|
УКРАЇНСЬКА ФАРМАЦЕВТИЧНА АКАДЕМІЯ
МАЛИЙ Володимир Валентинович
УДК 547.56:547.978.8:547.98:581.9(477)
ПОШУК НОВИХ ВІТЧИЗНЯНИХ РОСЛИННИХ
ДЖЕРЕЛ ЕЛАГОВОЇ КИСЛОТИ
15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків - 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі ботаніки Української фармацевтичної академії, Міністерство охорони здоров’я.
Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор
Сербін Анатолій Гаврилович
Українська фармацевтична академія,
завідувач кафедрою ботаніки
Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор
Ковальов Володимир Миколайович
Українська фармацевтична академія,
завідувач кафедрою фармакогнозії
доктор фармацевтичних наук, професор
Доля Віктор Семенович
Запорізький державний медичний університет,
завідувач кафедрою фармакогнозії
Провідна організація: Державний науковий центр лікарських засобів, лабораторія хімії та технології фенольних препаратів м. Харків
Захист відбудеться «2» липня 1999 р. о 1200 год. На засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 64.605.01 при Українській фармацевтичній академії.
310002, м.Харків, вул.Пушкінська, 53
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Української фармацевтичної академії (310168, м.Харків, вул. Блюхера, 4)
Автореферат розісланий « 1 » червня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої Ради І.С.Гриценко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Значення лікарських рослин останнім часом зростає в зв’язку з тим, що вони мають меншу токсичність та побічну дію в порівнянні з синтетичними. Пошук додаткових джерел біологічно активних фенольних сполук, створення фітопрепаратів, раціональна та комплексна переробка рослинної сировини, та одночасне використання різних груп біологічно активних речовин є важливими задачами сучасної фармації.
В процесі виробництва «Альтану» (оригінального фенольного препарату з суплідь вільхи клейкої ТФС 42-42У-4/42/37-883-98) утворюється як побічний продукт виробництва в значних кількостях неочищена елагова кислота, що за результатами фармакологічного скрінінгу має біологічну активність. Елагова кислота (дилактон гаксаоксидифенової кислоти) - фенолкарбонова кислота, поширена в рослинному світі в вільному стані та як складова частина елаготанінів проявляє кровоспинну, антивірусну, цитотоксичну, антиоксидантну, протипухлинну активність. Крім того, на її основі за кордоном створено ряд фармацевтичних засобів.
Зважаючи на вищесказане, пошук доступних вітчизняних джерел елагової кислоти та відпрацювання технології її отримання з офіцинальної сировини - суплідь вільхи при комплексній переробці сировини є актуальним і перспективним.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на кафедрі ботаніки Української фармацевтичої академії у 1996-1999 рр. у відповідності з планом науково-дослідницьких робіт УкрФА ( № державної реєстрації 0198 У 007 008).
Мета і задачі дослідження. Метою нашої роботи явився пошук додаткових сировинних джерел елагової кислоти, дослідження хімічного складу фенольних сполук цих рослин, кількісне визначення їх вмісту, а також розробка технології отримання неочищеної елагової кислоти з суплідь вільхи, та її стандартизація.
Для досягнення цієї мети потрібно було вирішити слідуючі задачі:
- вивчити якісний склад фенольних сполук рослин вітчизняної флори, аналізуючи сировину на наявність елагової кислоти та інших фенолкарбонових кислот, флавоноїдів та дубильних речовин; вилучити компоненти фенольної природи в індивідуальному стані та встановити їх структуру;
- розробити технологію одержання неочищеної елагової кислоти з суплідь вільхи в безперервному технологічному циклі отримання «Альтану»-субстанції, а також застосувати її на інших видах сировини, що містить елагову кислоту чи елаготаніни;
- розробити методику кількісного визначення елагової кислоти в отриманій субстанції, а також визначити кількісний вміст різних груп фенольних сполук в рослинах, що вивчалися;
- розробити нормативно-технічну документацію на неочищену елагову кислоту.
Наукова новизна одержаних результатів.
Вперше проведений порівняльний аналіз пагонів та листків 21 виду поширених рослин родин Розоцвіті, Березові, Липові, Кленові, Букові на наявність фенолкарбонових кислот, флавоноїдних сполук та дубильних речовин гідролізуємої та конденсованої груп.
З різних видів рослин в індивідуальному стані виділені 12 сполук фенольної природи: 4 похідних бензойної кислоти - протокатехова кислота, галова кислота, етилгалат, елагова кислота; 4 похідних оксикоричних кислот - кофейна, нео- , ізо-, хлорогенова кислоти; флавоноїдні похідні - кемпферол, кверцетин, мірицетин та гіперозид. Вперше виділені елагова кислота з пагонів бузку звичайного, горобини звичайної, груші звичайної, сливи домашньої, тополі білої та яблуні домашньої, кверцетин, мірицетин з пагонів горобини звичайної, гіперозид з пагонів клена польового.
Розроблена технологія отримання неочищеної елагової кислоти з суплідь вільхи .
Вперше розроблена методика кількісного визначення елагової кислоти спектрофотометричним методом.
Методика вилучення елагової кислоти, розроблена для суплідь вільхи апробована на інших видах сировини - пагонах верби білої, малини звичайної та інших.
Визначений кількісний вміст оксикоричних кислот та флавоноїдів в видах сировини, що містять їх значні кількості, спектрофотометричним методом в розрахунку на хлорогенову кислоту та гіперозид відповідно.
Визначений кількісний вміст дубильних речовин за допомогою двох методів - комплексонометричного та перманганатометричного ДФ ХI видання, в пагонах та листках ряду рослин.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблена технологія одержання неочищеної елагової кислоти, що має кардіопротекторну та антиоксидантну дію, в виробництві «Альтану»-субстанції при комплексній переробці суплідь вільхи
Дана технологія оформлена регламентом та апробована в умовах НВЦ «Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод» м.Київ.
Розроблений проект ТФС на комплекс «неочищена елагова кислота» з суплідь вільхи. Методика кількісного визначення елагової кислоти в комплексі «неочищена елагова кислота» апробована в умовах НВЦ «Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод» м.Київ.
Дані хімічного вивчення деяких танідоносних рослин флори України впроваджені в учбовий процес Української фармацевтичної академії та Запорізького державного медичного університету.
Особистий внесок здобувача. На всіх етапах робота виконувалася дисертантом самостійно із застосуванням відповідних методик. Авторові належить вирішальна роль у вивченні хімічних властивостей вилучених сполук та в узагальненні літературних та експериментальних відомостей.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладено на міжнародній науково-практичній конференції по створенню та апробації нових лікарських засобів «Лекарства - человеку» (Москва, 1997) та на Четвертій міжнародній конференції з медичної ботаніки (Ялта, 1997).
Публікації. Основні результати дисертації відображені в 6 друкованих наукових працях, з яких 5 статей та 1 тези доповіді.
Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 120 сторінках машинописного тексту, містить 17 таблиць, 8 рисунків, 3 схеми. Складається зі вступу, 5 розділів, загальних висновків, списку літератури. Бібліографія включає 127 праць, зокрема 32 - іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вивчення рослин на наявність різних груп фенольних сполук та вилучення їх компонентів у індивідуальному стані
На підставі літературного пошуку вибрані поширені в Україні рослини, що містять вільну елагову кислоту чи дубильні речовини, та застосовуються в емпіричній медицині. Результати проведених якісних реакцій та хроматографічних досліджень на папері та тонкому шарі сорбенту свідчать про те, що всі рослини, які вивчались, вміщують значні кількості фенольних сполук, співвідношення різних груп цих сполук різне та індивідуальне для кожного виду.
Для подальшого вивчення виділені рослини 21 виду, що можуть стати перспективними джерелами отримання елагової кислоти. Проаналізовано склад інших груп фенольних сполук (оксикоричних кислот, флавоноїдів та дубильних речовин) цих рослин.
З 21 виду рослин в індивідуальному стані вилучено 12 сполук фенольної природи (перелік див. табл.1).
Таблиця 1.
Перспективні джерела елагової кислоти та інших фенольних сполук
Примітка: ====== - велика кількість речовини; ______ - досить значний вміст речовини, непідкреслені - присутність речовини в незначних кількостях, дужки - мінорні кількості речовини.
Структура даних сполук встановлена за допомогою фізичних, фізико-хімічних та хімічних методів.
Похідні бензойної кислоти. Речовини 1-4 віднесені до похідних бензойної кислоти на підставі якісних реакцій, даних УФ-, ІЧ-спектроскопії (див. табл.2). Відстутність депресії температури плавлення при змішуванні сполуки 1 з достовірним зразком протокатеховой кислоти, ряд констант (див. табл. 2) дозволив ідентифікувати її як 3,4-диоксибензойну, чи протокатехову, кислоту.
Метилювання сполуки 2 приводить до утворення метилгалату, а її етилювання - до утворення етилгалату, фізико-хімічні властивості яких співпадають із властивостями достовірних зразків метилового та етилового ефірів галової кислоти. Також ряд фізичних та фізико-хімічних показників (див. табл.2) дозволив ідентифікувати сполуку 2 як 3,4,5-триоксибензойну, або галову, кислоту.
Сполука 3 при при кислотному гідролізі утворює галову кислоту. Порівняння фізичних та фізико-хімічних властивостей виділеної сполуки 3 з етиловим ефіром галової кислоти показало їх повну аутентичність.
Ацетилювання сполуки 4 приводить до утворення тетраацетату елагової кислоти, порівняння наслідків хроматографування в ряді систем розчинників, даних елементного аналізу, УФ-, ІЧ-спектроскопіі дозволили охарактеризувати сполуку 4 як дилактон гексаоксидифенової кислоти, або елагову кислоту.
Похідні коричної кислоти. Сполуки 5-8 дають позитивну реакцію з розчином заліза (III) хлориду, що свідчить про їх фенольну природу. В УФ-світлі на хроматограмах ці сполуки мають блакитну чи синю флуоресценцію, що після обробки парами аміаку змінюється в блакитно-зелену або яскраво-
блакитну. В УФ-спектрах сполуки 5-8 мають характерні для похідних коричної кислоти смуги поглинання при 310-325 нм та 246-250 нм. Результати лужної деструкціі, кількісного лужного гідролізу, аналіз зсувів спектрів в УФ-області при додаванні іонізуючих та комплексоутворюючих домішок, в порівнянні з достовірними зразками оксикоричних кислот довели, що сполука 5 - це 3,4-диоксикорична (кофейна) кислота, сполука 6 - 3-О-кофеіл-D-хінна (хлорогенова) кислота, сполука 7 - 5-О-кофеіл-D-хінна (неохлорогенова) кислота, сполука 8 - ізохлорогенова киста (суміш 3,4- , 3,5- і 4,5-О-дикофеіл-D-хінних кислот).
Похідні флавоноїдів. Сполуки 9-12 віднесені до похідних флавон-3-олу за результатами якісних реакцій, даних УФ-, ІЧ-спектроскопії.
Сполуки 9-11 - це аглікони з різним ступенем заміщення кільця В оксигрупами. Сполука 12 - це моноглікозид та 3-О-глікозид, про що свідчить кількісний кислотний гідроліз, який протікає легко, та стійкість до лужного гідролізу. Приклад доведення структури флавоноїдних похідних на основі хімічних перетворень сполук 12 (гіперозиду) приведений на схемі 1. В результаті кислотного та ферментативного гідролізу сполуки 12 утворюється речовина 10 (кверцетин) і D-галактоза. Лужна деструкція сполуки 10 приводить до утворення флороглюцину та протокатеховой кислоти (див. схему 1), ацетилювання - до утворення пентаацетату кверцетину, а метилювання - до утворення пентаметилату кверцетину. На підставі проведеного комплексу досліджень встановлено, що сполука 9 - 3,5,7,4/-тетраоксифлавон (кемпферол); сполука 10 - 3,5,7,3/,4/-пентаоксифлавон (кверцетин); сполука 11-3,5,7,3/,4/,5/-гексаоксифлавон (мірицетин), сполука 12 - кверцетин-3-О-β-D-галактопіранозид (гіперозид).
Кількісне визначення домінуючих груп фенольних сполук в рослинній сировині
Розроблена методика кількісного визначення елагової кислоти в комплексі «неочищена елагова кислота», що є відходом виробництва та отримується в процесі одержання «Альтану»-субстанціі з суплідь вільхи. Методика базується на спектрофотометричному методі в перерахунку на елагову кислоту-стандарт. Вміст елагової кислоти в серіях отриманого комплексу в розрахунку на абсолютно суху речовину складає не менш ніж 60%. Результати приведені в таблиці 3. Отримані дані увійшли в розроблений проект ТФС на неочищену елагову кислоту з суплідь вільхи.
Таблиця 3.
Результати кількісного визначення елагової кислоти в комплексі «неочищена елагова кислота» із суплідь вільхи спектрофотометричним методом
За результатами попереднього хімічного дослідження виділені рослини, що містять значні кількості оксикоричних кислот (див. табл.1). В пагонах цих рослин визначений кількісний вміст оксикоричних кислот за допомогою спектрофотометричного методу в розрахунку на хлорогенову кислоту. Дані визначення приведені в таблиці 4. Перспективними джерелами похідних оксикоричних кислот можуть бути пагони тополі білої (понад 4%) та сливи домашньої (понад 3 %), а також пагони черешні звичайної та бузку звичайного (2,05 і 1,83 % відповідно).
Таблиця 4
Результати кількісного спектрофотометричного визначення суми оксикоричних кислот в пагонах деяких рослин (в розрахунку на абсолютно суху речовину, n=3)
Визначений кількісний вміст флавоноїдних сполук в пагонах та листках рослин, що містять їх значні кількості та вибрані на підставі досліджень хімічного складу (див. табл.1): листки берези повислої, клену польового, пагони тополі білої, черешні звичайної, яблуні домашньої, малини звичайної, верби білої, дерену звичайного, груші звичайної спектрофотометричним методом в розрахунку на гіперозид.
Перспективними джерелами флавоноїдних сполук можна вважати листки берези повислої, пагони тополі білої та листки клену польового (0,99; 0,98 та 0,74 % відповідно).
Виходячи з результатів попереднього хімічного дослідження фенольних сполук майже всі рослини, які вивчалися, містять значні кількості дубильних речовин. Ми визначали кількісний вміст в пагонах та листках деяких рослин, що вивчали, користуючись двома методами: загальноприйнятим перманганатометричним методом Левенталя-Нейбауера (ДФ ХI видання) та комплексонометричним методом, який останнім часом досить широко використовується для визначення кількісного вмісту дубильних речовин. Результати досліджень приведені на діаграмі (рис.1).
Отримані дані підтверджують те, що метод ДФ ХI більш придатний для аналізу сировини на вміст загальної суми фенольних сполук, ніж дубильних речовин, так як результати дуже завищені (в 8-25 разів) в порівнянні з результатами, отриманими за методом компексонометрії. Перспективними танідоносними рослинами є шипшина собача (пагони - понад 6% дубильних речовин за методом комплексонометрії) та малина звичайна, клен польовий, граб звичайний (листки - 4,52, 5,31 та 6,70 % дубильних речовин відповідно).
Розробка технології вилучення комплексу «неочищена елагова кислота» з суплідь вільхи та з інших видів рослинної сировини
Розроблена технологія одержання комплексу «неочищена елагова кислота» з суплідь вільхи клейкої, що утворюється в процесі виробництва «Альтану»-субстанції. Вона складається з екстракції суплідь вільхи 70%-ним етиловим спиртом з подальшим видаленням спирту з екстракту, обробкою упареного екстракту етиловим ефіром оцтової кислоти (стадії отримання «Альтану»-субстанції). Потім кубовий залишок витримували при рН середовища - 4-4,5; температурі - 2-4оС; та на протязі - 12-16 годин. Внаслідок цього отримували комплекс неочищеної елагової кислоти.
Розроблений лабораторний регламент отримання комплексу «неочищена елагова кислота» з суплідь вільхи. Технологія апробована в умовах НВЦ «Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод» м.Київ.
Запропонований спосіб застосували на інших видах сировини, що містить вільну елагову кислоту чи елаготаніни. Технологія відрізнялась значенням рН середовища та часом відстоювання. Вихід елагової кислоти по вищезгаданому способу з різної рослинної сировини представлений в таблиці 5.
Таблиця 5.
Вихід неочищеної та очищеної елагової кислоти з рослин флори України
| 
