|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ
Сіренко Артур Геннадійович
УДК 576.312.32.32/:38:616-006.446.2:612-076.5.
ПЕРЕДЧАСНЕ РОЗДІЛЕННЯ ЦЕНТРОМЕР МЕТАФАЗНИХ ХРОМОСОМ ЯК ПЕРСПЕКТИВНИЙ ДІАГНОСТИЧНИЙ І ПРОГНОСТИЧНИЙ МАРКЕР ПРИ ГОСТРІЙ ЛІМФОБЛАСТНІЙ
ЛЕЙКЕМІЇ У ДІТЕЙ
03.00.15. - генетика
Автореферат
дисертацiї на здобуття вченого ступеня
кандидата бiологiчних наук
Київ - 2000
Дисертацiєю є рукопис.
Робота виконана у Львiвському науково-дослiдному інститутi спадкової патологiї (м. Львiв, Україна), Мiнiстерство охорони здоров'я України.
Науковий керiвник: кандидат медичних наук
Акопян Гаяне Рубенiвна,
НДІ спадкової патології МОЗ України, завідуюча відділенням клінічної генетики.
Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук, професор
Малюта Станіслав Станіславович,
Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідуючий відділом молекулярної генетики;
Кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник
Глазко Тетяна Теодорівна,
Інститут агроекології та біотехнології УААН, завідуюча лабораторією генетики екологічних стресів.
Провiдна установа: Український науковий гігієнічний центр МОЗ України,
м.Київ, вул. Попудренка, 50.
Захист вiдбудеться: 5 жовтня 2000 року о 14-00 год.
на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д.26.202.01. в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії за адресою м. Київ - 143, вул ак. Заболотного, 148.
З дисертацiєю можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії за адресою: м. Київ - 143, вул ак. Заболотного, 148.
Автореферат розiсланий 2 серпня 2000 року.
Вчений секретар
спецiалiзованої вченої ради____________________Тарасенко Л.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.
Ефективне лікування дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) передбачає наявність об'єктивної інформації як про тип (підтип) лейкемії, так і про масштаби генного дисбалансу геному клітин лімфоїдного ряду внаслідок змін у структурі та (або) кількості хромосом. В залежності від характеру вторинних змін хромосом можна передбачити деякі ознаки пухлинного процесу і, зокрема, важкість перебігу, стійкість до традиційних схем хіміотерапії, ймовірність досягнення стійкої ремісії та ризик нового рецидиву захворювання. Визначальними критеріями щодо вибору тактики лікування та оцінки прогнозу ГЛЛ у дітей вважають наявність структурних перебудов хромосом та зміни у плоїдності каріотипу клітин у лейкемічних клонах. В останні роки піднімається питання про діагностичну та прогностичну цінність інших цитогенетичних ознак, які здатні спричиняти геномний дизбаланс: явищам поліплоїдії, ендоредуплікації та змінам у порядку розділення метафазних хромосом. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом (ПРЦ) вважається однією з найбільш вірогідних причин виникнення анеуплоїдного каріотипу клітини. Оскільки виразні варіації у кількості хромосом набору є типовою ознакою клітинної трансформації, припускається вагома роль ПРЦ у патогенезі пухлинного процесу.
Актуальність теми. Незважаючи на значний прогрес у дослідженні молекулярно-генетичних механізмів виникнення гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ), одного з найбільш поширених онкологічних захворювань дитячого віку, залишається відкритими питання патогенезу типових хромосомних трансформацій. Зміни плоїдності хромосомних наборів лейкемічних клітин вважаються однією з найбільш поширених клональних аномалій при ГЛЛ у дітей. Якщо утворення гіпердиплоїдних клонів можна пояснити порушеннями у системі цитокінезу, то втрата або набуття поодиноких хромосом вимагає цілком іншого обгрунтування. Виникнення анеуплоїдного каріотипу є наслідком порушень розділення хромосом в мітозі. Hа стадії метафази мітозу кожна хромосома візуалізується у вигляді двох ідентичних хроматид (сестринські хроматиди), кожна з яких містить ідентичну молекулу ДHК. Сестринські хроматиди з'єднані у ділянці центромери і лише під час анафази відбувається їх розділення і міграція до полюсів клітини вже у якості самостійних хромосом. Передчасне розділення центромер, скорочено ПРЦ, має місце, коли на стадії метафази сестринські хроматиди вже є розділені у ділянці центромери. Переважно ПРЦ захоплює одну або декілка хромосом клітини, тоді як решта хромосом зберігають характерну метафазну структуру. Якщо центромери розійшлися в усіх хромосомах каріотипу, таку мітотичну клітину вважають С-анафазою або передчасною анафазою. Актуальність ПРЦ полягає в тому, що це явище вважається одним із провідних механізмів нерозходження хромосом та виникнення анеуплоїдії каріотипу, тоді як функціональне значення С-анафази залишається невідомим.
Hа даний час передчасне розділення центромер не підлягає обов'язковій реєстрації при проведенні цитогенетичного дослідження. Попри це у авторитетному керівництві для цитогенетиків, виданому у Оксфорді у 1996-му році, даються рекомендації враховувати дане явище при аналізі метафазних хромосом. За даними літератури, існує широкий перелік захворювань, при яких ПРЦ та С-анафаза виявились невипадковими цитогенетичними ознаками клітини. Особливу увагу привертає значна поширеність ПРЦ при пухлинних захворюваннях. Під час каріотипування дітей, хворих на ГЛЛ та інші поширені гемобластози, ми часто реєстрували ПРЦ і С-анафази на препаратах хромосом клітин крові і кісткового мозку. Це природньо спричинило питання про інформативність урахування даного явища у цитогенетичній діагностиці гемобластозів. Для цього в даній роботі проводився порівняльний аналіз частоти клітин з передчасним розділенням центромер у здорових осіб та на різних етапах ГЛЛ у дітей, а також аналіз експресії даного явища в залежності від особливостей перебігу захворювання та стану клініко-лабораторних показників. Оскільки перебіг будь-якого онкологічного процесу є тісно пов'язаний із здатністю організму контролювати та обмежувати ріст трансформованих клітин, актуальним аспектом даної роботи було дослідження явища апоптозу (фізіологічної загибелі клітин) у взаємозв'язку з експресією передчасного розділення центромер та перебігом ГЛЛ у дітей.
Предметом дослідження було явище передчасного розділення центромер метафазних хромосом у клітинах кісткового мозку та периферичної крові дітей, хворих на ГЛЛ, та здорових осіб.
Об'єкт дослідження складали хромосоми культивованих клітин кісткового мозку і периферичної крові дітей, хворих на ГЛЛ, та здорових осіб.
Метою роботи було було дослідження інформативності використання явища передчасного розділення центромер метафазних хромосом в якості діагностичного та прогностичного маркера перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей. Цій меті були підпорядковані наступні завдання:
1. Дослідити частоту клітин з передчасним розділенням центромер на різних етапах перебігу ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей.
2. Дослідити взаємозв'язок явища ПРЦ з відомими клініко-лабораторними маркерами ГЛЛ у дітей.
3. Дослідити взаємозв'язок явища ПРЦ з виникненням анеуплоїдного стану каріотипу.
4. Дослідити взаємозв'язок між експресією ПРЦ та запрограмованою загибеллю клітин (рівнем апоптозу).
5. Дослідити інформативність ПРЦ у якості прогностичного критерію ГЛЛ у дітей.
Методи дослідження: культуральні, цитогенетичні, цитофлуориметричні, варіаційної статистики.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено експресію передчасного розділення центромер метафазних хромосом у культивованих клітинах кісткового мозку і крові при гострій лімфобластній лейкемії у дітей. Встановлено типові ознаки експресії даного явища в мітотичних клітинах кісткового мозку і крові у дитячому віці в нормі та на різних стадіях перебігу ГЛЛ, зокрема, його відтворення у стані С-анафази (повного розділення центромер всіх хромосом клітини) або передчасного розділення центромер поодиноких хромосом (ПРЦ) із залученням різної кількості хромосом певних груп. Встановлено статистично вірогідну відмінність в експресії даного явища при ГЛЛ та інших поширених гемобластозах у дітей, порівняно з контролем. Статистично обгрунтовано закономірність змін в експресії передчасного розділення центромер у гострій фазі ГЛЛ та на стадії ремісії. Встановлено відмінність в експресії С-анафази та ПРЦ у випадках повної і неповної ремісії ГЛЛ у дітей. З'ясовано функціональну різнорідність явищ С-анафази і ПРЦ при ГЛЛ у дітей. Статистично доведено, що ПРЦ з високою ймовірністю відповідає бластним клітинам і є провідною причиною анеуплоїдизації їх каріотипу. Вперше встановлено, що С-анафаза є цитогенетичним маркером клітин, які гинуть шляхом апоптозу. Встановлено, що експресія С-анафази у гострій фазі ГЛЛ на рівні контрольних показників асоціюється з несприятливим прогнозом захворювання, тоді як її реєстрація на рівні 10% клітин і вище вказує на високу ймовіність досягнення стійкої ремісії. Продемонстровано кореляцію у визначенні прогнозу шляхом урахування експресії С-анафази та при застосуванні відомих клініко-лабораторних прогностичних критеріїв.
Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати вказують на перспективність урахування експресії передчасного розділення центромер метафазних хромосом у якості діагностичного та прогностичного критерію перебігу ГЛЛ у дітей. Визначено межі експресії та структуру передчасного розділення центромер в нормі, у гострій фазі ГЛЛ та на стадіях неповної і повної ремісії захворювання. Встановлено асоціацію ПРЦ з лейкемічними бластними клітинами, що дозволяє використовувати дане явище для моніторингу трансформованих клітин на препаратах хромосом. Встановлено асоціацію явища С-анафази з реалізацією програми апоптозу, що у перспективі може бути використаним для моніторингу апоптозу у культурі клітин. З'ясовано перспективність урахування експресії С-анафази для визначення перебігу ГЛЛ у дітей: асоціацію з несприятливим прогнозом при появі на рівні 0-1% мітотичних клітин та високу ймовірність досягнення стійкої ремісії при відтворенні на рівні 10% мітотичних клітин.
Реалізація результатів роботи. Результати дослідження феномену передчасного розділення центромер впроваджуються у Львівській Обласній Дитячій Спеціалізованій Клінічній Лікарні як додатковий діагностичний критерій.
Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: освоєно методи приготування хромосомних препаратів кісткового мозку і периферичної крові хворих на ГЛЛ, освоєно методи роботи на проточному цитофлуориметрі, одержано і проаналізовано хромосомні препарати периферичної крові та кісткового мозку дітей хворих на ГЛЛ та інші поширені гемобластози, та здорових осіб, одержано результати цитофлуориметричного визначення частоти апоптичних клітин. Здобувач особисто зробив пошук літератури і написав тект дисертації. У дисертацію включені лише ті наукові результати, які отримані дисертантом особисто. Автор безпосередньо брав участь в експериментальних і теоритичних дослідженнях. В опублікованих зі співавторами наукових працях здобувачу належить 70-80 % експериментальних та теоритичних даних.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації доповідалися на ХVIII-му Міжнародному конгресі з аналітичної цитології (м. Ріміні, Італія, 1996), XVI-му Європейському конгресі з гематології та імунології (м. Тессалоніки, Греція, 1997), ІІ-му Міжнародному медичному конгресі молодих вчених і студентів (м. Тернопіль, Україна, 1998), II-ій конференції Європейської цитогенетичної асоціації (м. Відень, Австрія, 1999).
Публікації. Основні положення і результати досліджень опубліковані у 9 роботах, з яких 6 статей та 3 тез до виступів на міжнародних наукових конференціях та конгресах.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 165 сторінках машинопису і складається з вступу, огляду літератури, опису об'єкту, об'єму, матеріалів та методів дослідження, розділу отриманих результатів дослідження, обговорення отриманих даних, висновків, практичних рекомендацій, переліку посилань використаної літератури, додатку. Перелік посилань містить 164 джерела. Демонстративний матеріал представлений у вигляді 19 таблиць і 11 рисунків.
На захист виносяться наступні положення:
1. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом клітин крові і кісткового мозку є типовою ознакою гострої фази ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей.
2. Метафазні клітини з передчасним розділенням центромер декількох хромосом (ПРЦ) з високою ймовірністю відповідають бластним клітинам.
3. Явище ПРЦ може бути причиною виникнення анеуплоїдного хромосомного набору клітини.
4. Метафазні клітини з передчасним розділенням центромер всіх хромосом (С-анафаза) з високою ймовірністю відповідають бластним клітинам, які знаходяться на стадії запрограмованої загибелі (апоптозу).
5. Частота С-анафаз у гострій фазі ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей демонструє вірогідну кореляцію з прогнозом захворювання.
ОСНОВНИЙ ЗМIСТ ДИСЕРТАЦIЇ.
У першому розділі описано сучаснi погляди на проблему онкогенезу та генетичнi механiзми гострого лiмфобластного лейкозу у дiтей, на механiзм розділення центромер в нормальній клітині та охарактеризовано нинiшнiй стан дослiдження феномену передчасного розділення центромер метафазних хромосом, сучасні погляди на явище апоптозу.
На основi аналiзу дослiджень, що викладенi в роботах Berger R., Sandberg A., Raimondi S., Melo J., Akao Y. та iн. узагальненi сучаснi уявлення про механiзм онкогенезу гострого лiмфобластного лейкозу.
Згiдно сучасних уявлень на онкогенез гострих лейкозiв всi випадки ГЛЛ спричиненi хромосомними мутацiями (транслокацiями, делецiями, iнверсiями, дуплiкацiями), що виникають у кiстковому мозку (КМ). Коли локалiзацiя цих хромосомних мутацiй спiвпадає з локалiзацiєю протоонкогенiв, утворюються химернi гени, трансляцiя яких i обумовлює виникнення пролiферуючого злоякiсного клону. Рiзнi хромосомнi аномалiї мають рiзне прогностичне значення. Наявнiсть одних (таких як t (9;14) є несприятливою ознакою з високою летальнiстю та високим ризиком рецидиву, iншi (такi як гiпердиплоїдія) вказують на сприятливий прогноз i високу ймовiрнiсть довготривалої ремiсiї. Описано вже бiльше 70 рiзних хромосомних мутацiй, якi не випадковi при ГЛЛ i є причиною винекнення лейкозного клону.
На основi аналiзу дослiджень, що викладенi в роботах Fitzgerald P., Mehes G., Mehes K., Buhler E., Vig B., Alberts B та iн. узагальненi сучаснi уявлення про механiзм розділення центромер в нормi i при патологiї та сучаснi погляди на феномен передчасного розділення центромер метафазних хромосом.
Феномен передчасного розділення центромер (ПРЦ) метафазних хромосом - явище недостатньо дослiджене, його молекулярно-генетичнi механiзми невiдомi.Вiдкрите ще у 70-ті роки ХХ століття, воно довгий час вважалося випадковим. Але пiзнiше було доведено зв'язок феномену ПРЦ з рядом захворювань: розсiяним слерозом, онкологiчними захворюваннями та iн. Проте, як проявляється цей феномен при гострому лiмфобластному лейкозi (ГЛЛ), яке його діагностичне та прогностичне значення при ГЛЛ досi практично не дослiджувалося. Яка роль феномену ПРЦ у процесi лейкемiзацiї, у виникненнi гiпоплоїдних клонiв, яка його роль у виникненнi i розвитку ГЛЛ - досi не встановлено. На сьогодні доведеним вважається лише те, що феномен ПРЦ є явищем невипадковим – він пов’язаний з рядом захворювань, зокрема з такими захворюваннями як синдром Альцгеймера, синдром Робертса, фолат-дефіцитними анеміями та рядом онкологічних захворювань, в тому числі з гострим мієлобластним лейкозом (ГМЛ). Встановлено зв’язок феномену ПРЦ з процесом старіння клітин.Вважається доведеним, що феномен ПРЦ пов’язаний з процесом утворення анеуплоїдних клонів, ендоредуплікантів, поліплоїдних клонів.Вважають, що механізм виникненя ПРЦ пов’язаний з процесом метилювання ДНК, доведено, що феномен ПРЦ пов’язаний з внутрішньоклітинним дефіцитом фолатів – донорів метилових радикалів в процесі метилювання.
Розрiзняють двi рiзновидностi ПРЦ – повне (або С-анафаза) та часткове (або PCD – далі ПРЦ). При частковому ПРЦ у феномен задiянi вiд 1 до 23 хромосом каріотипу (рис 7), а при повному ПРЦ задiянi вiд 50 до 100 % хромосом (рис. 6). Повне i часткове ПРЦ вважається принципово рiзними явищами з рiзними механiзмами та рiзним функцiональним значенням i розглядаються окремо. Явище повного ПРЦ в лiтературi називають С-анафазою.
У цьому роздiлi на основi праць Стойки Р.С., Фiльченкова А.А., Gorman A., Nazareth L. та багатьох iнших охарактеризоване явище апоптозу (запрограмованої смерті клітин), сучаснi погляди на його механiзми i зв'язок з iншими процесами в клiтинi, показано одночасну реєстрацію індукції апоптозу і різних клітинних аномалій, що пов’язані з феноменом ПРЦ. Описано випадки паралельної реєстрації індукції апоптозу і цитогенетичних варіантів клітинної конституції, що пов’язані з феноменом ПРЦ. В цілому ряді робіт, що з’явилися друком в останні 1-2 роки виявлено наявнисть факторів, що одночасно є індукторами апоптозу або безпесоредньо зв’язані з його індукцією і одночасно пов’язані з прцесом розділення центромер. Так в цих роботах доведено, що білки CTNP, які безпосередньо пов’язані з функціонуванням центромери, пов’зані з явищем апоптозу. Так доведено, що білок CENP-C пов’язаний з індукцією апоптозу - мишача клітинна лінія DT40 з мутантним геном білку CENP-C має підвищену здатність до апоптозу (за певних умов) і апоптоз настає при метафаз-анафазному переході. Виявлено, що білок CENP-A пов’язаний з індукцією апоптозу і ця індукція відбувається на рівні цетромери. Доведено, що топоізомераза безпосередньо пов’язана з явищем апоптозу. Цей же фермент як було описано вище пов’язаний з процесом розділення центромер. Виявлено, що апоптозні клітини при медулобластомі мають рядцитогенетичних характеристик аналогічних до цитогенетичних характеристик ембріональних клітин для яких характерно явище С-анафази зокрема. Доведено, що еруцилфосфохолін приводить до утворення і акомуляції тетраплоїдних клітин і одночасно до формування бінуклеарних і полінуклеарних клітин і індукції апоптозу. Доведено, що процеси метилювання і фосфорилювання пов’язані з явищем апоптозу.
У другому розділі описано методи, якими було проведено дослiдження, реактиви, обладнання, дослiджуваний матерiал, наведено клінічну характеристику пацієнтів та статистичнi методи обробки результатiв.
Феномен ПРЦ дослiджувався у периферiйнiй кровi та кiстковому мозку. Для цього ставилась 48-годинна культура клiтин на середовищi Iгла фiрми "Life Technologies" та фiрми "Sigma" з глютамiном та з ембрiональною телячою сироваткою фiрми "Biomark" при 37ºС.Спiввiдношення сироватки до середовища Iгла бралося 1:6. Глютамiн додавався ex tempore - 0,1 мл стерильного насиченого розчину L-глютамiну до 7 мл середовища. Колхiцин використовувався фiрми "J.T.Baker Inc."Розчин колхiцину додавався за 1год.30 хв. до кiнця 48-годинного клiтинного циклу. Кiстковий мозок культивувався 24 год. в середовищi Iгла або в середовищi RPMI 1640 фiрми "Sigma".Гiпотонiя проводилась 0,075 М розчином КСl, приготування хромосомних препаратiв проводилось стандартно. Мiтоген фiтогемаглютинiн (ФГА) використовувався фiрми Difco для культивування периферійної крові. Паралельно периферійна кров лейкозних хворих культивувалася без мітогенів. Кiстковий мозок культивувався без мiтогенiв. Для визначення ПРЦ фарбування препаратiв проводилось рутинно фарбником Гiмза та диференцiйно з використанням трипсинового методу. Хромосомнi препарати аналiзувалися мiкроскопом фiрми Leitz.Визначення рiвня апоптозу проводилось за допомогою проточного цитофлуориметра FACScan фiрми "Becton-Dickinson". Для цього дослiджуванi клiтини видiлялися з кiсткового мозку або периферiйної кровi на фiкол-верографiновому градiєнтi. Потiм клiтини вiдмивались фiзрозчином, фiксувались 70 % етанолом, пiсля центрифугування розчинялися в 0,5 мл розчину пропiдiум йодиду (200 мкг/мл) з 0,1 % NP-40, 0,9 % NaCl. До розчину додавалося на льоду 50 мкл РНКази А (50 мкг/мл) та iнкубували 30 хв. при 4ºС. Пiсля цього клiтини тричi промивали в забуференому розчинi (PBS) i аналiзували на проточному цитофлуориметрi FACScan при довжинi хвилi аргонового лазеру 488 нм. При апоптозі відбувається прогресуюча деградація ДНК в клітині, частина ДНК виходить з клітини, з'являються клітини з меншим ніж нормальний вмістом ДНК – з'являється додатковий пік на цитофлуорограмі – пре-G1 пік. По кількості цих клітин визначають рівень апоптозу (рис. 8).
У третьому розділі описано результати дослiдження рiвня феномену передчасного розділення центромер метафазних хромосом при гострому лiмфобластному лейкозi у дiтей в першому госрому перiодi, в перiодi ремiсiї, в час рецедиву. Описано прояв цього феномену у дiтей хворих на гострий лiмфобластний лейкоз групи високої летальностi та у групi тривалої ремiсiї. Описано прояв цього феномену у батькiв дiтей хворих на гострий лiмфобластний лейкоз та у контрольнiй групi здорових дітей, що проходили обстеження у гематологічному відділі Львівської дитячої обласної спеціалізованої клінічної лікарні. Показано дiагностичне та прогностичне значення дослiджуваного феномену.
У якості контрольної групи аналізувались здорові діти, що проходили обстеження віком від 0 до 14 років і були після обстеження визнані здоровими. Досліджено рівень ПРЦ та С-анафази у 15 здорових дітей. Рівень ПРЦ в цій контрольній групі коливався від 0 до 6 % і становив в середньому 1,7 _+ 0,3 %. С-анафаза у контрольній групі не зустрічалося зовсім (0%). Було проведено дослідження рівня ПРЦ в кістковому мозку 3 здорових дітей (пункція була зроблена внаслідок помилки діагнозу, здійсненої у районній лікарні). Хоча вибірка в даному випадку є малою для остаточних висновків для кісткового мозку, але рівень ПРЦ та С-анафази був майже аналогічний до рівня у периферійній крові - рівень ПРЦ становив в середньому 3,6 _+ 0,3 %, а С-анафази 0 % (не зустрічався зовсім), що наводить на думку, що феномен ПРЦ не властивий нормальним проліферуючим клітинам, а властивий лише при патології.
Проведено комплексний цитогенетичний аналіз 60 хворих на ГЛЛ на різних стадіях розвитку хвороби: у першому гострому періоді, під час рецедивів, на стадії ремісії. У хворих на ГЛЛ, нелікованих, в першому гострому періоді у периферійній крові (ПК) рівень ПРЦ коливався від 8 до 100 % і становив в середньому 32,0 _+ 2,9 %.Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (Р < 0,001). Рівень С-анафази в периферійній крові хворих на ГЛЛ в першому гострому періоді коливався від 0 до 40 % і становив в середньому 4,0 _+ 1,4 %.Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (P < 0,01). У кістковому мозку (КМ) у першому гострому періоді ГЛЛ рівень ПРЦ становив в середньому 37,0 _+ 6,5 %, а С-анафази відповідно 14,0 _+ 4,3 % (рис.1). Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (P < 0,001).
По ходу досліджень було здійснено комплексний цитогенетичний аналіз 20 хворих на ГЛЛ дітей в період тривалої ремісії після курсу лікування. Час, у якому хворі перебували в тривалій ремісії становив від 3 місяців до 5 років. За основний критерій ремісії брався рівень бластів у кістковому мозку після завершення лікування, що не перевищував 2 %.
У період ремісії величини ПРЦ та С-анафази як у периферійній крові, так і у кістковому мозку достовірно знижувались і статистично достовірно не відрізнялися від контрольної групи (див.рис.1).
В кістковому мозку у дітей хворих на ГЛЛ в період ремісії рівень ПРЦ становив в середньому 3,4 _+ 0,3 %, а С-анафизи - 0 %. В периферійній крові у дітей хворих на ГЛЛ в період ремісії рівень ПРЦ становив в середньму 3,5 _+ 0,4 %, а С-анафази - 1,5 _+ 0,3 %.
Це дозволяє стверджувати, що зниження рівня ПРЦ може бути новим критерієм ремісії.
Проведено дослідження рівня ПРЦ та С-анафази у хворих на негоджкінську лімфому. У цих хворих в першому гострому періоді виявлено низькі рівні ПРЦ як в кістковому мозку так і в периферійній крові (близькі до контрольної групи) і високі рівні С-анафази як в кістковому мозку (в середньму 57,0 _+ 3,0 %) так і в периферійній крові (в середньому 52,5 _+ 7,7 %), що свідчить про те, що феномен С-анафази є новим додатковим діагностичним маркером негоджкінської лімфоми (див.рис.4).
Очевидно, такі високі рівні С-анафази є типовими для лімфом і можуть бути додатковим діагностичним критерієм. Рівень ПРЦ у хворих на лімфому при відсутності лейкемізації був низьким ( в периферійній крові в середньому 4,0 _+ 1,2 %, а в кістковому мозку (КМ) в середньому 8,0 _+ 3,6 %), що близьке до значення контрольної групи. Слід зазначити, що у 1 хворого на негоджкінську лімфому з лейкемізацією крім високого рівня С-анафази був відмічений і високий рівень ПРЦ, що корелював з рівнем бластів у периферійній крові. Очевидно, високий рівень ПРЦ є критерієм лейкемізації при лімфомах.
У 10 пацієнтів хворих на ГЛЛ проводилось паралельне визначення рівня ПРЦ, рівня С-анафази та рівня апоптозу в периферійній крові та кістковому мозку. Рівень апоптозу як в кістковому мозку так і в периферійній крові хворих на ГЛЛ дітей в першому гострому періоді коливався в досить широкому діапазоні - від 0 до 16,7 %. В період ремісії у хворих на ГЛЛ дітей в периферійній крові та кістковому мозку рівень апоптозу коливався від 0 до 3,01 %. В контрольній групі - у 20 здорових донорів та здорових дітей рівень апоптозу становив від 0 до 0,3 % ( в середньму 0,12 %). Паралельно із визначенням апоптозу в тій же пробі пунктату кісткового мозку або периферійної крові проводилось визначення рівня С-анафази. Виявлено позитивну кореляцію між рівнем С-анафази та рівнем апоптозу, що визначався на проточному цитофлуориметрі. Коефіцієнт кореляції між рівнем апоптозу і рівнем С-анафази становив р=0,9 (Р<0,01). Це свідчить про те, що феномен С-анафази високоімовірно є одним із проявів явища апоптозу, або одною із форм апоптозу чи його певною стадією (див.рис.5).
Виявлено позитивну кореляцію між рівнем бластів у периферійній крові та рівнем ПРЦ (рис.2). Для ПРЦ коефіцієнт кореляції становив р=0,75; (Р<0,01). У пацієнтів з тотальним бластозом у ПК (100% бластів) рівень ПРЦ досягав до 100%. Це дозволяє стверджувати, що феномен ПРЦ високоймовірно є характерною ознакою проліферуючих клітин, є однією з властивостей бластів при ГЛЛ.
Було проведено дослідження прогностичного значення феномену С-анафази при ГЛЛ. Для цього аналізувались 3 групи хворих:
1 - з високою летальністю, хворі,що померли не досягаючи ремісії;
2 - хворі, що померли внаслідок рецидиву після короткочасної ремісії;
3 - хворі, що досягли довготривалої ремісії.
Дослідивши феномен С-анафази у першому гострому періоді було встановлено, що у 1 та 2 групах рівень С-анафази був низьким, відповідно в середньому 2,7 _+ 0,3 % та 3,4 _+ 0,4 %, а у 3 групі був достовірно вищий (P<0,01) і сладав в середньому 14,8 _+ 1,5 %, що свідчить про те,що високі рівні С-анафази у першому гострому періоді є позитивним прогностичним фактором (див.рис.3). Це дозволяє стверджувати, що високоймовірно С-анафаза виконує функцію елімінації мутантних клонів і її високий рівень свідчить про більшу опірність організму проліферації злоякісних клонів. Це свідчить про зв'язок між феноменом С-анафази і явищем апоптозу.
Рис. 1.Частота реєстрації ПРЦ і С-анафази (в %) в гострому періоді та на стадії ремісії ГЛЛ у дітей
КМ - культура клітин кісткового мозку.
ПК - культура клітин периферійної крові.
Рис. 2.Графік залежності між частотою реєстрації клітин з передчасним розділенням центромер на препаратах хромосом та відносним рівнем бластів у периферійній крові хворих на ГЛЛ.
Рис. 3. Аналіз перебігу ГЛЛ у дітей залежно від частоти реєстрації С-анафази у гострому періоді захворювання.
Рис. 5.Графік залежності між частотою реєстрації С-анафази на препаратах хромосом та рівнем апоптичних клітин у хворих на ГЛЛ.
Рис. 6. Феномен С-анафази в культурі клітин кісткового мозку хворого на ГЛЛ.
Рис. 7. Феномен ПРЦ в культурі клітин кісткового мозку хворого на ГЛЛ.
Рис. 8. Розподіл ДНК в клітинах у різних фазах клітинного циклу (цитофлуориметричний аналіз клітин кісткового мозку хворого на гостру лімфобластну лейкемію).Прогресуюча втрата ДНК апоптичними клітинами призводить до утворення додаткового пре-G1 піку (показано стрілкою).
Висновки.
1. Передчасне розділення центромер (ПРЦ) метафазних хромосом не відноситься до конститутивних ознак каріотипу культивованих клітин крові і кісткового мозку здорових осіб. Показником нормального стану каріотипу слід вважати експресію С-анафази 1% мітотичних клітин та реєстрацію ПРЦ поодиноких хромосом (1-єї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп C і E) в межах 4% клітин. Експресія передчасного розділення центромер метафазних хромосом є статистично вірогідною ознакою культивованих клітин крові і кісткового мозку у гострій фази перебігу ГЛЛ, ГМЛ і HГЛ. Зміни в експресії передчасного розділення центромер у гострій фазі гемобластозів, порівняно з контролем, проявляються у статистично вірогідному зростанні частоти С-анафази та клітин з ПРЦ та залученні у ПРЦ 3-20 хромосом каріотипу із значним питомим вмістом хромосом, для яких ПРЦ є нетиповою ознакою (хромосоми груп D, F, G). В ремісії ГЛЛ встановлено статистично вірогідне згортання експресії передчасного розділення центромер метафазних хромосом у культурі крові і кісткового мозку порівняно з гострою фазою захворювання, незначне персистування С-анафази та ПРЦ у випадках неповної ремісії та досягнення контрольних показників за усіма параметрами у випадках повної ремісії.
2. Статистично вірогідна кореляція між рівнем бластів у периферичній крові та частотою ПРЦ на препаратах хромосом вказує на високу ймовірність походження метафазних клітини з передчасним розділенням центромер декількох хромосом (ПРЦ) з трансформованих бластних клітин.
3. Статистично вірогідна кореляція між рівнем ПРЦ та частотою клітин з анеуплоїдним каріотипом вказує на ПРЦ як на вагому причину виникнення анеуплоїдного хромосомного набору клітини при ГЛЛ у дітей.
4. Статистично вірогідна кореляція між частотою С-анафази на препаратах хромосом та рівнем апоптичних клітин, визначених цитофлуориметричним методом, вказує на притаманність передчасного розділенням центромер для каріотипа бластних клітин, які гинуть шляхом апоптозу.
5. Експресія С-анафази у гострій фазі ГЛЛ на рівні показників здорових осіб (0-1% мітотичних кліти) асоціюється із несприятливим перебігом захворювання (летальним кінцем або швидким наступленням рецидиву), тоді як її відтворення на рівні 10% мітотичних клітин вірогідно вказує на високу ймовірність досягнення стійкої ремісії. Частота С-анафази у гострій фазі ГЛЛ у дітей статистично вірогідно корелює з відомими клініко-лабораторними ознаками, які використовуються для визначення прогнозу захворювання. Статистично вірогідна динаміка в експресії С-анафази і ПРЦ на різних стадіях перебігу ГЛЛ, її вірогідний зв'язок з патогенезом захворювання (асоціація з бластними клітинами, рівнем анеуплоїдії і апоптозу) та вірогідна кореляція з відомими клініко-лабораторними прогностичними ознаками вказують на перспективність урахування передчасного розділення центромер в комплексі критеріїв діагностики гострої фази ГЛЛ, досягнення повної ремісії ГЛЛ та визначення прогнозу у гострій фазі захворювання.
ПРАКТИЧHІ РЕКОМЕHДАЦІї
1. Запропоновано критерії для визначення експресії явища передчасного розділення центромер метафазних хромосом в нормі та на різних етапах перебігу ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей при застосуванні несинхронізованої культури крові і кісткового мозку.
2. Рекомендовано вважати показником нормального стану каріотипу культивованих клітин крові і кісткового мозку експресію С-анафази 1% мітотичних клітин та реєстрацію ПРЦ поодиноких хромосом (1-єї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп C і E) в межах 4% клітин.
3. Рекомендуємо вважати, що експресія С-анафази більше ніж 1% мітотичних клітин та наявність клітин з ПРЦ 3-х – 20-и хромосом набору із залученням хромосом груп D і G вказують на наявність хромосомного дизбалансу і можуть бути ознаками клітинної трансформації при гострій лімфобластній і гострій мієлоїдній лейкемії у дітей.
4. Рекомендуємо вважати, що експресія С-анафази на рівні 40-50% мітотичних клітин поряд знормальними параметрами ПРЦ можуть бути ознакою каріотипу клітин крові і кісткового мозку при негоджкінській лімфомі у дітей.
5. Рекомендуємо вважати, що відсутність експресії С-анафази та реєстрація ПРЦ поодиноких хромосом (1-єї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп C і E) в межах 4% клітин вказують на досягнення повної ремісії гострої лімфобластної лейкемії у дітей.
6. Рекомендуємо вважати, що якщо у гострій фазі перебігу ГЛЛ і ГМЛ у дітей, до початку цитостатичної терапії за протоколом, частота С-анафази складає 0-1% мітотичних клітин крові і кісткового мозку, це вказує на високу ймовірність несприятливого перебігу захворювання: летальний кінець або швидке наступлення рецидиву.
7. Висока ймовірність позитивного прогнозу ГЛЛ та ГМЛ у дітей асоціюється з експресією С-анафази більше ніж 2-ма відсотками мітотичних клітин крові і кісткового мозку і є високовірогідною у випадках, коли частота С-анафази перевищує 10% клітин.
Список основних опублікованих автором праць за темою дисертації.
1.Акопян Г.Р., Сиренко А.Г., Гнатейко О.З., Петрух А.В., Стойка Р.С. С-анафаза как цитогенетический маркер апоптоза клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей // Экспериментальная онкология. – 1999. – N21(2). – С. 127-132.
2.Акопян Г.Р., Гнатейко О.З., Сіренко А.Г., Поліщук Р.С., Логінський В.Є., Новак В.Л. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом при гострій лімфобластній лейкемії у дітей // Онкология. – 1999. - N4. – C.283-289.
3.Сіренко А.Г., Акопян Г.Р. Передчасне розділення центромер як цитогенетичний маркер гострої лейкемії у дітей // Збірник наукових праць “Проблеми екології та медичної генетики і клінічної імунології / Вип.4(24). – Київ-Луганськ. – 1999. – С. 122-133.
4.Кіцера Н.І., Козій Р.С., Поліщук Р.С., Сіренко А.Г. Цитогенетичний та клініко-генеалогічний аналіз хронічної мієло-моноцитарної лейкемії у дитини // Лікарська справа. – 1999. – N1(1043). – C. 129-131.
5.Сiренко А.Г. Феномен передчасного розділення центромер хромосом при гострому лiмфобластному лейкозi // Бюлетень Всеукраїнського Наукового та Професiйного Товариства iм. Миколи Мiхновського: Медицина. Медична генетика. Екологiя людини – 1998 - N7. - С. 4-11.
6.Сiренко А.Г.Передчасна анафаза як новий цитогенетичний маркер неходжкiнської лiмфоми // Бюлетень Всеукраїнського Наукового та Професiйного Товариства iм. Миколи Мiхновського: Медицина. Медична генетика. Екологiя людини. - 1998. - N7. - С. 11-15.
7.Sirenko A., Akopian G. Premature centromere division of the chromosomes at the different stages of acute lymphoblastic leukemia in infants // Pediatric research. - 1997. - 41(5).- P. 774.
8.Sirenko A.G., Acopian G.R., Petrukh A.V. Premature centromere division of metaphase chromosome and blood cell differentiation // Cytometry. - 1996. - N8. - P. 99.
9.Передчасне розділення центромер метафазних хромосом та баланс гетерохроматину в геномi клiтин iз рiзним ступенем диферецiацiї. Г.Р. Акопян, А.Г.Сiренко, Н.Л. Гулеюк, А.В. Петрух, П. Мале. //Тези доп. 2 з'їзду мед. генетикiв України. - Львiв. -1995.- С. 6.
Анотація.
Сiренко А.Г. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом як перспективний діагностичний і прогностичний маркер при гострій лімфобластній лейкемії у дітей. Дисертацiя на здобуття наукового ступеня кандидат бiологiчних наук за спецiальнiстю – 03.00.15 генетика. Львiвський Науково-Дослiдний Iнститут Спадкової Патологiї, Львiв, Україна, 1999.
Дисертацiєю є рукопис, який мiстить теоретичнi розробки та експериментальнi дослiдження в галузi онкогенетики та цитогенетики гострих лейкозiв з метою пошуку нових цитогенетичних маркерiв дiагностики та прогнозу гострого лiмфобластного лейкозу (ГЛЛ) у дiтей.В якостi нового дiагностичного i прогностичного маркеру дослiджувався феномен передчасного розділення центромер метафазних хромосом (ПРЦ) та С-анафаза як варiант повного ПРЦ.Показано, що ПРЦ є характерним в бiльшiй мiрi бластним клiтинам, анiж нормальним диференцiйованим лiмфоцитам. Пропонується новий критерiй ремiсiї при ГЛЛ - зниження рiвня ПРЦ.Виявлено, що С-анафаза є прогностичним критерiєм при ГЛЛ i її високi рiвнi в першому гострому перiодi є позитивним прогнозом i свiдчать про високу ймовiрнiсть входження в тривалу ремiсiю.Виявлено, що С-анафаза є одним із проявів явища апоптозу.
Ключові слова: Передчасне розділення центромер, гострий лiмфобластний лейкоз, хромосома, ген, метафаза, апоптоз.
Анотация.
Сиренко А.Г. Преждевременное разделение центромер метафазных хромосом как перспективный диагностический и прогностический маркер при острой лимфобластной лейкемии у детей. Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности – 03.00.15 генетика. - Львовский Научно-Исследовательский Институт Наследственной Патологии, Львов, Украина, 1999.
Диссертацией является рукопись, содержащая теоретические разработки и экспериментальные исследования в области онкогенетики и цитогенетики острых лейкозов с целью поиска новых цитогенетических маркеров диагностики и прогноза острого лимфобластного лейкоза (ГЛЛ) у детей. В качестве нового диагностического и прогностического маркера исследовался феномен преждевременного разделения центромер метафазных хромосом (ПРЦ) - феномен в котором задействованы от 1 до 23 хромосом и С-анафаза как вариант полного ПРЦ – феномен в котором задействованы от 50 до 100 % хромосом кариотипа. Показано, что в остром периоде ГЛЛ уровень ПРЦ значительно статистически достоверно превышает уровень ПРЦ в контрольной групе (в периферической крови в остром периоде в среднем уровень ПРЦ 32,0 +_2,9 %, а в костном мозге 37,0 +_ 6,5 % припоказателях контрольной групы 1,7 +_ 0,3 % и 3,6 +_ 0,3 % соответственно, Р< 0,001). Показано, что ПРЦ в большей мере характерен бластным клеткам, чем нормальным дифференцированым лимфоцитам.Обнаружена позитивная кореляция между числом клеток с ПРЦ и числом бластов в периферической крови детей больных на ГЛЛ (коэфициент кореляции р= 0,75). Обнаружено что при ГЛЛ в период ремисии уровень ПРЦ достоверно снижается и статистически не отличается от уровня ПРЦ в контрольной групе. Предлагается новый критерий ремисии при ГЛЛ - снижение уровня ПРЦ. С-анафаза не проявляет кореляции с уровнем бластов в периферической крови детей больных на ГЛЛ (р = 0,1). Предложено ПРЦ в качестве нового дополнительного диагностического критерия при ГЛЛ. Обнаружено, что С-анафаза – прогностический критерий при ГЛЛ и ее высокий уровень в первом остром периоде является позитивным прогнозом и свидетельствует о высокой вероятности вхождения в продолжительную ремиссию. Обнаружено позитивную кореляцию между уровнем С-анафазы и уровнем апоптоза в периферической крови и костном мозге детей больных на ГЛЛ в первом остром периоде. Показано, что С-анафаза является одним из проявлений апоптоза. Обнаружено, что при злокачественых неходжкинских лимфомах у больных в периферической крови и в костном мозге имеет место высокий уровень С-анафазы (в среднем 57,0 +_ 3,0 % в костном мозге и 52,5 +_ 7,7 % в периферической крови). Предложено определять уровень С-анафазы в качестве дополнительного диагностического маркера при неходжкинских лимфомах. Обнаружено позитивную кореляцию между уровнем ПРЦ и уровнем анеуплоидных клонов в периферической крови и костном мозге больных на ГЛЛ детей (р= 0,6), что свидетельствует о том что ПРЦ является одной из причин появления анеуплоидных клонов при ГЛЛ.
Ключевые слова: Преждевременное разделение центромер, острый
лимфобластный лейкоз, хромосома, ген, метафаза, апоптоз.
Summary
Sirenko A.G. PHENOMENON PREMATURE CENTROMERE DIVISION IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA OF METAPHASE CHROMOSOME IN CHILDREN. – Manuscript.
The thesis for a candidate`s degree of biological scienses on speciality – genetic – 03.00.15.
Institute of Hereditary Pathology, Lviv, Ukraine. 1999.
The thesis is a manuscript wich contains theoretical developments and experimental reasearch in a field of genetic of acute lymphoblastic leukemia with the object new diagnostic and prognostic marker this disease. The evidence of premature centromere division of the metaphase chromosomes (PCD) and C-anaphase (PCD of 50-100 chromosomes) as a new prognostic cytogenetic marker of children`s acute lymphoblastic leukemia (ALL) is suggested.PCD more typical for blast cell than normal differenciation lymphocits was showed. The lowering of level PCD is a new cryterial of remission by ALL was suggested. C-anafase is a new prognostic marker in ALL and high level C-anaphase in first acute period is positive prognosis and testify about high probability of entrence in duration remision was showed. C-anaphase is a display of apoptosis in ALL was suggested.
KEY WORDS: premature centromere division, acute lymphoblastic leukemia, chromosome, gene, metaphase, apoptosis.
ПОДЯКИ.
| 
