти - 28 - (3 - ацетокси - 2 - метилбутират) - есцигенiн, - 4 - 0 - β - 0 - глюкопiронозин) - глюкуронiдат.
Склад i хроматографiчна поведiнка флавонових глюкуронiдiв надземної частини
шоломниці байкальської
Пiд час дослiджень фракцiї надземної частини шолом- ниці байкальської методом ВЕРХ, було встановлено, що до iї складу входять 8 флавонових глюкуронiдiв, п`ять з яких удало- ся iдентифiкувати (рис.1).
Хроматографування проводилось на колонцi, заповненiй сорбентом С 18, з використанням рухомої фази: метанол – кислота оцтова – вода iз градiєнтом метанолу від 30 до 60 % об.
Рис. 1. Хроматограма сумiшi флавонових глюкуронідів.
1–лютеолiн-7-О-β-D-глюкуронiд;
2–скутелярін-7-О-β-D-глюкуронiд;
3–апiгенiн-7-О-β-D-глюкуронiд;
4–байкалеїн-7-О-β-D-глюкуронід;
7–хрiзин-7-О-β-D-глюкуронiд.
При порівнянні часу утримання речовин (табл. 1) встановлено, що iз збiльшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронідiв, їх час утримання зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдрокси-груп менший час утримання ма-ють тi флавонові глюкуроніди, у яких ОН-групи знаходяться у В - колi флавона.
Прикладом цьому можуть бути пари флавонових глюкуронідів: лютеолін-7-О-β-D-глюкуронід / скутелярін-7-О-β-D-глюкуронід и апігенін-7-О-β-D-глюкуронід / байкалеїн-7-О-β-D-глюкуронід.
Таблиця 1.
Порівняльна таблиця будови флавонових глюкуронідів, які входять до складу фракції, отриманої з надземної частини шоломниці байкальської
Подальші дослiдження показали, що головними компонентами суміші є скутелярін-7-О-β-D-глюкуронід, апігенін-7- О-β-D-глюкуронід та хрізин-7-О-β-D-глюкуронід (табл. 2).
Таблиця 2.
Кількісний склад фракції флавонових глюкуронідів, отриманої з надземної
частини шоломниці байкальської
З таблиці видно, що склад окремих компонентiв у сумiшi, до i пiсля одержання солi, залишається практично незмiнним (різниця–2,5%), що не перевищує відносне cтандартне відхилення при кількістному визначенні методом ВЕРХ.
Дослідження складу суміші тритерпенових глікозидів – есцину.
Дослідження есцину 4-х серій, методом ВЕРХ, показали, що до складу речовини входять 14 тритерпенових глікозидів (рис. 2).
Рис. 2. Типова хроматограма речовини есцин
Встановлено, що на поданій хроматограмі β-есцину – основному компоненту речовини есцин, належать піки 5,6,7,8. Належність β-есцину чотирьох піків пояснюється тим, що речовина є сумішшю полігідроксітритерпенових глікозидів, етерифікованих різними карбоновими кислотами.
Аналогічні результати спостерігались і при дослідженні методом ВЕРХ водорозчинної солі есцину– L-лізину есцинату.
Аналіз есцину показав, що склад β-есцину від серії до серії змінюється в незначній мірі: від 76,35% до 79,29% і у середньому складає 77,39%.
На основі відносного стандартного відхилення результатів (ε) проведена більш глибока оцінка коливання складу речовини есцин (табл. 3).
Таблиця 3.
Результати статистичної обробки хроматограм есцину різних серій
| 
