|
Міністерство Охорони Здоров’я УКРАЇНИ
національний медичний університет
імені о.о. богомольця
АНАСТАСІЙ ЛІЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА
УДК: 616.379-008.64:616.155.3
ПРОЗАПАЛЬНІ ЦИТОКІНИ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ НА ПОЧАТКОВИХ ЕТАПАХ ФОРМУВАННЯ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ
1 ТА 2 ТИПУ
14.03.08 –імунологія та алергологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Українському науково-практичному центрі ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України.
Науковий керівник
доктор медичних наук, професор
Малижев Вадим Олексійович
Український науково-практичний центр
ендокринної хірургії, трансплантації
ендокринних органів і тканин МОЗ України,
завідувач лабораторії клінічної імунології.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Мельников Олег Феодосійович, Інститут отоларингології імені проф. О.С. Коломійченка АМН України, завідувач лабораторії патофізіології та імунології;
доктор медичних наук, професор Чумак Анатолій Андрійович, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії молекулярної біології відділу клінічної імунології.
Провідна установа
Інститут фтизіатрії та пульмонології імені Ф.Г. Яновського, лабораторія імунології, АМН України, м. Київ.
Захист відбудеться 16.02.2006 р. о 13-30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця (Київ, вул. Шовковична, 39/1. Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, Київ-057, вул. Зоологічна, 1).
Автореферат розісланий 06.01.2006 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор Свирид С.Г.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Впродовж останніх 20 років захворюваність на діабет як 1-го, так і 2-го типів у всьому світі значно зросла та набула епідемічного характеру [Zimmet P., 2001], тому дослідження питань патогенезу цих захворювань мають велике соціальне і медичне значення.
Діабет 1-го типу належить до класичних органоспецифічних аутоімунних захворювань. Для нього характерний переважний розвиток клітинних імунних реакцій, ефектори яких, Т-цитотоксичні лімфоцити, виконують руйнівну дію щодо бета-клітин [Alkinson M.A., 1994]. Паралельно у цьому процесі важливу, якщо не вирішальну, роль відіграють прозапальні цитокіни активованих макрофагів і Т-лімфоцитів, а саме: інтерлейкін-1 (ІЛ-1), тумор-некротичний фактор альфа (ТНФα) та інтерферон-гамма. Їх взаємодія з бета-клітинами призводить до накопичення в останніх оксиду азоту та інших вільних радикалів, що активують гени програмованої смерті, продукти яких ініціюють апоптоз інсулінопродукуючих клітин [Rabinovitch A., 1998].
За цукрового діабету 2-го типу характерними є інсулінорезистентність і повільне прогресуюче падіння синтезу інсуліну [Gerich J.E., 1998]. Обидва ці феномени формуються внаслідок дії низки чинників, серед яких велике значення мають прозапальні цитокіни. Руйнування бета-клітин за даного типу діабету може здійснюватися за рахунок стимулюючої дії ТНФα на синтез ІЛ-1 резидентними макрофагами острівців із подальшою взаємодією його з бета-клітинами [Kwon G., 1999], та/або внаслідок цитотоксичної дії вільних жирних кислот, що накопичуються в останніх завдяки ліполітичній дії ТНФα [Unger R.H., 1997].
Отже, за цукрового діабету обох типів прозапальні цитокіни відіграють вирішальну роль щодо втрати бета-клітинами інсулінопродукуючої функції, з одного боку, а з іншого – вони ж причетні і до формування інсулінорезистентності, яка найбільш характерна для діабету 2-го типу [Greenberg A.S., 2002]. Слід також зазначити, що продукція прозапальних цитокінів за діабету 1-го типу є результатом активації специфічних імунних реакцій адоптивного імунітету [Roep B.O., 2003 ]. За діабету 2-го типу їх синтез пов’язано з дисфункцією жирової тканини або з патологією вродженого імунітету [Pickup J.C., 1998; Felber J.P., 2002].
Проте питання щодо ролі прозапальних цитокінів у патогенезі цукрового діабету 1-го та 2-го типів залишається далеко не визначеним. Результати низки досліджень цитокінового профілю в периферичній крові хворих тварин і людей, клітинного та цитокінового спектру in situ та результати, що отримані в дослідах in vitro в умовах культури клітин, виявилися фрагментарними та суперечливими. Тому вони не можуть бути використані для детальнішого аналізу ролі означених біологічно активних речовин в генезі цукрового діабету 1-го та 2-го типів. Немає і можливості визначити їх цінність для моніторингу перебігу та лікування цукрового діабету, що само по собі є складною задачею за багатьох патологій [Бережна Н.М., 2004]. Ці обставини вимагають подальшого дослідження проблеми, вирішення якої, безперечно, є актуальним для клінічної імунопатології цукрового діабету.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи тісно пов’язана та органічно витікає з науково-дослідних робіт, які виконувалися в лабораторії клінічної імунології Українського науково-практичного центру ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України у 2000-2004 роках: “Функціонування макрофагально-хелперної ланки імунітету на ранніх етапах розвитку цукрового діабету типу 1 та 2” (№ держреєстрації 0101U002690) і “Стан неспецифічної ланки імунітету при розвитку цукрового діабету типу 2” (№ держреєстрації 0102U000740).
Мета роботи. Оцінити діагностичну та прогностичну значущість визначення вмісту прозапальних цитокінів у периферичній крові на початкових етапах формування цукрового діабету 1-го та 2-го типів у хворих людей.
Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:
- Дослідити вміст ТНФα, ІЛ-1β, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові осіб групи ризику щодо розвитку цукрового діабету 1-го типу.
- Визначити вміст ТНФα, ІЛ-1β, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові хворих із вперше виявленим цукровим діабетом 1-го типу.
- Дослідити можливість визначення вмісту в периферичній крові прозапальних цитокінів як маркерів перебігу аутоімунного руйнування β-клітин.
- Дослідити вміст цитокінів (ТНФα, ІЛ-1β, ІЛ-10 та ІЛ-12) у хворих із вперше виявленим цукровим діабетом 2-го типу.
- Визначити характер зв’язку між рівнем цитокінів і станом метаболізму у хворих на цукровий діабет 2-го типу.
- Дослідити особливості розподілу основних популяцій лімфоїдних клітин та субпопуляцій Тх1 і Тх2 лімфоцитів у периферичній крові хворих на цукровий діабет 1-го та 2-го типів.
- З’ясувати діагностичну та прогностичну цінність визначення цитокінів у периферичній крові хворих на цукровий діабет 1-го та 2-го типів.
Об’єкт дослідження: механізми формування неспецифічних імунних реакцій.
Предмет дослідження: вміст імуноцитів і прозапальних цитокінів у периферичній крові хворих на перших етапах формування цукрового діабету 1-го та 2-го типів.
Методи дослідження: загальноклінічні, імуногенетичні, цитофлуориметричні, імуноферментні, радіоімунні, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Основні положення, що характеризують новизну результатів дослідження та виносяться на захист, зводяться до такого:
- Перебіг цукрового діабету 1-го та 2-го типу супроводжується певними змінами системного вмісту таких цитокінів, як ТНФα, інтерлейкін-1β, інтерлейкін-10 та інтерлейкін-12. Ці зміни, з одного боку, відображають перебіг даної патології, а з іншого – є причиною формування різних її проявів.
- Формування та розвиток цукрового діабету 1-го типу відбувається на тлі підвищеної продукції інтерлейкіну-12 і генерації Тх1-лімфоцитів, що може віддзеркалювати певну поломку механізмів підтримання імунної толерантності на периферії та пояснювати переважання розвитку за цього захворювання клітинних реакцій аутоагресії.
- Вміст у сироватці крові хворих на цукровий діабет 1-го типу ТНФα корелює зі ступенем руйнування β-клітин, виступаючи маркером інтенсивності перебігу запального процесу в острівцях Лангерганса.
- Формування цукрового діабету 2-го типу супроводжується розвитком хронічного стресу, що є причиною характерної для даної патології вторинної імунної недостатності, яка характеризується зниженням кількості в периферичній крові основних субпопуляцій лімфоїдних клітин.
- За цукрового діабету 2-го типу відбуваються певні зміни вмісту прозапальних цитокінів у периферичній крові. Знайдено, що ТНФα тісно пов’язаний із формуванням інсулінової резистентності, тоді як інтерлейкін-1 може бути одним із чинників, які впливають на характер функціонування β-клітин підшлункової залози – від стимуляції до інгібіції, що є характерним для динаміки розвитку цукрового діабету цього типу. Водночас, притаманні даному захворюванню метаболічні зсуви, зокрема гіперглікемія, є причиною довготривалого збереження підвищеної активності цитокін-продукуючих елементів і тим самим сприяють прогресуванню хвороби.
Практичне значення. Отримані дані вказують на суттєву роль прозапальних цитокінів у процесах формування та перебігу цукрового діабету 1-го і 2-го типів, що може бути використано як додаткові критерії діагностики, прогнозування та моніторингу даних захворювань.
На основі проведених досліджень запропоновано для окреслення ступеня ризику розвитку цукрового діабету 1-го типу визначати у периферичній крові інтерлейкін-12 як доповнюючий критерій, спроможний значно підвищити надійність передклінічної діагностики. Доцільним, на нашу думку, є динамічне визначення в крові хворих із вперше діагностованим цукровим діабетом 1-го типу ТНФα як маркера інтенсивності імунного запалення для планування тактики лікування цієї патології, включаючи імунотропну та протизапальну терапію.
Визначені системне підвищення рівня прозапальних цитокінів у крові хворих на вперше виявлений цукровий діабет 2-го типу та їх роль у формуванні метаболічних зсувів є свідченням того, що дана патологія перебігає на тлі хронічного запального процесу. Це обумовлює доцільність використання в клінічній практиці не лише цукрознижувальних препаратів, але й комплексної терапії, спрямованої на пригнічення запалення та синтезу прозапальних цитокінів.
Особистий внесок здобувача. Ідеї дисертаційної роботи запропоновано науковим керівником д.мед.н. Малижевим В.О. Разом із науковим керівником створено методологічну основу роботи, адекватну меті та завданням. Автором самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз літературних даних, зібрано матеріал, виконано імунологічні дослідження, їх обґрунтування та статистичну обробку отриманих даних, сформульовано основні висновки та практичні рекомендації. Імуногенетичні дослідження (фенотипування) виконано спільно зі співробітниками лабораторії імунології Інституту хірургії та трансплантології АМН України. Запозичення дослідів інших авторів відсутні.
За цикл робіт за темою дисертації автора було відзначено стипендією Кабінету Міністрів України (2000-2001 рр.).
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлено та обговорено на конференціях і з’їздах: ІV Українська науково-практична конференція з актуальних питань алергології, клінічної та лабораторної імунології (Київ, 1999); Науково-практична конференція, присвячена 80-річчю Інституту фармакотерапії ендокринних захворювань “Актуальні проблеми фармакотерапії ендокринних захворювань” (Харків, 1999); 36-ий Щорічний конгрес EASD (Єрусалим, Ізраїль, 2000); V Науково-практична конференція “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології” (Київ, 2000); 17-ий Конгрес Міжнародної діабетичної федерації (Мехіко, Мексика, 2000); Науково-практична конференція “Цукровий діабет 2 типу – епідемія ХХІ сторіччя. Сучасне та майбутнє” (Київ, 2003).
Публікації. Основні положення дисертації представлені у 12 публікаціях у вітчизняних і зарубіжних виданнях і повністю відображають матеріали дисертаційної роботи. Серед них 5 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 7 – у матеріалах і тезах конференцій і конгресів.
Структура дисертації. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу, в якому викладено матеріали та методи дослідження, 2 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій і списку використаних літературних джерел. Загальний обсяг дисертаційної роботи складає 140 сторінок машинописного тексту, включаючи 17 таблиць і 21 рисунок. Список використаних джерел містить 212 публікацій, серед них 18 – кирилицею та 194 – латиницею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Досліджено 253 хворих на цукровий діабет 1-го та 2-го типів.
Для формування групи дітей і підлітків з ознаками схильності до захворювання на діабет обстежено дітей від 128 сімей, в яких зареєстровано випадки захворювання на цукровий діабет 1-го та 2-го типів. Внаслідок проведеного моніторингу відібрано 33 дітей і підлітків із фенотипом DR3+, DR4+ і DR3+/DR4+. У даної групи осіб (перша досліджувана група) у подальшому визначали вміст у периферичній крові таких цитокінів, як IЛ-1β, ТНФα, IЛ-10, IЛ-12.
Другу досліджувану групу (80 хворих) склали хворі з вперше виявленим цукровим діабетом 1-го типу (ЦД1) і терміном захворювання до 5 років.
Третя група складалася з 45 хворих із вперше виявленим цукровим діабетом 2-го типу (ЦД2) віком від 41 до 76 років і тривалістю захворювання (за анамнестичними даними) від 0,5 місяця до 3 років.
Контрольну групу представлено 82 практично здоровими донорами відповідного віку і статі.
Усі хворі на ЦД1 під час спостережень перебували на інтенсивній інсулінотерапії. Хворим на цукровий діабет 2-го типу призначали секретагог інсуліну – репаглінід (НовоНорм, Данія). Репаглінід не проявляє екстрапанкреатичної дії, а отже, і це суттєво, він не може прямо впливати на продукцію прозапальних цитокінів як жировими клітинами, так і макрофагами. Доза репаглініду добиралася для кожного хворого індивідуально та коливалася від 0,5 до 3,0 мг на прийом перед кожним вживанням їжі.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою методів варіаційної статистики та кореляційного аналізу. Вивчали також характер функціональних взаємозв’язків між одержаними параметрами з урахуванням аналітичного представлення для непараметричної регресії з побудовою відповідних графіків [Лапач С.Н., 2000].
Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення. При дослідженні дітей з ознаками схильності до розвитку цукрового діабету встановлено, що 63,6% із них народилися у сім’ях, в яких батько або мати хворіють на ЦД1, а 36,4% - на ЦД2. Результати вивчення вмісту цитокінів у периферичній крові цих дітей представлено в табл. 1, з якої видно, що за відсутності ознак порушень вуглеводного обміну у них визначається достовірне зниження рівня С-пептиду в сироватці крові, на тлі чого відбувається збільшення концентрації цитокінів, характер розподілу яких залежить від типу цукрового діабету у родичів. Так, у дітей із позитивним сімейним анамнезом на ЦД1 достовірно збільшився рівень у крові TНФα та IЛ-12 (р<0,05). Водночас за наявності ЦД2 у сім’ї спостерігалося збільшення в крові дітей концентрації IЛ-1β і TНФα.
Таблиця 1
Вміст цитокінів у периферичній крові дітей і підлітків,
у сім’ях яких зареєстровано захворювання на цукровий діабет
Примітка. * – p< 0,05 відносно контрольної групи.
Отже, встановлено, що, по-перше, успадковуватися може не лише цукровий діабет 1-го, а й 2-го типу. По-друге, вже на етапі схильності до захворювання знайдено зміни у концентрації ряду цитокінів. Дітям від батьків, хворих на ЦД1, притаманне збільшення вмісту TНФα та IЛ-12. Останній у цьому випадку представляє особливий інтерес, оскільки він є специфічним індуктором розвитку клітинних реакцій імунітету, що характерно для цукрового діабету саме 1-го типу. Інша картина спостерігалася в осіб групи ризику, в сім’ях яких діагностувався ЦД2. Характерним для останніх було достовірне збільшення в крові вмісту IЛ-1β та TНФα.
Наступні дослідження були спрямовані на вивчення рівня циркулюючих цитокінів в осіб з клінічно-визначеним цукровим діабетом, які були розподілені на групи з С-пептид-позитивним та С-пептид-негативними діабетом (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст цитокінів у периферичній крові хворих
на цукровий діабет 1-го типу
Примітки: * – р<0,001 відносно донорів; ** – р<0,01 відносно донорів;
*** – р<0,05 відносно донорів.
Хворі з вперше виявленим ЦД1 мали вірогідно вищі показники рівнів IЛ-1β (р<0,01), TНФα (р<0,01) та IЛ-12 (р<0,01) відносно донорів. При цьому співвідношення IЛ-12/IЛ-10 перевищувало аналогічне у донорів у 3,1 разу.
Група обстежених, термін хвороби яких складав менше року, вірогідно відрізнялась від донорів лише за вмістом IЛ-12 (р<0,05). Зростання терміну захворювання супроводжувалося появою вірогідних відмінностей між вмістом прозапальних цитокінів у хворих і донорів. Цікавими виявилися дані щодо вмісту інтерлейкінів у хворих на ЦД1, в яких була відсутня власна інсулінопродукція. Вміст IЛ-1β та IЛ-12 також вірогідно відрізнявся від такого у донорів та у хворих із С-пептид-позитивним діабетом. У них зберігалося і високе співвідношення IЛ-12/IЛ-10.
Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що у хворих на С-пептид-позитивний ЦД1 відбувається системне збільшення концентрації IЛ-1β, TНФα та IЛ-12. Ці дані можуть свідчити про ймовірний запальний процес в острівцях Лангерганса за умови збереження залишкової кількості β-клітин, а отже і специфічного антигенного стимулу.
Більш вагомими, на наш погляд, є отримані результати щодо системної концентрації IЛ-12. Вражаючим є той факт, що вірогідне збільшення його вмісту в крові визначалося як у хворих на С-пептид-позитивний, так і на С-пептид-негативний ЦД1. Саме це може бути причиною відхилення імунної відповіді у бік розвитку клітинних імунних реакцій за ЦД1, оскільки IЛ-12 індукує диференціювання Тх1 лімфоцитів. У хворих на С-пептид-негативний ЦД1 паралельно визначено і збереження підвищеного рівня в крові IL-1β. Опосередковано це може вказувати на певну активацію функціональної активності макрофагів, не пов’язану з антигенною стимуляцією. Можна припустити, що така активація макрофагів і пов’язана з нею гіперпродукція IЛ-12 є конститутивно обумовленими, що, можливо, є основною причиною формування ЦД1 у генетично схильних до цієї хвороби людей.
Характер розподілу IЛ-10 та IЛ-12, визначений нами, передбачає і відповідні зміни вмісту основних субпопуляцій Т-хелперів – Тх1 і Тх2. Не виключено також, що диспропорція регуляторних цитокінів може певною мірою вплинути і на субпопуляційний склад лімфоїдних клітин у цілому. Але, попри наявність запальної імунної реакції в острівцях Лангерганса, ми не виявили жодних змін у субпопуляційному складі лімфоїдних клітин у периферичній крові. Можливо, це пояснюється кінцевим етапом запальної реакції та відносно невеликою кількістю лімфоїдних клонів, задіяних у патологічному процесі.
Більш показовими є дані, які було одержано при дослідженні кількості Тх1 і Тх2 клітин. Знайдено, що у хворих на цукровий діабет відбувається збільшення відносної кількості Тх1 лімфоцитів порівняно з їх вмістом у донорів (р<0,05). Паралельно визначалося і збільшення співвідношення Тх1/Тх2 – від 1,26±0,1 у донорів до 2,5±0,4 у дітей, хворих на ЦД1 (р<0,05). Отже, на фазі С-пептид-позитивного ЦД1 у крові хворих відбувається не лише зростання концентрації IЛ-12, але й збільшення числа Тх1 лімфоцитів, що є відображенням переважаючого перебігу в осередку запалення (острівці Лангерганса) клітинних реакцій імунітету.
Щодо цукрового діабету 2-го типу, основною метою досліджень було визначення вмісту прозапальних цитокінів у периферичній крові хворих із вперше виявленим ЦД2 та їх взаємозв’язку з основними метаболічними і гормональними порушеннями.
Досягнення за допомогою репаглініду стану компенсації вуглеводного обміну, за даними вимірювання рівня глюкози та глікованого гемоглобіну, супроводжувалося поліпшенням самопочуття хворих, зменшенням вмісту С-пептиду, сироваткового інсуліну, тригліцеридів, СТГ, коливаннями вмісту конрінсулярних гормонів та холестерину.
На тлі зареєстрованих метаболічних порушень знайдено певні зміни і в концентрації цитокінів у периферичній крові хворих. Як видно з табл. 3, у нелікованих пацієнтів визначається достовірно підвищений рівень у крові TНФα з одночасним збільшенням концентрації IЛ-10 і зменшенням співвідношення IЛ-12/IЛ-10 – з 47,96 у донорів до 7,83 у нелікованих хворих. Протягом лікування відбувалося зниження рівня в крові IЛ-1β, яке досягало вірогідності через 4 місяці після початку лікування (р<0,01). Щодо TНФα ситуація дещо інша. Через 1 місяць після лікування відбувалося суттєве збільшення його концентрації в крові, яка майже у 3 рази перевищувала нормальний рівень (р<0,001). Проте через 4 місяці вміст цього цитокіну в крові знижувався і практично досягав рівня показників донорів. Лікування хворих протягом 1 місяця не викликало змін концентрації в крові IЛ-10, але через 4 місяці після застосування репаглініду вона знизилася нижче контрольного рівня більше ніж у 3 рази (р>0,05). Поліпшення метаболізму глюкози під впливом репаглініду не позначилося на вмісті в крові іншого цитокіну, а саме IЛ-12.
Проведені кореляційний та регресивний аналізи дозволили зробити припущення про існування певних функціональних зв’язків між цитокінами та показниками метаболізму.
Таблиця 3
Вміст цитокінів у периферичній крові хворих на цукровий діабет
2-го типу перед і під час лікування репаглінідом
Примітки: * – р<0,001 порівняно з донорами; ** – р<0,02 порівняно з донорами; ′ – р<0,02 порівняно з хворими перед лікуванням; ″ – р<0,01 порівняно з хворими перед лікуванням.
У цілому, на основі одержаних даних можна дійти висновку, що дійсно прозапальні цитокіни ТНФα та ІЛ-1 відіграють важливу роль у формуванні основних метаболічних зсувів за ЦД2.
Щодо ТНФα, у хворих перед лікуванням між цим цитокіном і показниками глюкози та С-пептиду явного кореляційного зв’язку не виявлялось, і він набував значущості лише за умов стабілізації вуглеводного обміну. Це підтверджується і характером кривих апроксимуючих залежностей між ТНФα та глюкозою (рис. 1) і ТНФα та С-пептидом (рис. 2), з яких видно, що у цій ситуації з’являється пряма концентраційна залежність між даним цитокіном і рівнем у периферичній крові глюкози і С-пептиду.
Даний факт є вагомим свідченням причетності ТНФα до означених метаболічних змін. Підтверджує це і виявлення у хворих підвищеного коефіцієнту інсулінової резистентності, величина якого, як відомо, залежить від блокади інсулінової сигнальної системи, здійснюваної ТНФα.
Рис. 1. Взаємозв’язок ТНФα з рівнем глюкози в периферичній крові.
1 – донори, 2 – хворі на ЦД2 перед лікуванням, 3 – через 1 місяць після лікування, 4 – через 4 місяці після лікування.
| 
