Библиотечный каталог авторефератов Украины

               МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ”Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

УДК 612.46:577.156+615.2'2/.9

                          КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ

РЕГУЛЯТОРНИЙ ПРИРОДНИЙ ПЕПТИДНИЙ  КОМПЛЕКС  НИРОК:

    ОТРИМАННЯ, ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ,   ЗВ'ЯЗОК  З

    ГОЛОВНИМ  КОМПЛЕКСОМ ГІСТОСУМІСНОСТІ,

   ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ ТА РОЗРОБКА  ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ

                                   РЕЧОВИНИ

         Спеціальність - 14.03.08  - імунологія та алергологія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 1999

Дисертація є рукопис.

Робота виконана на базі ЦНДЛ Української медичної стома­тологічної академії, м.Полтава

Науковий консультант:

- доктор медичних наук, професор Дранник Георгій Микола­йович, завідуючий кафедрою клінічної імунології Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Лисяний Микола Іванович, завідувач відділом нейроімунології Інституту нейрохірургії ім. А.П.Ромоданова АМН України;

- доктор медичних наук, професор Мельніков Олег Федосійо­вич, завідувач лабораторією імунології Київського науко­во-дослідного інституту отоларингології ім. А.І.Коломійченко;

- доктор медичних наук, професор Малижев Вадім Олексійо­вич, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів та тканин МОЗ Ук­раїни.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України ім.Кавецького, лабораторія імунології та алергології.

Захист дисертації відбудеться  15 квітня 1999 року о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.04 при Національному медичному університеті імені академіка О.О.Богомольця (252057, м.Київ, Проспект Перемоги,34).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національ­ного медичного університету імені академіка О.О.Богомольця (м.Київ, вул. Зоологічна 1, стоматологічний корпус).

Автореферат розісланий 10 березня   1999 року.

Вчений секретар Спеціалізованої

ради, професор        Черкасов В.Г.

ВСТУП

Актуальность теми.

Прогрес імунології як фундаментальної медико-біологічної науки відмічен суттєвим розвитком знань про роль імунної системи в забезпеченні життєдіяльності організму [Вершигора А.Е., 1989; Бутенко Г.М., 1998; Paul W.E. et al., 1984].

Обмін інформацією між клітинами спеціалізованих тканин та органів та клітинами імунної системи відбувається, по-перше, за рахунок прямого контакту між імуноцитами та клітинами на грунті рецепторної взаємодії, по-друге, шляхом надходження у зовнішньоклітинне середовище внаслідок секреції або руйнації клітин речовин, які змінюють функціональний стан імуноцитів [Акмаев И.Г., 1997; Беклемишев Н.Д., 1998; Paul W.E. et al., 1984].

В основі інформаційних подій, що мають місце при контакті лімфоцитів та антигенпрезентуючих клітин, покладено взаємодію між Т-клітинним рецептором та антигенним пептидом, який презентується молекулами головного комплексу гістосумісності (ГКГС) [Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., 1998].

Те що молекули ГКГС І класу транспортують на клітинну мембрану пептидні фрагменти абсолютно всіх білків, які синте­зуються у клітині, забезпечує імунну систему засобом контролю клітинного вмісту,здійснює маніфестацію нових чужорідних про­дуктів, детекцію білків, які звичайно не експресуються.

Молекули ГКГС ІІ класу разом із зв'язаними пептидами спрямовують CD4-позитивні Т-клітини за двома функціональними шляхами: по-перше, ці клітини "допомагають" іншим антигенспе­цифічним лімфоцитам диференціюватися та активуватися (тобто реалізують хелперну функцію); по-друге, вони атакують чу­жорідний антиген, презентований ГКГС ІІ-позитивними клітинами або прямо, або за допомогою неспецифічних клітин - макрофагів, гранулоцитів (індукторна функція).

Одночасно, функціональний стан імуноцитів регулюється ре­човинами, які надходять з спеціалізованих клітин та органів. Серед цих речовин, що отримали назву ендогенних імуномодуля­торів [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А., 1992] значне місце посідають пептидні та поліпептидні речовини. Се­ред них найбільш вивченими є поліпептидні фактори росту (епідермальний фактор росту, фактор росту тромбоцитів, трансформуючі фактори росту тощо), інтерлейкіни, гормони тімуса, фактори некрозу пухлин, інтерферони [Калюнов В.Н. и соавт., 1998].

Питання взаємовідносин клітин спеціалізованих тканин та органів з імуноцитами (взагалі з імунними органами) набуло відомості та актуальності завдяки роботам А.Г.Бабаєвой зі співавт. (1975, 1985). Був сформований окремий напрямок досліджень - імунологія репаративних процесів. В основі цих дослід­жень було покладено гіпотезу, що певна кількість вільного антигена тканини, що надходить у кров, стимулює продукцію лімфо­цитів, які здатні брати участь в регенераторних процесах тка­нини як за фізіологічних умов, так і під час пошкодження ор­ганів. Такий процес передбачає існування механізму зворотнього зв'язку за фізіологічних умов в організмі під час нормального функціонування органів.

Цей напрямок досліджень набув подальшого розвитка в робо­тах С.І.Рябова з співавт. (1989), які продемонстрували що для нормального відновлення структури та функцій нирок потрібна участь особливої популяції тимоцитів, яка має фермент термінальну дезоксинуклеотіділ трансферазу (ТДТ-позитивні клітини) та гормонів тимуса. Одночасно, результати їх дослідів висунули питання про речовини нирок, які беруть участь в інформуванні імунної системи, зокрема тимоцитів, про зміну морфофункціонального стану нирок.

Таким чином, за даними літератури невідомо про власну біологічну активність пептидів, зв'язаних з молекулами ГКГС, непов'язану з презентацією антигена та значення цих пептидів в патогенезі захворювань. В той же час пептиди, які транспорту­ються молекулами ГКГС на зовнішньоклітинну мембрану, несуть специфічну для кожного вида клітин інформацію про внутріклітинний синтез та процесінг білків. Ці нез'ясовані факти разом з відомостями про тісний зв'язок між системою імунітета та захворюваннями нирок висунули необхідність вив­чення цієї проблеми.

Зв'язок роботи з науковими програмами.

Наведені в роботі результати досліджень є самостійним фрагментом досліджень за темою МОЗ України "Проведення доклінічних іспитів та вивчення основних механізмів дії нових лікарськіх засобів, видобутих з тваринної сировини для лікування аутоімунних, травматичних та онкологічних захворювань організму" (N 0195U026214), "Роль дисбалансу пептидергічної системи регуляції в розвитку типових патологічних процесів та шляхи її відновлення інформаційними молекулами поліпептидної природи" (Шифр теми ФК 91.70) N UA01001570Р, ДКНТ України "Роль дисбалансу систем поліпептид­ної регуляції в розвитку патологічних станів, зв'язаних з дією несприятливих факторів зовнішнього середовища і шляхи їх ко­рекції препаратами поліпептидної природи" N 0193U007913, ініціативної науково-дослідної роботи "Вивчення зв'язку ау­тоімунних захворювань нирок та центральної нервової системи з молекулами головного комплексу гістосумісності першого класу" N держреєстрації 0195U026216.

Мета та задачі дослідження. 

Метою цієї роботи стало визначення імунобіологічних ефектів та зв'язку з молекулами го­ловного комплексу гістосумісності природного пептидного комп­лексу нирок для розробки нової лікарської речовини.

У відповідності з метою роботи були висунуті наступні за­дачі:

1. Розробити спосіб екстракції пептидного комплексу з тканин нирок, охарактеризувати його за фізико-хімічними властивостями.

2. З'ясувати зв'язок пептидного комплексу нирок з молеку­лами ГКГС І та ІІ класів.

3. Вивчити дію пептидного комплексу тканин нирок на по­казники імунітету, неспецифічної резистентності, гемостазу та перекисного окислення ліпідів за фізіологічних умов.

4. Вивчити дію пептидного комплексу тканин нирок в умовах розвитку патологічних станів пов'язаних з аутоімунним пошкод­женням нирок в ізольованому та комбінованому варіантах та за умов алотрансплантації нирок.

5. Виявити специфічні та неспецифічні риси дії пептидного комплексу нирок в порівнянні з пептидним комплексом іншого ор­гану.

6. Визначити можливість зв'язування пептидів нирок з іншими пептид-транспортуючими молекулами.

7. Вивчити загальний план структурної організації пептид­ного комплексу нирок, синтезувати його штучні аналоги та дослідити їх терапевтичний ефект за умов експериментальної ау­тоімунної патології нирок.

Наукова новизна.

Вперше розкрита імунобіологічна активність пептидів головного комплекса гістосумісності, яка відкриває нові шляхи патогенетичної терапії аутоімунних захворювань, дає можливість корегувати процеси регенерації тканин.

Показано, що пептиди головного комплексу гістосумісності мають власну біологічну активність, не обмежену презентацією антигенів. Такий пептид­ний комплекс здатен модулювати активність лімфоцитів перифе­рійної крові (переважно, Т-клітин) та викликати морфо­функціональну перебудову в тимусі. В умовах експериментальної аутоімунної патології нирок пептидний комплекс забезпечував відновлення імунологічної толерантності та морфофункціонально­го стану нирок. Показана участь інтерлейкіна-2 у реалізації ефектів пептидного комплекса.

Вперше вивчено загальний план структурної організації пептидного комплексу нирок, на основі якого синтезовано три штучних пептида-аналога, які мають різного ступеня вираженості терапевтичний ефект за умов експе­риментальної аутоімунної патології нирок.

Практична цінність роботи.

          Винайдений спосіб  екстракції біологічно активних  пептидів  з  тваринної сировини може бути використаний для створення нових лікарських препаратів. Природний пептидний комплекс нирок має виражену терапевтичну активність при експериментальній аутоімунній патології нирок, що відображає перспектив-ність його використання як лікарської речовини.

Розроблено практичний підхід до синтеза пептидів-аналогів природних пептидних сумішей, які зберігають більшість власти­востей сумішей. Синтезовано три пептида, які мають значну те­рапевтичну активність при аутоімунній патології нирок, що мо­жуть розглядатись як потенційні лікарські речовини.

Впровадження наукових розробок.

Частина результатів вико­ристовується у навчальному процесі на кафедрах нормальної фізіології, мікробіології та імунології, загальної фармако­логії Української медичної стоматологічної академії.

Наведені в роботі результати досліджень лягли в основу створення нової пептидної лікарської речовини "Нефролат" за темою МОЗ України "Проведення доклінічних іспитів та вивчення основних механізмів дії нових лікарськіх засобів, видобутих з тваринної сировини для лікування аутоімунних, травматичних та онкологічних захворювань організму" (N 0195U026214).

Запропонований спосіб екстракції пептидного комплексу з тваринних тканин успішно використаний для інших тканин, що да­ло змогу створити нові лікарські речовини "Вермілат" (Патент України N5743), який вже проходить першу фазу клінічних випро­бувань та комплекс пептидів підшлункової залози (Рішення про видачу патенту 94052070 від 23.03.1995).

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових резуль­татів, що виносяться на захист.

Автором дисертації розроблено програму досліджень, особисто виконані усі фізико-хімічні, імунологічні, цитохімічні, біохімічні, гістологічні та ста­тистичні дослідження. Дисертантом проведено самостійно аналіз всього отриманого фактичного матеріала, розроблено основні по­ложення та висновки роботи. Особлива подяка співробітникам Центральної науково-дослідної лабораторії Н.О.Бобровій, О.В.Бобовіч, О.О.Гейко та асистенту кафедри нормальної фізіології Української медичної стоматологічної академії Л.Е.Весніной за технічну допомогу. Синтез пептидів-аналогів виконано доктором S.Stevanovich в лабораторії проф. H.G-.Rammensee (Німецький центр досліджень рака, м.Гейдель­берг) за що приносимо подяку.

Апробація. Головні положення дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на научно-практичної конфе­ренції "Поиск новых лекарственных средств и их использование в клинике" (Чіта, 1990); міжвузівській конференції молодих вче­них "Фізіологія та патологія перекисного окислення ліпідів, гемостаза та імуногенеза" (Полтава, 1990-1997); YІ з"їзді фар­макологів УРСР (Харків, 1990); ХІІІ з'їзді Українського фізіологічного товариства (Харків, 1990); Всесоюзній конфе­ренції молодих вчених 225 років І ММІ (Москва, 1990); науковій конференції молодих вчених і спеціалістів (Донецьк, 1990); Всесоюзній конференції "Физиология и патология гемостаза" (Полтава,1991); YI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992); Міжнародному сімпозіумі "Пептидные биорегуляторы-цито­медины" (Санкт-Петербург, 1992); Міжнародному сімпозіумі "Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе" (Київ, 1993); Республіканській науковій конференції "Актуальні питання екогенетики та імунології" (Полтава, 1994); IY конфе­ренції "Биоантиоксидант"(Москва, 1993); Міжнародному сімпозіумі "Физиология и патология гемостаза" (Сімферополь, 1994); І Національному з'їзді фармакологів України (Полта­ва,1995); І Конгресі федерації Європейського фізіологічного товариства (Маастріх, 1995), на засіданні лабораторії приклад­ної імунології Німецького центру досліджень раку (Гейдель­берг,1994), І Національному конгресі з клінічної імунології та алергології (Алушта, 1998), Симпозіумі з біохімії та молеку­лярної біології (Йена, 1998).

Публікації.

За темою дисертації надруковано 35 робіт.

Обсяг роботи.

           Дисертацію викладено на 258 сторінках друкованого тексту і вона складається з вступу, огляду літерату­ри, глави "Матеріали та методи досліджень", 6 глав власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури та додатку.

          Робота містить 36 таблиць, 21 малюнків і 42 мікрофото. Список літератури містить  125 вітчизняних  робіт і 118 робіт іноземних авторів.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

          Експериментальна частина досліджень виконана на 184 білих щурах лінії Wistar,  12 морських свинках,  52 білих мишах,  30 золотистих хом'яках та 4 кролях.

Лабораторних тварин утримували в умовах віварію на стандартному раціоні харчування у відповідності з "Санитар­ными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".

Частина спостережень була проведена на крові 20 донорів і крові 15 хворих на хронічний гломерулонефрит на базі відділен­ня нефрології Полтавської обласної клінічної лікарні.

Об'єктами досліджень були кров, плазма, сироватка крові експериментальних тварин,а також кров і сеча здорових донорів та хворих.

Для вирішення поставлених задач були відтворені наступні експериментальні моделі.

          Гострий стресс        відтворювали        у        вигляді   гострого емо-ційно-больового стресу очікування за методикою  [Disiderato O., McKinnon J.R.,1974]. Суть методики полягає в поданні електричних розрядів на лапки щурів у випадкові відрізки часу, що примушує тварин постійно змінювати місце знаходження. Тва­ринам дослідні речовини (пептидний комплекс нирок та церулоп­лазмін) вводили за 2 години до початку стреса та одразу після нього. Забій тварин проводили за 2 години після стресу.

Аутоімунний нефрит у тварин індукували під час введення суспензії аутологічної нирки в повному ад'юванті Фрейнда ("Ре­акомплекс", Чита) триразово на протязі трьох тижнів [Kment A. et al., 1976]. Для чого готували водно-сольовий екстракт кор­кової речовини нирок, змішували його з ад'ювантом 1:1 до утво­рення стійкої емульсії. Емульсію вводили підшкірно з розрахун­ку 0,5 мл на тварину. За тиждень після останньої імунізації починали експериментальну терапію пептидним комплексом нирок в дозі 0,1 мг/кг.

Полікомпонентна імунопатологія відтворювалась введенням тваринам суспензії аутологічної нирки в аутологічній сироватці [Шерматов Х.Х., Брысин В.Г., 1988]. Щурів імунізували введен­ням препарату 0,5 мл на тварину п'ятикратно з інтервалом 3 дні підшкірно в область черева. За тиждень після останньої імунізації починали експериментальну терапію пептидним комп­лексом нирок в дозі 0,1 мг/кг.

Унілатеральна нефректомія з алостатичною трансплантацією нирки виконувалась таким чином. У щурів-самців лінії Wistar вагою 180-200 г під гексеналовим наркозом видаляли праву нир­ку, потім алогенну нирку вміщували у великий сальник, трансплантат нирки декапсулювали. Переміщення трансплантатів і порівняння проводили між тваринами попарно, таким чином, щури в парі (тобто в контрольній та дослідній групах) відрізнялися за одними генами гістосумісності. Тварини контрольної групи отримували ін'єкції 0,2 мл стерильного фізіологічного розчину натрія хлориду, а дослідної - 0,1 мг/кг пептидного комплексу нирок. Першу ін'єкцію проводили одразу після операції. Функціональні і морфологічні зміни в паренхімі нирок оцінювали за 4 години, 1 та 4 доби після оперативного втручання. Діурез індукували введенням щурам в шлунок водопроводної води з роз­рахунку 5% від ваги тіла. Сечу збирали на протязі 2 годин в спеціальних клітках. В сечі та сироватці крові вивчали наступні показники: діурез, екскрецію білка, концентрацію та екскрецію креатиніну, натрію, калію, клубочкову фільтрацію, натрій-калієвий коефіцієнт сечі.

Внесення у кров хворих на гломерулонефрит пептидного комплексу нирок проводилось в дозі 10 мкг/мл в мінімальному об'ємі стерильного фізіологічного розчину та інкубації 30 хви­лин. Контролем були проби, куди вносили лише розчинник.

Спектр пептидів нирок при патологіях досліджувався за до­помогою оберненофазової високоефективної рідинної хроматог­рафії.

Взаємодія пептидів з шаперонами Hsp70 досліджувалась та­ким чином. Виділення Hsp70 проводили з нирок мишей BALB/c [Udono H., Srivastava P.K.,1993]. Потім отриманий екстракт Hsp70 був двічі оброблений 10mM АТФ по 30 хвилин на патронах "Centricon-10". Екстракти пептидів, які були зв'язані з Hsp70, були зібрані та сконцентровані під вакуумом Speed Vac (Savant Instruments Inc., Farmingdale,NY) та перерозчинені в 0,1% роз­чині трофтороцтової кислоти (Fluka). Пептидні екстракти аналізували методом ВЕРХ на хроматографі SMART tm SYSTEM, LKB, "Pharmacia", Sweden. Потім до відмитих від АТФ вільних від зв'язаних пептидів молекул Hsp70 було добавлено пептидний комплекс нирок і після 30 хвилин інкубації незв'язані пептиди були відмиті 0,15М хлоридом натрія. Після чого було проведено екстракцію зв'язаних пептидів як описано вище.

Аналіз амінокислотних послідовностей пептидів проводили за методом Едмана на автоматичному секвенаторі 120А "Applied Biosystems" (США). При цьому цистеїн не модифікувався і тому не детектувався.

Дія окремих пептидних фракцій нирок на проліферацію клітин досліджувалась на спленоцитах мишей BALB/c. В 96-лунковий планшет з U-образним дном вносили суспензію спленоцитів в кон­центрації 400000 на лунку. Використовували середовище RPMI-1640 ("Gibco BRL", Шотландія) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (C.C.Pro GMBH,Німеччина). Проліферацію індукували додаванням конканаваліна А (КонА) до кінцевої концентрації 10 мкг/мл. З початком інкубації в лунки вносили пептидні фракції , за 48 годин - 0,5 мкКи 3Н-тімідіна в обсязі 50 мкл. Харвестер здійснювали за 72 години після по­чатка інкубації в автоматичному режимі на скловолоконних філь­трах 1450-421 Printer Filtermat A з твердим сцинтілятором 1450-441 MeltiLex tm A та підрахунком на В-лічильникі MicroBeta tm ("Wallac Oy", Фінляндія).

Крім того, досліджено вплив окремих фракцій на інтер­лейкін-2(ІЛ-2)-індуковану проліферацію клітин лінії CTLL (European Collection of Animal Cell Cultures, UK). Для культи­вування використовували середовище RPMI-1640 з 10% телячої си­роватки з додаванням 10% двухдобового супернатанту КонА-інду­кованої суспензії спленоцитів. 3Н-тімідін та фракції вносили за наведеною вище схемою.

Біосинтез ДНК в тканинах досліджувався методом включення радіоактивної мітки 3Н-тімідіна.

Загальновизнані імунологічні методи докладно описані в цитованій літературі. Треба зупинитися лише на деяких ма­ловідомих методиках. Т- і B-лімфоцити у тварин (білі щури та морські свинки) визначали методом розеткоутворення з ауто­логічними еритроцитами навантаженими антисироватками, що були отримані до тканин тимуса та лімфатичних вузлів [Binaghi R.A. et al.,1975].

Визначення мембранних маркерів лімфоцитів людей проводили методом непрямої флюоресценції з одночасним контролем в фазо­вому контрасті на мікроскопі "ЛЮМАМ-Р8" (ЛОМО, Росія). Вико­ристовували МКА LT3, LT4, LT8, LT22 та LT-DR виробництва Інститута імунології МОЗ Росії до CD3, CD4, CD8, CD22 та HLA-DR. Розраховували середній цитохімічний коефіцієнт.

Імунопероксидазне визначення локалізації імуноглобулінів в тканинах нирок проводили за допомогою анти-імуноглобулінових антитіл мічених пероксидазою.

Аутоантитіла до тканин нирок досліджували методом непря­мої гемаглютинації з еритроцитами барана, навантаженими анти­геном ниркової тканини [Фримель Г., 1987].

Аутоантитіла до сироваткового IgG досліджували методом непрямої гемаглютинації з еритроцитами барана, навантаженими препаратом IgG щурів ("Реакомплекс", Чита) [Фримель Г., 1987].

Для проведення гістологічних досліджень тканинний ма­теріал фіксували в 10% нейтральному формаліні та 2,5 % забуфе­реному розчині глутарового альдегіду, потім за стандартними методиками заключали в парафін, зрізи забарвлювали гем-еозіном, по Малорі.

Враховуючи функціональну єдність основних систем ре­зистентності крові було необхідним дослідити показники пере­кисного окислення ліпідів та гемостазу. Використані загально­визнані методики наведені у таблиці 1.

Таблиця 1

Використані загальновизнані методи дослідження

Отриманий цифровой матеріал був статистично оброблений на ПЕВМ IBM PC/AT-286 "Omega". Проводили обчислення середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (m), помил­ки середньої арифметичної (м), вірогідність отриманих резуль­татів оцінювали за коефіцієнтом Ст'юдента (t). Нормальність розподілу величин оцінювали за показниками P(t), Q(t), R(t), розрахованими за стандартною програмою мікрокалькулятора "Citizen-SRP-175". Частину даних обробляли з використанням дискрімінантного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У відповідності з задачами роботи нами було розроблено метод екстракції біологічно-активних речовин з тканини нирок. В основу метода було покладено дослідження O.Rotzschke та K.Falk (1991), що до екстракції пептидів головного комплексу гістосумісності. Метод полягає в знежиренні та перміалізації мембран клітин коркової речовини нирок, екстракції органічною кислотою в присутності двохвалентних катіонів з наступною пре­ципітацією пептидних речовин та їх очищенням.

Такий екстракт давав позитивну біуретову реакцію, мав спектр поглинання в УФ-області з максимумом 210-220 нм, харак­терний для пептидного зв'язку. Під час порівняння ВЕРХ-спектру отриманого екстракту з екстрактами, отриманими за методом O.Rotzschke та K.Falk (1991) знайдено збіжність цих пептидних сумішей для HLA-DR5 та DR1. Під час гель-хроматографії виявле­но дві основні фракції з молекулярною масою 4 та 8 kD, елект­рофорез в поліакріламідному гелі виявив чотири основні фракції, однак, їх точну масу з'ясувати не вдалось.

Вивчення амінокислотного складу природнього пептидного комплексу нирок показало високу відносну кількість глутаміно­вої, аспарагінової кислот, аргініну та лізіну. Ідентифікація деяких фракцій, які переважають у пептидному екстракті, пока­зала наявність таких пептидів: іпсилон-ланцюг гемоглобіну (55-66, 56-66), альфа-ланцюг гемоглобіну (48-61), убіквітін (1-20). Найбільш цікава наявність фрагментів альфата іпси­лон-ланцюгів гемоглобіна, тому що нирка в зрілому віці не про­дукує гемоглобін, тим більш іпсилон-ланцюг (продукується на початку ембріонального періода). Наявність в пептидному екстракті пептидів, що є фрагментами білків, які звичайно не експресуються, є характерною ознакою пептидів, зв'язаних з мо­лекулами ГКГС [ Rudensky A. Yu. et al., 1991; Wilson I.A., Fremont D.H., 1993; Demotz S., 1993; Tsomides T.J.,Eison H.N., 1993]. Цей висновок підтверджується знайденою нами збіжністю хроматографічних спектрів природного пептидного комплексу ни­рок та пептидів, виділених з молекул ГКГС (переважно ГКГС І класу).

Таким чином, розроблений нами метод екстракції дозволяє одержувати пептидний комплекс, який наданий переважно пептида­ми головного комплексу гістосумісності.

Враховуючи, що пептиди ГКГС головним чином беруть участь в контакті та подальших реакціях між Т-клітинним рецептором та молекулою ГКГС, ми вивчили вплив отриманих нами пептидів на експресію деяких молекул на поверхні лімфоцитів.

Отримані результати свідчать, що пептидний комплекс во­лодіє дозозалежною активуючою дією на Т-клітини, під його впливом спостерігалась зміна експресії специфічних рецепторів, їх перегрупування. Зростала експресія CD3, CD4 (підвищувалась кількість кепінгів, петчів), CD8 (характерно зменшення числа кластерів з міцною флюоресценцією). Пептидний комплекс нирок істотно не впливав на стан В-клітин (М-РУК та CD22-позитивних клітин).

Звертає на себе увагу незначне підсилення експресії HLA-DR, що може бути пояснено стабілізуючою дією пептидів на мембранні молекули ГКГС, що в ряді випадків розташовані на мембрані без антигенного пептида [ Schumacher T.N.M. et al., 1990], крім того ці автори показали можливість зв'язку між пептидом та "порожньою" молекулою ГКГС, як in vivo, так і in vitro. Кількість таких "порожніх" молекул під час патологічних процесів істотно зростає, нижче ми ще зупинимось на цьому пи­танні.

Під час дії пептидного комплексу ми не спостерігали сенсибілізації лімфоцитів і секреції цитокінів, здатних галь­мувати міграцію лейкоцитів. На фоні попереднього кондиціювання клітин в присутності пептидного комплексу нирок введення міто­гену ФГА більш інтенсивно гальмувало міграцію, чим у відсут­ності пептидів. Отже пептидний комплекс модулював відповідь лімфоцитів на ФГА.

Відомо, що процеси диференціровки Т-клітин відбуваються головним чином в тимусі, де внаслідок позитивної та негативної селекції відбираються необхідні клони Т-клітин [ Ярилин А.А., 1998;Hogquist K.A. et al., 1994; Nossal G.J.V., 1994]. В цих процесах не останню роль відіграють молекули ГКГС зі зв'язаними пептидами. Тому було цікаво дослідити як впливає пептидний комплекс нирок на морфофункціональний стан тимуса під час імунного відгука на тимусзалежний антиген (еритроцити барана).

Основні зміни локалізувалися в кортикомедулярній зоні. Під впливом пептидного комплексу в тканині тимуса з'являлися молоді тільця Гасаля, спостерігались кистоподібні утворення за рахунок епітеліальних клітин. Цитоз коркової речовини зменшу­вався. Ці зміни свідчать про активацію функціональних процесів в тимусі [ Белецкая Л.В., Гнездицкая Э.В., Беляєв Д.Л., 1986; Пучков В.Ф. и соавт., 1998], вихід клітин на периферію. Отже за фізіологічних умов пептид­ний комплекс нирок здатен активувати функціональні процеси в тімусі, можливо індукувати вихід лімфоцитів у кровообіг.

Важливим питанням було визначення антигенних та імуноген­них властивостей препарату. Введення препарату тваринам не викликало розвитку реакцій гіперчутливості негайного типа, введення разом з повним ад'ювантом Фрейнда також практично не викликало сенсибілізації. Більш помітною була здатність пеп­тидного комплексу індукувати синтез гомоцитотропних антитіл. Препарат практично не впливав на антитілогенез. Отже пептидний комплекс нирок виявляв слабкі антигенні властивості.

Співставлення результатів дослідження показників гемоста­зу та ПОЛ в серіях in vitro та під час введення здоровим тва­ринам допомогло визначити прямі та неспецифічні риси дії. До специфічного впливу пептидного комплексу нирок за нашими ре­зультатами можно віднести блокування тромбінової активності, та прискорення швидкості фібринолізу, можливо внаслідок акти­вації плазміногену. Ці властивості пептидного комплексу збіга­ються з функціональними особливостями ниркового кровотоку. Дія препарату на процеси ПОЛ мала опосередкований характер.

Наступним кроком наших досліджень стало вивчення дії природного пептидного комплексу нирок за умов розвитку пато­генних станів. В першій частині дослідів нас зацікавив вплив препарату під час типового патологічного процесу, який вливає на стан імунної системи (переважно Т-ланки) та систем, що нами ддосліджувались, але такий вплив не повинен бути пов'язаний із розвитком специфічних імунних реакцій. Патологією, яка відповідає всім цим крітеріям, та на сьогодні досить докладно вивчена, є стрес [ Меерсон Ф.З.,1986; Малышев В.В., Васильева А.С., Кузьменко В.В., 1997]. Найбільш важливою в ме­дичному плані формою стресу є гострий емоційний стресс [Ведяев Ф.П., Воробьева Т.М.,1983]. Стресорна реакція супроводжується вираженими метаболічними змінами та пригніченням саме Т-ланки імунітету. Це супроводжується зниженням вмісту Т-клітин, пригніченням їх активності в тесті розеткоутворення та бласт­трансформації [Суркина И.Д., 1981].

Як показали наші дослідження, пептидний комплекс нирок викликав відновлення показників клітинного імунітету - нор­малізація вмісту Т- та В-клітин, їх здатності відповідати на КонА. Порівняння дії пептидного комплексу з дією антиоксидант­ного ферменту церулоплазміна дозволило виявити характерні оз­наки впливу пептидного комплексу: блокування тромбінової ак­тивності, активація фібринолізу та переважний органоспе­цифічний вплив на процеси ПОЛ та активність ферментативних процесів в нирках.

Тимус разом з залозами внутрішньої секреції бере участь в адаптації організма до дії факторів довкілля [Меерсон Ф.З., 1986]. Виходячи з цього, було досліджено дію пептидного комп­лекса в умовах гострого ЕБС. Введення пептидного комплексу викликало виражену нормалізацію процесів імунітету, переважно гуморального: відновлювалась концентрація комплементу, імуноглобуліну G, концентрація аутоантитіл до тканини нирки та циркулюючі імунні комплекси.

Враховуючи значний вплив пептидного комплексу нирок на показники імунітету, зокрема, активність Т-клітин та функціональний стан тимуса, було цікавим дослідити його дію в умовах специфічної імунопатології нирок. Як експериментальну модель було використано нефрит Хеймана, який максимально наб­лижений до мембранозної гломерулопатії у людей [Дранник Г.Н., 1989]. Антигени, відповідальні за розвиток нефриту Хеймана, розташовані в клубочковій базальній мембрані, щітковій каємці. Великий інтерес викликає наявність перехресно реагуючих анти­генів в щітковій каємці канальців нирок та коркової речовини тимуса за даними Bakker W.W. та співавт. (1979). Патогенетична основа патології полягає в гранулярних відкладеннях імуногло­буліна G під епітелієм.

Під час введення пептидного комплексу нирок було за­реєстровано істотні зміни показників імунітету у тварин з неф­ритом: зросло число лімфоцитів в крові, відновився знижений відсоток Т-клітин, коефіцієнт Т/В-клітини зріс з 0,8 до 1,3. Зменшився індекс стимуляції лімфоцитів КонА та нирковим анти­геном до нормальних показників. Одночасно зменшився титр нир­кових аутоантитіл, відновилась концентрація ЦІК, нормалізува­лась функціональна активність фагоцитів.

          Введення пептидного   комплексу   зменшувало кількість Т-клітин, інфільтруючих простори навкруги судин та канальців, та обсяг депозитів імуноглобулінів базальних мембран гломерул. Одночасно з цим ми спостерігали відновлення азотсекретуючої функції нирок.

Реакція тимуса здорових щурів на пептидний комплекс нирок полягала в підвищенні мітотичних процесів в корковій речовині зі зростанням числа лімфобластів та середніх лімфоцитів з підсиленням евакуації малих лімфоцитів з коркової до мозкової речовини і, можливо, далі за межі органу. За умов нефриту тимоцити залишали тимус на тлі зниженої мітотичної активності в корковій речовині та низької концентрації молодих форм (лімфобласти, середні лімфоцити), що свідчить про функціональ­не виснаження органу [Хмельницкий О.К., Белянин В.Л., Гринце­вич И.И., 1983]. Застосування в цих умовах пептидного комп­лексу відновлювало мітотичну активність тимоцитів, кількість їх молодих форм і навіть ще більше підсилювало вихід малих лімфоцитів. Підвищення розміру ядер ретікуло-епітеліальних клітин дає змогу передбачити їх більшу функціональну ак­тивність під дією пептидного комплексу.

Отже, під час розвитку аутоімунного відгука на ниркові антигени (нефрит Хеймана) пептидний комплекс нирок знижував прояви аутоімунної відповіді, спрямованої на антигени нирки.

         Такі зміни не можна пояснити імунодепресивним впливом пептид­ного комплексу нирок. Дослідження проведені in vitro та на здорових тваринах, і тих що підлягали стресу, не виявили іму­нодепресивної дії препарату. Отже, за умов аутоімунного нефри­ту пептидний комплекс блокував розвиток аутоімунної відповіді на антигени ниркової тканини, можливо шляхом відновлення іму­нологічної толерантності.

Імунологічна толерантність та процеси, які її підтримують мають різні рівні [ Ferber I. et al.,1994; Arnоld B., Schonrich G., Hammerling G.J., 1993 ], центральний - тимус, та декілька периферійних. Роботами цих авторів показано, що зрілі Т-клітини, які залишають тимус, залишаються чутливими до індукції толерантності. Ступінь толерантності при цьому визна­чається: 1) афінністю Т-клітинного рецептора, рівнем експресії Т-клітинного рецептора та допоміжніх молекул; 2) стадією роз­витку Т-клітин. Т-клітини, щойно емігрувавші з тимуса, більш здатні до індукції толерантності, чим до активації (!). Отже рання експресія антигена веде до толерантності, а пізня - до аутоімунізації. Контакт між Т-клітинним рецептором та молеку­лой ГКГС зі зв'язаним пептидом може відбуватися традиційно, коли мігрує лімфоцит, і альтернативно - коли мігрує комплекс ГКГС-пептид, розташований на мембрані АПК. В той же час, Т-клітинний рецептор може взаємодіяти із розчиненим вільним пептидним антигеном, який спеціальним образом оброблений: має низьку молекулярну масу та фрагмент для зв'язування з рецепто­ром .

Отже, враховуючи знайдені зміни в тимусі та на періферічних CD8-позитивних Т-клітинах (зменшення ступеня флю­оресценції та кластерізації), можна вважати, що пептидний комплекс має двонаправлену дію, як на центральний, так і на периферійний рівні толерантності.

Для того щоб впевнитись у специфічності толерогенної дії пептидного комплексу нирок ми відтворили модель полікомпонент­ної імунопатології - одночасна імунізація нирковим антигеном і білками сироватки крові.

Отримані результати доводять, що за цих умов пептидний комплекс був здатний усувати явища сенсибілізації лімфоцитів до аутоантигенів нирок, але не виключав аутоімунної реакції до білків сироватки, тобто пептидний комплекс виказував спе­цифічну толерогенну дію. Слід зауважити, що при цій патології терапевтична активність пептидного комплексу була менш вираже­на, чим при ізольованому нефриті.

          В роботах        B.Arnold   та   співавт.   (1993-1994)   демонструється, що периферійна толерантність більш наявно вияв­ляється під час трансплантаційних експериментів. Крім того, трансплантація нирки в умовах аутоімунних захворювань нирки та її імунний захист після трансплантації мають значну важливість та практичну цінність [Дранник Г.Н., 1971, 1980; Barbara A. et al., 1997]. Як проде­монстрували наші дослідження введення пептидного комплексу ни­рок в значному ступеню відвертало розвиток реакції відторгнен­ня (зменшення лімфоїдної інфільтрації трансплантату) та нефри­ту в контрлатеральній нирці. В цій серії дослідів ми також спостерігали явище блокування відповіді лімфоцитів пептидним комплексом на антигени нирок, але не на мітоген.

Під час внесення у кров хворих на хронічний гломерулонеф­рит пептидний комплекс відновлював відсоток Е-РУЛ та Т-хел­перів, знижував відповідно до нормальних значень М-РУЛ та ак­тивність фагоцитозу, нормалізував адгезійну здатність нейт­рофілів (Е-РУН) та показники РБТЛ на КонА.

В піонерській роботі Sloan-Lancaster J. та співавт. (1993) доведено, що змінені ліганди Т-клітинних рецепторів на живих АПК можуть індукувати Т-клітинну анергію або гіперергію. Тому ми вирішили дослідити чи змінюється спектр природних пеп­тидних речовин нирки під час розвитку патологічних процесів, зокрема при нефриті Хеймана. Було знайдено, що відтворення па­тології характеризується зникненням окремих фракцій та появою інших, нових, причому відносна питома вага значно змінена. Введення екзогенного пептидного комплексу викликало відновлен­ня піків різної міри.

Таким чином, за умов патології змінюється спектр пептидів ГКГС, що цілком зрорзуміло, тому що молекули ГКГС презентують фрагменти білків змінених або раніш не синтезованих, відобра­жають обсяг синтезу білків внутрі клітини.

Отже, за допомогою таких пептидних фрагментів клітина здатна інформувати навколишнє оточення про свій функціональний стан.

Як показали наші дослідження, пептидний комплекс нирок являє складну багатокомпонентну речовину. Тому постало питан­ня, чи однакова дія різних фракцій на процеси проліферації лімфоцитів. Було знайдено, що окремі хроматографічні фракції пептидного комплексу нирок здатні впливати на проліферацію ми­шиних спленоцитів та клітин лінії CTLL. Отже в паренхімі нирок містяться пептидні речовини здатні в фізіологічних умовах неспецифічно регулювати активність лімфоцитів, а при патології виступають вже як специфічні месенджери. Можливість існування такого процесу підкріплюється також даними про зміну співвідношення окремих фракцій пептидного комплексу при роз­витку аутоімунної патології нирок.

Звертає на себе увагу відмінність дії одних і тих пептид­них фракцій на лімфоцити, активовані мітогеном КонА та ендо­генним ростовим фактором - ІЛ-2. Ймовірно відмінність полягає у впливі пептидів на характерні активаційні етапи Т-клітин [Бережная Н.М., Горецкий Б.А., 1992; Paul W.E. et al., 1984]. Вірогідно пункт дії отриманих пеп­тидів слід шукати в каскаді реакцій, які спостерігаються слід за дією ІЛ-2, тобто ліганд-рецепторна взаємодія ростових фак­торів, синтез клітинних протоонкогенів і реципрокне індукуван­ня синтезу субодиниць рецептора ІЛ-2.

Таким чином, окремі пептидні фракції коркової речовини нирки здатні неспецифічно діяти на проліферацію непримірованих лімфоцитів, індуковану КонА та ІЛ-2. Найбільш чітка дія спостерігається при активації ІЛ-2. Можливо отримані пептиди діють на системи, які регулюють рост та проліферацію клітин, пов'язані з дією ростових факторів та клітинних протоонко­генів, здійснюючи за фізіологічних умов кооперацію між імуно­цитами та клітинами нефрону, та реалізують процеси репарації та компенсації.

Виходячи з того, що досліджуваний пептидний комплекс ни­рок продемогстрував наявність специфічних та неспецифічних ефектів, постало питання чи відрізняються пептидні речовини екстраговані з нирок від пептидів отриманих з інших органів, та чи можна виділити органоспецифічні та неспецифічні фракції в їх складі.

Проведені дослідження дали змогу сгрупувати пептидні комплекси за хроматографічними характеристиками таким чином: група паренхіматозних органів - селезінка, печінка, нирки; ен­докринні залози - підшлункова залоза, тімус; окремо - пародонт.

Це може бути пов'язано із специфічним для кожного органу чи тканини етапами протеолітичного процесінгу білкових струк­тур, котрий має місце або при деградації, або при пост­трансляційної модифікації знов синтезованих білків. Цікаво, що три знайдені фрагменти гемоглобіну в якості С-кінцевої аміно­кислоти мають залишок лізіну. Це може свідчити за те, що ці фрагменти можуть бути утворені внаслідок обмеженого протеолізу молекул гемоглобіну, тому що відомо, що розщеплення моле­кул-попередників головним чином відбувається в районі ло­калізації лужних амінокислот - аргініна та лізіна. Вірогідно, такі властиві кожному органу або тканині пептидні молекули бе­руть участь як у міжклітинному сигналізуванні, так і між фізіологічно пов'язаними органами та системами.

Збіжність хроматографічних характеристик пептидних комп­лексів, екстрагованих з групи паренхіматозних органів , поста­вила питання про специфічність дії пептидного комплекса нирок.

Для з'ясування цього питання була проведена серія досліджень впливу пептидного комплексу печінки на деякі показ­ники імунітету, гемостазу та неспецифічної резистентності ор­ганізму в умовах норми та при розвитку аутоімунного нефриту.

Як показали дослідження, пептидний комплекс печінки підвищував рівень Еа-РУК. Вивчення впливу препарату на стан фагоцитарних реакцій виявило його дозозалежну активуючу дєю за показниками НСТ-тесту та фагоцитарного індексу та блокуючу на активність лізосомальних катионних білків. При внесенні у до­норську кров пептидний комплекс печінки гальмував процеси зсідання крові та фібринолізу, суттєво не впливав на показник тромбінового часу.

За умов розвитку нефриту Хеймана пептидний комплекс печінки не впливав на аутоімунну відповідь на тканинні антиге­ни нирок.

Попередніми дослідами ми показали, що пептидний комплекс нирок впливав на процеси регенерації в нирках і за низкою по­казників виявляв органоспецифічні ознаки дії. Тому ми порівня­ли дію пептидних комплексів нирок та печінки на накопичення 3Н-тімідіну в органній культурі нирки, що відображує процеси біосинтеза ДНК.

Під час проведення дослідження ми з'ясували, що лише пеп­тидний комплекс нирок вірогідно підсилював накопичення 3Н-тімідіну, це ще раз продемонструвало органоспецифічність впливу.

Таким чином, внаслідок проведених досліджень можливо виділити специфічні та неспецифічні риси дії пептидного комп­лексу нирок. До специфічних ефектів слід віднести: вплив на антигенспецифічну відповідь на ниркові антигени, здатність впливати на процеси ПОЛ та біосинтез ДНК в нирковій тканині, гальмування тромбінової активності та фібринолізу. До неспе­цифічних ефектів слід віднести: вплив на вміст Т-активних клітин та активність фагоцитозу, здатність впливати на процеси ПОЛ в крові.

Одним з ключових аспектів розуміння механізму дії пеп­тидів, екстрагованих з тканин, є процес трансдукції пептидного сигналу. Взагалі, проблема полягає в пошуці мембранних струк­тур, котрі здатні зв'язувати пептидні/поліпептидні молекули. Як приведено в літературному огляді, на роль пептидзв'язуючих молекул можуть претендувати: імуноглобуліни, молекули ГКГС, молекулярні шаперони та специфічні рецептори. Нашу увагу при­вернула група молекулярних шаперонів, по-перше, їх досить ши­рокою специфічністю зв'язування, по-друге, їх не зрозумілою присутністю на зовнішньоклітинних мембранах  [DeNagel D.C., Pierce S.K.,1993].

Отримані нами результати демонструють, що молекули моле­кулярних шаперонів Hsp70, звільнені від ендогеннозв'язаних пептидів, здатні взаємодіяти з окремими фракціями пептидного комплексу нирок. Враховуючи, що в дослідженні ми використову­вали препарати Hsp70 не тільки мембранного пула, але і в значній мірі внутріклітинні, з вірогідністю можна стверджувати лише про факт взаємодії між молекулярними шаперонами Hsp70 та компонентами пептидного комплексу. Це дає підставу передбача­ти, що молекулярні шаперони Hsp70 можуть брати участь в ре­алізації пептидного сигнала.

Загальновизнаним підходом до вивчення біологічної актив­ності пептидних сумішей є поетапне дослідження цілісної суміші з наступним вивченням окремих фракцій. Внаслідок виконання цієї програми досліджень отриманий результат дає змогу виділи­ти декілька пептидів з визначеною біологічною активністю, як правило при цьому втрачаються властивості, що були притаманні цілісній суміші [Бойко С.С. и соавт.,1998; Гомазков О.А., 1995].

Нами був вибраний інший підхід, запропонований K.Falk та O.Rotzschke (1991) для вивчення пептидів зв'язаних молеку­лой ГКГС в кишені Бйоркмана. Коротко суть полягає в екстракції комплекса пептидів, хроматографічному аналізі і вивченню уз­годженої послідовності пула пептидних фракцій.

Виконаний аналіз показав - залишками, що домінують, є валін, аспарагінова та глутамінова кислоти в позиції 2, лізін- в 3, аспарагінова кислота - в 4, і аргінін - в 6 позиції. Крім того, заслуговує обговорення переважне розташування проліна в 2 та 3 позиціях.  Подібні результати  були  отримані також  в  роботі  [Falk  K.,  Rotzschke O.,1994] і  розцінені як наслідок процесінгу пеп­тидів, який не впливає на зв'язування з молекулами ГКГС.

Виходячи з аналіза амінокислотної послідовності пула пеп­тидів нами була складена пошукова формула для з'ясування при­пускаємої послідовності в складі відомих білків. Такі послідовності були знайдені в складі аконітази (фермент цикла Кребса), кофіліну та дестріну (актін-зв'язуючі білки), попе­редників туморнекротичного фактору альфа, гастрину та релакси­ну, а також сорбіну (підсилює всмоктування води та натрія).

Наявність фрагментів цих білків дуже важлива, тому що на­явність актіну, рівень натрія, є важливими факторами регене­рації нефрону [Rosenberg M.E., Paller M.S.,1991].

Внаслідок пошуку та аналізу послідовностей реальних пеп­тидів було складено формулу для синтеза пептидів-аналогів: в першій позиції знаходиться люба амінокислота (можливо пролін для захисту епітопа), в 2 позиції - глутамінова або аспа­рагінова кислоти, в 3 - лізін, в 4 - аспарагінова кислота або гістідін, в 5 - люба, в 6 - аргінін, в 7 - люба амінокислота. В якості любой кислоти частіш використовують неполярні неза­ряджені амінокислоти.

Отже, уявлялось реальним синтезувати реальну пептидну субстанцію на грунті знайденої формули, яка б володіла імуноп­ротекторними властивостямит за умов імунопатології нирок. Були синтезовані таки пептиди: про-глу-ліз-асп-лей-арг-ліз (PEKDLRK), про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз (PEKDSRK), про-глу-ліз­асп-асп-арг-лей (PEKDDRL). Біологічна активність пептидів-ана­логів досліджувалась нами на моделі аутоімунного нефриту Хей­мана та порівнювалась з активністю природного пептидного комп­лексу нирок.

Вивчення показників імунітету, ПОЛ та АОФ, морфо­функціонального стану нирок та тимуса довело, що найбільш ак­тивним синтетичним пептидом був PEKDLRK, ефекти якого наближа­лися до природного пептидного комплекса нирок і в ряді ви­падків перевершували його.

Нами було досліджено вплив синтезованих пептидів аналогів на деякі імунологічні показники під час введення у кров здоро­вих донорів. Всі пептиди мали здатність знижувати відсоток Т-супресорі і відповідно підвищувати - Т-хелперів, найбільш активним виявився пептид PEKDSRK. Пептиди істотно не впливали на вміст Т- і В-клітин.

Синтетичні аналоги активували процеси фагоцитоза та кисеньактивуючу та протеолітичну функцію нейтрофілів, причому PEKDLRK найбільш підсилював кисеньактивуючу функцію нейт­рофілів, а PEKDSRK найбільш істотно підсилював протеолітичну активність.

Ці дані добре узгоджуються з нещодавно продемонстрованими відомостями, що пептиди, які моделюють епітоп Т-клітинного розпізнавання, здатні відвертати розвиток аутоімунних захворю­вань [DeMagistris M.T. et al., 1992]. Потім синтетичний пептид, відповідаючий імунодомінантному епітопу віруса лімфоцитарного хоріоменінгіту був використаний для примірування та відновлен­ня імунологічної толерантності in vivo у трансгенних мишей, у котрих епітоп віруса експресувався у підшлунковій залозі, відвертаючи пошкодження бета-клітин і розвиток діабету у таких мишей [Малыжев В.А.,1998; Aichele P. et al.,1994].

Під час внесення синтетичних пептидів у кров донорів от­римані пептиди підвищували відсоток теофілін-резистентних клітин (Т-хелперів), знижують - теофілінчутливих, активують фагоцитарні функції.

Таким чином, отримані нами синтетичні пептиди, які моде­люють природний пептидний комплекс нирок були здатні блокувати розвиток аутоімунного нефриту і виявляли риси потенційних фар­макологічних речовин.

Сьогодні вже відомі лікарські речовини, які являють собою синтетичні пептиди, що моделюють структуру Т-клітинного епіто­пу. Класичним прикладом є кополімер 1, дію якого можна описати таким дослідом. У щурів індукували розвиток алергічного енце­фаломієліту шляхом введення спинного мозку або синтетичних пептидів протеоліпідного білку р139-151 та 178-191. Кополімер 1 відвертав розвиток захворювання, блокував антигенспецифічну відповідь специфічних Т-клітинних ліній, але не впливав на поліклональну відповідь, викликану суперантигеном (ентеро­токсин А). Кополімер 1 запобігав зв'язуванню р139-151 та р178-191 з молекулами МНС та ,більш того, мог виштовхувати ці пептиди із зв'язуючого сайта МНС [Teitelbaum D. et al.,1996].

Такий блокуючий вплив на антигенспецифічну відповідь без інгібірування поліклональної відповіді ми спостерігали прак­тично в усіх нашіх дослідах з пептидним комплексом нирок при імунній патології.

Сьогодні кополімер 1 вже успішно використовується в клінічній практиці для лікування розсіяного склерозу са­мостійно або в комбінації з ендогенними імуномодуляторами [Milo R., Panitch H., 1995].

Як відомо, імунна система має міцні функціональні зв'язки з іншими системами резистентності крові - коагуляційною та пе­рекисним окисленням ліпідів разом із антиоксидантним захистом [Кузник Б.И. и соавт., 1989; Мищенко В.П. и соавт., 1982-1995; Дранник Г.Н., 1989], тому ми також дослідили і ці процеси.

Внесення пептидного комплексу у кров донорів, введення здоровим тваринам і тваринам з експериментальною патологією виявило такі основні риси дії - блокування зовнішнього шляху зсідання крові, блокування тромбінової активності та активація фібринолізу. Ці властивості пептидного комплексу дуже важливі з точки зору функціонального локального гемостазу [Kanfer A., 1984-1990].

Рівень ПОЛ та АОФ відображують функціональну активність та морфологічну цілісність клітин нирок вцілому [Роговой Ю.Е., Гоженко А.И., 1989; Iwasaki K.,1990; Dagget D.A. et al., 1997; Paller M.S.,1988].

В усіх серіях дослідів, де вивчали показники ПОЛ та АОФ, були знайдені суттєві зміни у хворих тварин. Введення пептид­ного комплексу нирок відновлювало ці показники до рівня здоро­вих тварин. Ці зміни ми пов'язуємо з дією пептидного комплексу на функціональний стан клітин, яка непрямо відображується на показниках ПОЛ та АОФ.

Наступне питання, яке на наш погляд потребує обговорення, це те що при досить нетривалому терміні введення пептидного комплексу нирок ми спостерігали чіткий терапевтичний вплив та, в багатьох випадках, нормалізацію стану морфологічних структур нирки.

Ця проблема постала після аналізу літератури, присвяченої клінічній терапії розсіяного склерозу кополімером 1 , де наве­дено дані щодо досягнення клінічного покращення при тривалому застосуванні препарату.

На наш погляд, це може бути пов'язано з двома причинами. По-перше, ефект після введення пептидів в експериментальних умовах відбувається швидче, внаслідок того, що експерименталь­на патологія чітко визначена, як правило моноетіологічна, з відомим патогенезом. Той же кополімер при експериментальному енцефаліті діяв набагато швидче, чим за клінічних умов [Teitelbaum D. et al., 1996]. Очевидно, що строки клінічного застосування досліджуваних нами речовин будуть більш тривалі. По-друге, нервова та ниркова тканини мають різні строки роз­витку компенсаційних та адаптаційних реакцій, різні форми ре­генерації. Для нирок ці процеси відбуваються більш динамічно.

В нирках після дії пошкоджуючих факторів пристосувальні флуктуації функціональної активності та нормалізація порушених функцій забезпечується в рівній мірі за рахунок гіперплазії клітин та внутріклітинних регенераторних (гіперпластичних) процесів. Регенерація епітелія нирок вивчена недостатньо та практично виключно на тваринах, що ростуть весь період життя - щури та миші, тому ці результати треба дуже обережно екстрапо­лювати на регенерацію нирок у інших ссавців та людей.

Введення пептидного комплексу нирок за умов розвитку експериментальних патологій прискорювало відновлення функціональних елементів нирки. Дослідження продемонстрували, що пептидний комплекс здатен підсилювати біосинтез ДНК (вклю­чення 3Н-тімідіну) в нирках в органозалежний спосіб. За умов нефректомії контрлатеральна нирка під впливом пептидів швидче відновлювала свій функціональний стан, скоріш адаптувалась до зростання обсягів фільтрації, явища гіпертрофії були більш ви­раженими, ніж в контрольних тварин.

Отже, пептиди головного комплексу гістосумісності під час введення тваринам з пошкодженням ниркової тканини різної етіології прискорюють розвиток компенсаційно-пристосувальних реакцій та регенерацію ниркової паренхими.

Останне питання, яке на наш погляд потребує обговорення, це механізм взаємодії пептидів з Т-клітинами: взаємодіють пеп­тиди з Т-клітинами самостійно чи в комплексы з молекулами ГКГС? Якщо пептид взаємодіє з молекулою ГКГС, то як введений в середовище вільний пептид взаємодіє з молекулою ГКГС, в яку за фізіологічних умов вже вбудовано пептид?

На це питання можуть дати відповідь роботи Базельского інституту імунології, в яких показано, що на поверхні анти­ген-презентуючих клітин майже завжди існують (особливо в умо­вах, несприятливих для клітин, наприклад, низька температура) вільні від пептида молекули ГКГС, але дуже не стабільні. Стабілізація досягається після взаємодії з пептидами із зов­нишнього середовища. Утворений комплекс, що дуже важливо, може взаємодіяти з великим числом рецепторів [Vallitutti S., Lanzavecchia A., 1995].

Взаємодія комплекса пептид-ГКГС з Т-клітинним рецептором може приводи до різних наслідків, від повної активації Т-клітин до нуль-реакції [Evavold B.D., Sloan-Lancaster J., Allen P.M., 1993].

Цей феномен в світовій практиці зараз набуває значної уваги, завдяки використання синтетичних пептидів як лікарських препаратів [Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б., 1998].

          Наприклад, американська компанія "ImmuLogic Pharmaceutical Corporation” (Массачусет) розробляє "пептидні вакцини" для досягення толерогенних ефектів [Norman Ph.S. et al., 1997; Nicodemus C. et al., 1997]. Тому зрозуміло, що пептидний комплекс нирок, який виявив виражену терапевтичну активність за умов нефропатології, зараз прохо­дить доклінічні випробування як новий лікарський препарат. Од­нак, майбутне без сумнівів належить його синтетичним аналогам.

ВИСНОВКИ

1. Пептидний комплекс, який екстрагується з нирок за до­помогою органічних кислот в присутності катионів двохвалентних металів, вцілому наданий пептидами головного комплексу гістосумісності.

2. Пептидний комплекс нирок здатен змінювати функціональ­ний стан лімфоцитів періферічної крові (підвищення експресії CD3, CD4, HLA-DR з активацією у вигляді кепінгу та кластерізації, зниження - CD22 та незначно CD8) та функціональну морфологію тимуса в фізіологічних умовах та під час імунізації тимусзалежними антигенами.

3. Природний пептидний комплекс нирок володіє здатністю активувати фібріноліз та блокувати перетворення тромбіну, що відповідає функціональним особливостям органу, за фізіологічних умов  та  під час розвитку патології нирки.

4. Пептидний комплекс нирок запобігає розвитку анти­генспецифічної відповіді на антиген ниркової тканини за умов експериментальної патології (аутоімунний нефрит, полікомпо­нентная імунопатологія, алотрансплантація нирки) та під час внесення у кров хворих на хронічний гломерулонефрит.

5. За умов аутоімунного нефриту змінюється спектр пеп­тидів ниркової тканини (зникають або виникають пептидні фракції, змінюється їх співвідношення), введення екзогенного пептидного комплексу викликає відновлення спектру пептидів ни­рок.

6. Окремі фракції пептидного комплексу нирок здатні впли­вати на Кон-А індуковану проліферацію мишиних спленоцитів та ІЛ-2 індуковану - клітин лінії CTLL (СD8+). Більш гідрофобні хроматографічні фракції підсилювали проліферацію, гідрофільні - знижували у характерній дозозалежній манері ("дзвіноподібні" криві).

7. Нирки мають специфічний набір пептидних речовин, який відрізняється від такого в тканинах селезінки, тимуса, підшлункової залози, печінки, пародонту. В складі цього комп­лексу виявлено фрагменти іпсилон-(55-66; 56-66) та аль­фа-(48-61)- ланцюгів гемоглобіну, убіквітіна (1-20).

8. Пептидний комплекс нирок містить фракції, які здатні зв'язуватися з молекулярними шаперонами Hsp70, які можуть бра­ти участь в реалізації дії таких пептидів.

9. Загальною схемою будування пептидного комплексу нирок є: в положенні 1 - пролін, в 2 - валін, аспарагінова та глу­тамінова кислоти, в 3 - лізін, в 4 - аспарагінова кислота, в 6 - аргінін.

10. Синтетичні пептиди - аналоги природного пептидного комплексу нирок (про-глу-ліз-асп-лей-арг-ліз, про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз, про-глу-ліз-асп-асп-арг-лей)  під час внесення у кров донорів  знижували відсоток теофілін-резистентних клітин, підвищували - теофілінчутливих, активували фагоцитарні функції ПМЯЛ, за умов аутоімунного нефриту відновлювали імунологічну толерантність, виявляли тімуспротективний ефект, прискорювали регенерацію паренхіми нирок. Найбільш активним виявився пептид про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз.

11. Пептиди головного комплексу гістосумісності нирок ма­ють також власну фізіологічну активність не пов'язану з пре­зентацією антигена та імунним розпізнанням, спрямовану на підтримку метаболічних та регенераторних процесів в нирках.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. На підставі проведених досліджень доцільно рекоменду­вати природний пептидний комплекс нирок для проведення клінічних іспитів, як препарата для лікування аутоімунних зах­ворювань нирок.

2. Перспективне подальше вивчення синтетичних аналогів природного пептидного комплексу нирок як потенційних лікарсь­ких речовин.

3. Запропонований методичний підхід для спрямованого син­теза біологічно активних пептидів із заданими властивостями може бути використаний для створення нових лікарських препа­ратів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ АВТОРОМ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Відновлення пептидергічної регуляціі у нирках екзогенними поліпептидними речовинами ренального походження. Физиологи­ческий журнал.- 1992.- Т.38, N 6.-С. 106-109.

2. Влияние почечных полипептидов на активность лимфоцитов при экспериментальном нефрите. Физиологический журнал.-1993.-Т.39, N5-6.-С.52-56

3. Механізми утворення та дії поліпептидних біорегуляторів-ци­томедінів. Фізіологічний журнал.- 1994.-т.40,N1.-С.51-64.

4. Влияние полипептидного комплекса тканей почек на актив­ность лимфоцитов донорской крови. Иммунология// 1995.- N4.-С.31-33.

5. Сравнительное изучение хроматографических спектров поли­пептидов, экстрагированных из селезенки, печени, почек, ти­муса, пародонта свиней. Укр. биохим. журн..- 1995.-т.67,N5.-С.85-89.

6. Вивчення специфічної дії пептидного комплексу нирок під час унілатеральної нефректомії з алостатичною трансплантацією нирки у щурів. ФАРМАКОМ.-1995.-N11-12.-С. 31-37.

7. Тканевая специфичность пептидных экстрактов, выделенных из различных органов, и иммунорегуляторное действие пептидного экстракта почек. Биополимеры и клетка.- 1995.-N5, т.11.-С.61-75.

8. Установление согласованной последовательности пула пептид­ных фракций, выделенных из коркового вещества почек. Иммуноло­гия.-1996.-N2.- С. 24-28

9. Влияние отдельных пептидных фракций, выделенных из корко­вого вещества почек, на пролиферативную активность лейкоцитов. Иммунология.-1996.-N3.- С.30-33

10. Вплив ниркових поліпептидів на гемокоагуляцію та пере­кисне окислення ліпідів при гострому емоційно-больовому стресі. Фізіологічний журнал.- 1996.-Т.42,N5-6.-С.39-43

11. Влияние почечных пептидов-цитомединов на гемокоагуляцию и перекисное окисление липидов при экспериментальном нефрите Хеймана.Патологическая физиология.- 1991.-N 5.-С. 35 - 36 (Соавторы Мищенко В.П., Силенко Ю.И., Хавинсон В.Х.).

12. Вплив регуляторних ниркових поліпептидів на гемокоагу­ляцію і перекисне окислення ліпідів при фтористій інтокси­каціі. Физиологический журнал.- 1993.- Т.39, N 2-3.-С.67-71. (Співавтори Катрушов А.В., Міщенко В.П.).

13. Методические подходы к проведению скрининга биологической активности пептидных веществ. Проблеми екології та медиціни. -1997.-T1,N1-2.-C.12-17. (Співавтор Катрушов А.В.).

14. Изучение терапевтической активности синтетических пепти­дов-аналогов естественного пептидного комплекса почек на неко­торые показатели гомеостаза у хомяков при аутоимунном нефрите. Проблеми екології та медиціни.-1997.-T1,N1-2.-C.24-26. (Співавтор Гейко О.А.).

15. Специфічні зміни гемостатичної реактивності тварин в несприятливих умовах зовнішнього середовища та їх корекція за допомогою органних пептидних екстрактів. Вестник проблем био­логии и медицины.-1997.-N25.-C.19-26.

16. Влияние пептидного комплекса почек на экспрессию поверх­ностных рецепторов лимфоцитов в условиях связывания внеклеточ­ного кальция. Проблеми екології та медици­ни.-1998.-2,N1-2.-C.34-37.(Співавтори Веснина Л.Э., Соколенко В.Н.).

17. Вплив ниркових пептидів на морфофункціональний стан тімуса за фізіологічних умов та під час розвитку аутоімунного нефрита. Проблеми екології та медицини.-1998.-2,N1-2.-C.38-40.

18. Взаимодействие пептидсвязывающих белков Hsp70 с пептидным экстрактом почек. Вестник проблем биологии и медици­ны.-1998.-N11.-C.67-70.

19. Вплив пептидного комплексу нирок на процеси імунітету та неспецифічної резистентності за умов полікомпонентної імунопа­тології. Вестник проблем биологии и медицины.-1998.-N11.-C.63-67.

20. Участие пептидного комплекса почек в регуляции экспрессии некоторых рецепторов  лейкоцитов.  Иммунология. -1998. -N4.-C.13-16. (Співавт. Веснина Л.Є.).

21. Препарат тканинних біологічно активних речовин який має регенераторну дію та спосіб його одержання. Патент України N5743. (Спіавтори О.В.Катрушов О.І.Цебржинський, Чумаков О.В., Лисенко С.М., Закладний В.П., Сухотинський В.Л.).

22. А.с.10180А. Україна. МКІ 5 А61 К37/00. Спосіб одержання біологічно активної речовини, що має регенераторну та  модулю­ючу дію/ Промислова власність.-1996.-N3.-C.3.1.76-3.1.77. (Співавтор О.В.Катрушов).

23. Consesnsus sequence of peptide fractions' pool obtained from kidney' cortex substances and its immunoregulative influence. European Journal of Physiology// 1995.-V.430, N4.-R48.

24. The new group of biological regulators for multicellular systems - peptides of major histocompartibility complex/Biological Chemistry.-1998.-v.379,September, Suppl..-S.82.

25. Влияние почечных пептидов-цитомединов на гемостаз, пере­кисное окисление липидов и некоторые показатели неспецифи­ческой рези стентности организма при экспериментальном нефри­те. Тезисы докладов научнопрактической конференции "Поиск но­вых лекарственных средств и их использование в клинике", Чита, 1990, с. 11 (Співавтор Силенко Ю.И.).

26. Влияние почечных полипептидов-цитомединов на гемостаз, перекисное окисление липидов и некоторые показатели неспецифи­ческой резистентности организма. Сборник материалов XIII съез­да Украинского физиологического общества, Харьков,1990,с. 128. (Співавтори Мищенко В.П., Ксенз И.В.).

27.Использование полипептидного препарата почек в эксперимен­тальной терапии. "Регуляторные полипептиды в норме и патоло­гии" Сб. научн. работ под ред. Б.И.Кузника.Чита,1991, с. 24.

28. Вплив полiпептидiв,видiлених з нирок, на процеси пе­роксидного окислення лiпiдiв i зсiдання кровi. Тези доповiдей VI Українського бiохiмiчного з'iзду. Киiв. 1992. Частина 1.,С.187. (Співавтои Куценко Л.О. Нарижнюк Н.Д. Боброва Н.А.).

29.Влияние биорегулятора полученного из почек, на перекисное окисление липидов, гемостаз и неспецифическую резистентность организма. Тезисы симпозиума "Пептидные биорегуляторы-цитоме­дины", Санкт-Петербург,1992,С.72-73.(Співавтори Катрушов А.В., Мищенко В.П.).

30. Возможность межсистемного подхода в изучении механизмов действия цитомединов. Тезисы симпозиума "Пептидные биорегуля­торы-цитомедины", Санкт-Петербург,1992, С.73-74.(Співавтори Катрушов А.В., Мищенко В.П.).

31. Пептидергічна регуляція препаратами цитомедінів в ор­ганізмі. Научные труды третьего международного симпозиума " Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе", Киев, 10-13 ноября 1993, Киев-1993,С.91-96. (Співавтори Катру­шов О.В., Цебржинський О.І., Міщенко В.П.).

32. Створення синтетичного пептидного препарату - аналогу природного пептидного комплекса нирок. Сучасні проблеми фарма­кології/ Тези доповідей І національного з'їзду фармакологів України. -Київ, 1995.-С.69.

33. Перспективи створення нових лікарських засобів поліпеп­тидної природи. Сучасні проблеми фармакології/ Тези доповідей І національного з'їзду фармакологів України.-Київ, 1995.-С.70.

34. Імунобіологічна активність природного пептидного комп­лексу нирок та його синтетичних аналогів. Збірка тез І Національного конгресу України з імунології, алергології та імунореабілітації (Алушта, 13-15 травня 1998).-Київ, 1998.-С.88.