|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Островська Галина Віталіївна
УДК 577.352.2’335 +577.171.54
Первинні механізми мембраномодулюючої дії біорегуляторів природного і синтетичного походження
03.00.02 – біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка
Науковий консультант:
доктор біологічних наук, професор
Рибальченко Володимир Корнійович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділом цитофізіології біологічного факультету
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор
Зима Валентин Леонідович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
професор кафедри біофізики
доктор біологічних наук, професор
Говорун Дмитро Миколайович,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,
завідувач відділом молекулярної біофізики
доктор біологічних наук, професор
Великий Микола Миколайович,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України,
професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії
Провідна установа: Львівський національний університет ім. Івана Франка Міністерства освіти і науки України
Захист відбудеться "16" лютого 2005 року о 14-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)
Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58)
Автореферат розісланий "13"січня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.3 Цимбалюк О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Біологічно активні речовини (БАР), в тому числі й лікувальні препарати, здійснюють свої ефекти через взаємодію з специфічними мембранними рецепторами, які мають білкову природу, внаслідок чого енергія хімічного сигналу трансформується в біологічні ефекти. Для кожної такої події клітини мають широку різноманітність вторинних месенджерів [Кухарь и др., 1992; Авдонин, Ткачук, 1994; Геннис, 2001]. Проте, останніми роками встановлена здатність біорегуляторів змінювати функціональну активність клітин завдяки механізмам, які не включають пряме зв’язування регуляторних молекул з білковими рецепторами [Рыбальченко, 1990; Мураневич, 1993; Островська,1995; Bechinger,1997; Бурлакова и др.,2003]. Як правило, відповіді на такі взаємодії трактуються як побічні ефекти індивідуальних препаратів, і можуть бути причиною шкідливих, несприятливих і токсичних впливів на клітинні процеси. Особливості безрецепторних взаємодій залежать від фізико-хімічної природи діючих речовин і їх здатності в більшій чи меншій мірі проникати в мембрану і проходити через неї, з одного боку, і від властивостей мембранних ліпідів, з іншого [Могилевич, 1995; Островська, 1995; Przestalski et al., 2000]. БАР здатні ініціювати біологічну відповідь, впливаючи безпосередньо на функціональну структуру мембранних фосфоліпідів, обминаючи, таким чином, специфічні рецептори. Ці ефекти є залежними від дози і часу і, окрім фізологічних змін у функціях клітини, низка БАР може ініціювати індукцію фосфоліпідозу і неспецифічні токсичні ефекти. У зв’язку з цим необхідність детальних експериментальних досліджень, які б забезпечили повне розуміння первинних механізмів взаємодій між БАР і мембранними структурами клітин, не викликають сумнівів. Останнім часом в світових дослідженнях значна увага приділяється в основному мембрано-активним властивостям пептидів антимікробної дії і пептидам, токсичним по відношенню до клітин ссавців [Matsuzaki et al.,1991-1999; Epand, Vogel,1999; Huang,2000; Hancock,2001; Hof et al.,2001; Lohner,2001; Yeaman, Yount, 2003]. Безрецепторні ефекти регуляторних пептидів (РП) досі залишаються поза належною увагою дослідників. Проте, з’являється все більше даних про поліфункціональність РП, яку не можна пояснити тільки гетерогенністю рецепторів [Громов, 1992; Бурлакова и др., 2003; Mayers,Couillard, 1990; Geffner et al., 1995; Young, 1999; Tirelli et al., 2001; Somai et al., 2002; Guha et al., 2003; Xin-Hua et al., 2003]. Важливим при цьому є те, що широкий спектр ефектів проявляється й у впливі більшості пептидів на процеси проліферації клітин, психоневрологічний стан і поведінку людини та тварин [Громов, 1992; Папсуевич и др., 1986; Berod, Rostene,2003; Geffner et al.,1995; Guha et al., 2003; Rozengurt, Walsh, 2001; Somai et al., 2002; Young, 1999], що може привести до виникнення непередбачених наслідків при їх застосуванні в лікувальній практиці. Це вимагає більш детального дослідження механізмів взаємодії БАР з клітинними мембранами. Знання первинних механізмів мембранотропної дії сприятиме пошуку і розробці нових, більш ефективних і селективних препаратів, в тому числі й таких, що не руйнуються ендогенними ферментами, проте мають певну специфічність до того чи іншого типу мембран.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках державних наукових програм: “Розробка підходів до використання оптимальних концентрацій і комбінацій лікувальних засобів пептидної природи та рекомендацій щодо направленого синтезу пептидних біорегуляторів” – тема Держкомітету України з науки і техніки (завдання № 1.02.01/148-93 комплексного проекту № 08.04.04/002К-95; “Встановлення механізмів зв’язування енкефалінів, їх синтезованого аналога, ригіну і тафцину з мембранами різного ступеня організації”, № держреєстрації 0194U017666; “Первинні механізми взаємодії лікувальних засобів пептидної природи синтетичного та природного походження з плазматичною мембраною клітини”, № 0193U004319; “Mембранотропна активність суфану”, № 0197U016241; “Дослідження первинних механізмів зв`язування пептидних гормонів з мембранами різного ступеня організації”, № 0197U003105; “Дослідження первинних процесів цитофізіологічних ефектів пестицидів як шкідливих факторів довкілля”, № 0102U001161; “Клінічне і експериментальне обгрунтування ефектів деяких біологічно-активних речовин”, № 0199U003850.
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є встановлення активної ролі ліпідного матриксу в реалізації ефектів біорегуляторів, здатності регуляторних речовин природного і синтетичного походження взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без залучення специфічних білкових рецепторних структур, визначення кількісних параметрів інсерції біологічно активних молекул у різні типи ліпідних мембран, а також встановлення залежності між фізико-хімічними характеристиками біорегуляторів і ліпідного матриксу мембран та особливостями їх взаємодії.
Для досягнення зазначеної мети були визначені наступні завдання:
провести порівняльний аналіз особливостей амінокислотного складу пептидних біорегуляторів з встановленими мембранотропними властивостями і речовин, для яких прогнозовано мембранотропну активність;
визначити поверхневу активність біорегуляторів різної хімічної природи і з різною біологічною дією;
встановити їх мембранотропність по відношенню до модельних ліпідних і ліпопротеїнових мембран різного хімічного складу і різного фізичного стану;
визначити параметри мембрано-активної дії біорегуляторів по відношенню до різних модельних мембран – концентраційну залежність інтенсивності змін параметрів мембран (поверхневого тиску і граничного стрибка потенціалу), характер взаємодії (адсорбція в зоні полярних головок або інсерція в гідрофобну зону), мінімальну ефективну концентрацію, коефіцієнт адсорбції Гіббса, питому молекулярну площу адсорбованої речовини в мембрані;
дослідити роль оптичної ізомерії БАР, іонного складу та іонної сили субфази на активність пептид-мембранної взаємодії;
провести порівняльний аналіз мембранотропних властивостей досліджених регуляторних пептидів з БАР антимікробної і цитотоксичної дії;
провести дослідження мембранотропних властивостей речовин екзогенного походження (агрохімікати, фітопрепарати) з метою розробки тест-методу при прогонозуванні їх біологічної активності.
Об’єкт дослідження – механізми безрецепторної взаємодії біорегуляторів природного і синтетичного походження з мембранами.
Предмет дослідження – мембранотропні ефекти регуляторних пептидів, їх синтетичних аналогів, речовин-похідних амінокислот, агрохімікатів, фітопрепаратів.
Методи дослідження – біофізичні (метод моделювання і вимірювання характеристик моношарових мембран Ленгмюра-Вільгельмі, метод вібруючого електроду, вимірювання електричних характеристик бішарових ліпідних мембран), біохімічні (виділення, очистка і дослідження ферментативних властивостей фракцій плазматичних мембран, виділення фосфоліпідів для формування модельних мембран).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені і охарактеризовані параметри безрецепторної взаємодії ендогенних регуляторних пептидів з ліпідним матриксом мембран. Отримані експериментальні підтвердження гіпотези безрецепторної взаємодії пептидних біорегуляторів з ліпідним матриксом мембрани, запропонованої раніше [Рыбальченко, 1990; Островська, 1995]. Проаналізована роль ліпідного матриксу мембран в реалізації первинних механізмів взаємодії біорегуляторів з клітиною-мішенню. Показано, що важливим чинником взаємодії регуляторних пептидів з мембранними ліпідами є особливості параметрів гідрофобності їх молекул, зокрема гідрофільно-гідрофобний баланс, в залежності від чого змінюється характер і інтенсивність пептид-мембранної взаємодії. Проведено докладний аналіз особливостей амінокислотного складу ендогенних регуляторних пептидів і виявлені відмінності в їх амінокислотному спектрі, зокрема в групі гідрофобних амінокислот, що може лежати в основі різної біологічної дії цих біорегуляторів і пептидів з цитотоксичною дією. Встановлено значення оптичної ізомерії при безрецепторній взаємодії біорегуляторів з ліпідним матриксом мембран. Продемонстровано універсальність механізму безрецепторної ліганд-мембранної взаємодії для біорегуляторів різного хімічного складу і походження.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про молекулярні механізми, що лежать в основі принципу здійснення функцій біологічних мембран типу сигнальної трансдукції і міжклітинної сигналізації, є внеском в розуміння причин побічних ефектів біорегуляторів, фазності концентраційної залежності їх біологічних ефектів. Результати є важливими для формування теоретичних основ для розробки методів цілеспрямованого створення нових біорегуляторів і лікувальних препаратів направленої дії. Отримані результати впроваджені в навчальний процес біологічного факультету в спецкурси “Міжклітинні взаємодії”, “Рецептори мембран”, “Цитологічні ефекти фармпрепаратів” Київського національного університету імені Тараса Шевченка та на кафедрі медичної біології в Медичному інституті Української асоціації народної медицини і включені в монографію “Тканевые пептиды” (2003) та навчальні посібники “Физиология и биохимия пищеварения человека и животных” (2002), “Медична біологія. Практикум” (2003). Метод первинного прогнозування біологічної активності фітопрепаратів шляхом визначення параметрів їх мембранотропної активності зареєстровано як нововведення Міністерством охорони здоров’я України (реєстраційний № 249/19/03).
Особистий внесок здобувача полягає у плануванні і виконанні переважного обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці результатів, підборі і опрацюванні даних літератури, в аналізі і інтерпретації отриманих результатів. Загальне планування роботи і обговорення результатів проводилось за участю наукового консультанта проф. Рибальченка В.К. Експерименти по дослідженню мембранотропних властивостей суфану виконувались сумісно з асп.Харчук І.В., визначення ферементативних активностей плазматичних мембран – з асп.Яблонською С.В.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, були представлені на: VII Українському біохімічному з’їзді (Київ,1997); XV з’їзді Українського фізіологічного товариства (Київ, 1998), ІІ і ІІІ з’їздах Українського біофізичного товариства (Харків,1998, Львів,2002), XVI Менделеєвському з’їзді з загальної і прикладної хімії (С.-Петербург, 1998), IV, V і IX Міжнародних науково-практичних конференціях “Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне застосування” (Київ, 1998, 1999, 2003), Всеросійській науковій конференції з міжнародною участю, присвяченій 150-річчю від дня народження І.П.Павлова (С.-Петербург, 1999), V з’їзді фармацевтів України (Харків, 1999), І Установчому з’їзді з нейрофізіології (Київ, 2000), ІІІ Національному Конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2000), І і ІІ з’їздах токсикологів України (Київ, 2001, 2004), Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ,2001), ІІ і ІІІ Львівсько-Люблінських конференціях з експериментальної та клінічної біохімії (Люблін,Польща,2002, Львів,2004), ІІ Конгресі гепатологів України (Київ,2002), Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна” (Київ,2004), Міжнародній науковій конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приуроченої до 80-річчя з дня народж. проф.І.В.Шостаковської (Львів, 2004).
Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у 47 публікаціях, у тому числі 3 монографіях, 18 статтях, які опубліковані у наукових фахових виданнях, 1 галузевому нововведенні (Міністерство охорони здоров’я України) та у 25 тезах доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 280 сторінках основного тексту, який включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи, 6 підрозділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки. Робота ілюстрована 19 таблицями та 79 рисунками. Список використаних джерел включає 532 найменування.
Матеріали та методи досліджень
В роботі досліджувались пептиди: 4 ізомери кіоторфіну, меланостатин (Ін-т біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України); Мет- і Лей-енкефаліни і їх синтетичний аналог Љ-77, пентагастрин (Експ.завод Ін-ту органічного синтезу АН Латвії, м.Рига); тироліберин і нейротензин (НВО “Вектор”, м.Новосибірськ, Росія); біорегулятори непептидної природи: гамма-аміномасляна кислота (“Reanal”, Угорщина), 2 форми нестероїдного кардіотонічного прапарату суфан – L-cуфан і D,L-суфан (НДІ ендокринології і хімії гормонів, м. Харків, Україна), настоянка “Поліфітол-1” (розробка Медичного інституту УАНМ, м.Київ, виробник – ЗАТ “Ліктрави”, м.Житомир, Україна); спиртові настоянки індивідуальних лікарських рослин (Українська фармацевтична академія, м.Харків, Україна), 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота (“Sigma”, CША), N-оксид 2,6-диметилпіридину (івін) (Ін-т біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України). Для формування модельних мембран використовували азолектин, холестерол (“Serva”, Німеччина), фосфатидил-серин, фосфатидилхолін (завод бактеріальних препаратів, м.Харків, Україна), сироватковий альбумін (“Reanal”, Угорщина), сумарну фракцію фосфоліпідів мозку великої рогатої худоби, фракції плазматичних мембран печінки щурів і міоцитів кишечника кроля.
Розрахунки параметрів гідрофобності пептидів проводились за критеріями, запропонованими Ch.Tanford і описаними в [Кантор, Шиммел, 1984]: (1) – шкала середньої гідрофобності пептиду: Нϕ=ΣΔGiперχi , де ΔGiпер - вільна енергія переносу амінокислотного залишку і-го типу між полярним і неполярним середовищем; а χi - мольна доля останнього; (2) – співвідношення полярних і неполярних залишків в молекулі пептиду: R=Σχk /Σχi, де k відповідає полярним, а і – неполярним групам; (3) – дискримінантна функція Z, яка об’єднує два попередні параметри, Z = –0,345R + 0,60 Нϕ.
Вимірювання параметрів поверхневої і мембранотропної активності речовин проводили на базі методів Ленгмюра-Вільгельмі в модифікації Гевода В.С. і Ксенжека О.С. [Ксенжек, Гевод,1983, Гевод, 1990]. Електрична схема установки для вимірювання характеристик моношарів складається з двох функціональних блоків: (1) – реєстрації поверхневого тиску (р) і (2) – реєстрації граничного стрибка потенціалу (ГСП). Поверхневий тиск вимірювали за методом Вільгельмі за допомогою напівзануреної платинової пластинки, яка з’єднана перехідником з рухомим катодом механотронного перетворювача ХМ-6. Чутливість вимірювання – 0,1 мН/м. ГСП, що виникає поверхні розподілу фаз, вимірювали за методом динамічного конденсатора [Богуславский, 1978]. Золота пластинка ∅1 см (один з вимірювальних електродів), вібрує у повітрі безпосередньо над поверхнею розподілу фаз з постійною частотою 1480 Гц. Другий електрод (хлор-срібний) введений в субфазу. Чутливість вимірювання – 2 мВ. Реєстрація обох параметрів проводиться одночасно. За нульове значення приймаються параметри вільної поверхні розподілу фаз електроліт-повітря.
Формування модельних ліпідних і ліпопротеїнових мономолекулярних мембран. Ліпідні моношари формували нанесенням розчинів ліпідів в хлороформі (1 мг/мл) на поверхню електроліту (звичайно: 0,01М KCl, 0,01 М Трис-НСl, рН 7,4) в тефлоновій кюветі (130х200х5 мм) до досягнення необхідної величини поверхневого тиску. При формуванні ліпротеїнових модельних мембран, використовували суміші складу (у % за ваговим співвідношенням): (1) – азолектин – 60; холестерол – 10, сироватковий альбумін людини – 30; (2) – азолектин – 40, холестерол – 10, сироватковий альбумін людини – 50. Перший тип модельних мембран наближався до показників міоцитів кишечника кроля, другий – відповідав плазматичним мембранам кардіоміоцитів (за [Ивков, Берестовский, 1982; Fidelio e.a. 1992]). Відповідність фізичних властивостей цих моделей і природних мембран перевіряли порівнюванням їх ізотерм стискування.
Проникнення біорегуляторів в мономолекулярні ліпідні плівки вимірювали при внесенні досліджуваних препаратів в об’єм субфази після досягнення стаціонарного стану ліпідних моношарів через насос Бернуллі, який запобігає потраплянню речовин на поверхню і одночасно забезпечує обережне перемішування субфази за допомогою магнітного перемішувача. Загальний об’єм субфази в системі – 150 мл. Кінцева концентрація препаратів складала 1-10 мкМ. Зміни параметрів системи визначали як різницю між відповідними показниками, що встановились при дії певної концентрації препарату і початковими парaметрами немодифікованих моношарів. Рівень граничної адсорбції препаратів (коефіцієнт адсорбції Гіббса.) розраховували за рівнянням Гіббса:  , де R – універсальна газова стала, T – абсолютна температура, oK, р – показник поверхневого тиску в мембрані, С – концентрація біорегулятора, М/м3. Питому площу на 1 молекулу адсорбованої в мембрані речовини, розраховували за рівнянням:  , де Г – коефіцієнт адсорбції Гіббса, N - число Авогадро, 1018 - коефіцієнт переводу м2 у нм2. Мінімальну діючу концентрацію БАР при взаємодії з мембранами (Cмін) розраховували при апроксимації графіку Др = f (Дln C) – в точці перетину функції з віссю абсцис (Др=0). При двофазності процесу за цим же графіком, в точці перегину лінійної функції визначали концентрацію переходу процесу до другої фази (Cпер).
Дослідження впливу іонної сили субфази на мембранотропну активність біорегуляторів. Розчини для субфази готували, розраховуючи іонну силу електролітів І за рівнянням:  , де Сі – молярна концентрація іонів і-го типу з зарядом zi. При дослідженні впливу ступінчастого нарощування І субфази на параметри сформованих мембран і процеси у них, концентрований розчин необхідної кількості солі, вводили в резервуар насосу Бернулі. Наступну порцію солі вводили після досягнення стабільних показників на межі розподілу фаз.
Формування бішарових ліпідних мембран (БЛМ) проводили за [Muller e.a., 1963, Омельченко, 1990] на отворі ∅0,8 мм у тефлоновій скляночці, що знаходилась у кварцевій кюветі об’ємом 19 мл, з розчинів сумарної фракції фосфоліпідів мозку великої рогатої худоби у n-декані (30 мг/мл). Різницю потенціалів подавали на мембрану за допомогою низькочастотного генератора Г6-15, який давав змогу одержувати постійну напругу або напругу, що лінійно змінюється зі швидкістю 2 мВ/с. Струм крізь мембрану вимірювали в умовах фіксації потенціалу за допомогою швидкодіючого операційного підсилювача, який дає змогу реєструвати струм до 0,1 пА, і реєстрували за допомогою двокоординатного самозаписувача Н-307/1. Вимірюючи величину стаціонарного струму (І) крізь мембрану при постійній різниці потенціалів (U), можна розрахувати опір мембрани: R = U/І або її провідність: G = 1/R. Ємність БЛМ вимірювали за методом нестаціонарних циклічних вольт-амперних характеристик (ВАХ) і розраховували за рівнянням: , де Іс – ємнісний струм, – швидкість розгортки. Досліди проводили при кімнатній температурі і постійному перемішуванні розчинів електроліту в обох компартментах.
Виділення фракцій плазматичних мембран (ПМ) . ПМ міоцитів тонкого кишечника кроля виділяли за [Погребной, 1986; Рыбальченко, 1988, Слинченко и др., 1990]. Очищену і подрібнену м’язеву тканину тонкого кишечника гомогенізували за допомогою гомогенізатора “Політрон” у 4 об’ємах буфера (20 мМ гістидин, 1 мМ ЕДТА, 0,2% NaN3, 1 мМ меркаптоетанол, 125 мМ КС1, 0,1 мМ фенілметансульфонілфторид, 12,7 мМ NaHCO3, рН 7,2) Центрифугували 10 хв при 3000g, надосадову рідину нашаровували по 20 мл на градієнт щільності сахарози (6 мл 30%-ї та 5 мл 15-%-ї сахарози у середовищі гомогенізації без NaHCO3, але з 0,7 М КС1 і 2 мМ ЕГТА). Центрифугували 1 год при 105000 g. Збирали шар ПМ, розводили суспензію середовищем гомогенізації (без КС1, NaHCO3 та ЕГТА) та центрифугували 1 год при 105000 g. Осад ПМ суспензували у 1-2 мл середовища складу: 130 мМ КС1, 20 мМ НЕРЕS, рН 7,4, 0,5 мМ MgCl2, 0,05 мМ СаCl2 та 2 мМ дитіотрейтолу.
ПМ гепатоцитів печінки щурів виділяли, базуючись на методі [Song et al., 1969]. Промиту в 0,9% NaCl і подрібнену печінку гомогенізували в скляному гомогенізаторі Даунса зі слабко притертим тефлоновим поршнем у 2 об'ємах буферу А (1мМ NаНСО3, 1мМ ЕДТА-Nа, рН 7,5) на холоді. До гомогенату додавали 7 об'ємів буферу А, відфільтровували через 4 шари марлі. Центрифугували при 1500g 10хв. До осаду додавали буфер А до кінцевого об'єму (мл), що відповідає вихідній вазі сирої печінки (г), потім – 5,5 об'ємів сахарози щільністю 1,26. В центрифужні пробірки об'ємом 35 мл вносили 14 мл суспензії, на неї нашаровували 9 мл сахарози щільністю 1,18 і 10 мл сахарози щільністю 1,16. Центрифугували 60 хв при 66 000g, t 2-4°С. Збирали фракцію ПМ між двома верхніми шарами сахарози, двічі відмивали центрифугуванням (1500g 10 хв) у 4 об'ємах буферу А. Кінцевий осад ресуспендували в 1 мл буферу. Чистоту фракцій ПМ контролювали за активністю маркерних ферментів. Вміст білку в препараті визначали за [Lowry et al., 1951].
Фосфоліпіди з мозку великої рогатої худоби виділяли для формування БЛМ. Білу речовину головного мозку гомогенізували в 17 об’ємах суміші А (хлороформ/етанол, 2:1). Гомогенат фільтрували через паперовий фільтр, об’єм доводили до початкового і додавали 0,2 об’єми 0,9% NaСl. Перемішували, центрифугували 20 хв при 1000 g для розподілу фаз. Верхню фазу видаляли, нижню зливали в циліндр для більш повного розподілу і видалення верхньої фази. Через 12 год, після відокремлення верхньої фази, поверхню нижньої фази ретельно промивали сумішшю В (хлороформ:етанол:58%NaCl=3:48:47 об.), випарювали до необхідної концентрації при 60 0C.
Визначення АТФ-азних активностей ПМ. Активність високоафінної Мg2+,Са2+-АТФази ПМ гепатоцитів визначали за різницею між АТФазними активностями у середовищі (50 мМ Трис-НСl, 30 мкМ ЕГТА, 70 мкМ KCl, рН 7,5) з додаванням 1 мкМ СаСl2 і без нього. Вміст ПМ становив 20 мкг білка на 0,5 мл середовища інкубації (за [Lotersztain,1981]). Реакцію ініціювали додаванням 3 мМ АТФ, рН 7,4, інкубували 10 хв при 37єС, зупиняли додаванням холодної ТХО (до 10%). Низькоафінну Mg2+,Ca2+-АТФазну активність визначали в аналогічних умовах, але при відсутності ЕГТА у інкубаційному середовищі та додаванні 300 мкМ СаСl2 для активації ферменту. Кількість продукту реакції (неорганічного фосфату, нмоль Рн/(хв⋅мг білка)), визначали за [Rathbun, Betlach, 1969] фотометрично при 660 нм.
Експериментальні дані обробляли методами варіаційної статистики. Розраховували значення середніх арифметичних величин (М), середнє квадратичне відхилення (σ) і помилку середньогої (±m). Достовірність різниці рядів експериментальних даних з нормальним розподілом значень оцінювалась за t-тестом з урахуванням нерівності дисперсії. Взаємозв’язок між ознаками оцінювали за коефіцієнтом кореляції Пірсона r. Обробку даних проводили з використанням програм статистичного пакету аналізу Microsoft Excel.
Результати досліджень та їх обговорення
Порівняльний аналіз амінокислотного складу досліджених мембраноактивних регуляторних пептидів і пептидів з цитотоксичними і антибактеріальними властивостями. Останніми роками активно досліджуються механізми мембранолітичної дії антибактеріальних пептидів (АБП), близьких до них за механізмами дії вірусних „пептидів злиття” і цитотоксичних пептидів з отрут деяких членистоногих. Багато з цих пептидів в ліпідному оточенні формують б-спіральну структуру з різною орієнтацією, мають каналоформуючу здатність [Matsuzaki et al., 1991-1999]. При цьому більшість з АБП діють переважно на клітини прокаріотів, майже не впливаючи на мембрани клітини-хазяїна, що пов’язують з особливостями біохімічного складу мембран (відносна ліпідна асиметрія з переважанням кислих ліпідів в зовнішньому моношарі мембран прокаріотів і у цитоплазматичному – в ПМ еукаріотичних клітин) і особливостями самих пептидів (АБП мають високий вміст позитивно заряджених амінокислотних залишків, що забезбечує ефективну електростатичну взаємодію з аніонними бактеріальними мембранами, і характеризуються високою загальною гідрофобністю, завдяки якій проникають в зону ацильних ланцюгів ліпідного бішару).
Нами раніше були встановлені безрецепторні пептид-мембранні взаємодії для нейрогіпофізарних гормонів і їх аналогів і показано значення особливостей їх амінокислотного складу для реалізації прямих пептид-мембранних взаємодій і їх інтенсивності [Островська, 1995]. Ми припустили, що такі особливості можуть лежати в основі первинних механізмів пептид-мембранної взаємодії і для інших ендогенних пептидів з регуляторною дією на тваринні клітини. Виходячи з наших попередніх досліджень і з даних по АБП і цитотоксичним пептидам [Yeaman, Yount, 2003] важливу роль повинні відігравати як гідрофобність молекул, так і відносна кількість полярних залишків у них.
Проаналізовано вміст амінокислотних залишків (АКЗ) для послідовностей 14 РП, для яких нами встановлена мембранотропна активність (кіоторфіну, меланостатину, тироліберину, пентагастрину, Мет- і Лей-енкефалінів, їх аналога Љ-77, нейротензину, вазопресину, окситоцину і дезаміноокситоцину, субстанції Р, ангіотензину І і брадикініну), у порівнянні з амінокислотним спектром АБП (проаналізовна група з 498 пептидів з середньою довжиною 27,82 АКЗ з бази даних The Antimicrobial Peptide Database) і загальним поширенням певних АКЗ в білках еукаріотів цілому (за [Gilis et al., 2001]).
В амінокислотному складі мембраноактивних РП виявлено низку особливостей (рис.1). По-перше, РП, як і мембраноактивні антибактеріальні пептиди, містять більше гідрофобних та менше гідрофільних АКЗ порівняно з вмістом відповідних АКЗ у білках еукаріотів (в білках гідрофобних АКЗ в середньому 45%, тоді як в АБП їх вміст зростає до 50,8%, а в РП – до 58,5%). По-друге, спектр гідрофобних АКЗ в АБП і в РП є протилежним за вмістом більшості залишків. По-третє, РП і АБП характеризуються збільшеним вмістом Gly i позитивно зарядженого Arg, але вміст позитивно зарядженого Lys, який вважається істотним для взаємодії з аніонними ліпідами бактеріальних мембран, у складі РП знижений не тільки порівняно з АБП, але й з білками взагалі. Гідрофільний залишок Gly належить до найбільш розповсюджених як в АБП, так і в ендогенних РП (рис.1), він присутній в більшості досліджених нами РП і, очевидно, має важливе значення для ефективної взаємодії з мембранами.
Рис.1. Поширеність АКЗ в еукаріотичних білках, антибактеріальних пептидах і досліджених мембрано-активних РП. АКЗ розташовані за зростанням гідрофобності [Carugo, 2003].
На нашу думку, саме такі особливості спектру гідрофобних АКЗ забезпечують різну поведінку пептидів двох функціональних груп в ліпідному матриксі мембрани – схильність до формування б-спіралей і в- структур при утворенні пептидних комплексів для АБП і формування інших, унікальних конформацій для кожного з РП. Додатковий аналіз амінокислотного спектру цих двох груп пептидів підтверджує це припущення. На рис.2 представлено розподіл амінокислотного спектру досліджених РП за схільністю до формування б- і в-структур відповідно (значення параметрів Рб і Рв – наведені за [Кантор, Шиммел,1984]). Позначення Ві відповідають залишкам, які активно заважають формуванню відповідної структури, bi – скоріш за все заважають, ii, Ii – індиферентні для формування даної структури, hi – схильні до формування даної структури, Hi – активно сприяють її формуванню.
Рис. 2. Розподіл амінокислотного спектру досліджених регуляторних пептидів за зростанням параметру Рб - схільністю до формування б-спіралей (А) і параметру Рв - схільністю до формування в-структур (Б) (пояснення – у тексті).
В складі досліджених РП переважають АКЗ, які перешкоджають або не сприяють формуванню б-структур. В першу чергу, це залишки Gly, Pro i Tyr, які найбільш широко представлені в регуляторних пептидах. Відносний вміст АКЗ, які сприяють формуванню в-структур є більшим, що робить формування таких структур більш ймовірним, але високий вміст залишків Pro і Gly в РП, очевидно, часто не сприятиме формуванню і цих структур також. В той же час, в антибактеріальних пептидах розподіл АКЗ з різною схильністю до формування б-спіралей є більш рівномірним – в них зменшується вміст АКЗ, що перешкоджають їх формуванню (в основному за рахунок залишків Pro i Tyr) і, навпаки, зростає поширеність залишків, які не заважають (Lys,Ile) або сприяють формуванню б-спіралей (Leu, Ala). Саме за вмістом вказаних залишків і спостерігається різниця в амінокислотному складі двох різних за функціями груп пептидів при їх приблизно рівних параметрах гідрофобності.
Можна припускати, що якщо основним призначенням структури (амінокислотного складу) антибактеріальних і цитотоксичних пептидних молекул є утворення порових комплексів різної будови на основі формування б-спіралей, а також в-структур, то для пептидів регуляторної дії це буде формування специфічної, унікальної для кожного пептиду конформації, що може сприяти його ефективній взаємодії з рецептором.
Розрахунки параметрів гідрофобності і теоретичне прогнозування мембранотропної активності регуляторних пептидів. На основі наведених даних зроблено припущення про важливу роль гідрофобності молекул мембранотропних РП у забезпеченні їх здатності взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран. Для оцінки цієї ролі у прояві властивостей РП і порівняння їх з мембраноактивними АБП і відомими внутрішньомембранними білками ми застосували підхід, запропонований Ч.Тенфордом [Nozaki,Tanford, 1971] і його послідовниками Barrantes [1975] і Raftery et al. [1976]. За цим підходом розраховується загальна гідрофобність молекули Нш за вільною енергією переносу її амінокислотних залишків між полярним і неполярним оточенням (ΔGiпер), співвідношення полярних і неполярних амінокислотних залишків в молекулі (показник R) і лінійна дискримінантна функція Z, яка оптимально поєднує параметри Нш, і R для чіткого розмежування білків з зовнішньою і внутрішньою локалізацією в мембранах. За нашими даними, підхід дозволяє прогнозувати мембранотропні властивості регуляторних пептидів і використаний нами також для оцінки властивостей ряду інших ендогенних РП з потенційною мембранотропністю (табл.1).
За параметрами гідрофобності (Нш і Z) мембранотропні РП перевищують значення відповідних параметрів молекул внутрішньомембранних білків і практично співпадають з параметрами АБП (рис.3). В групі пептидів з можливою мембранотропністю Ці показники знижені, але близькі до відповідних параметрів внутрімембранних білків.
Рис.3. Порівняння параметрів гідрофобності молекул білків і пептидів з різними мембрано-тропними властивостями
НМБ – немембранні білки; ЗМБ – зовнішні мембранні білки; ВМБ – внутрішні мембранні білки; АБП – антибактеріальні пептиди; Досл_РП – досліджені мембраноактивні РП; Інші РП – регуляторні пептиди з потенційними мембранотропними ефектами.
Проведені розрахунки свідчать не тільки про можливість теоретичного визначення характеристик досліджених пептидів, але й дозволяють у першому наближенні встановити ймовірне положення молекул РП у ліпідному матриксі мембрани. Результати теоретичних розрахунків можуть бути важливими для попереднього скринінгу потенційно активних РП та стати підставою для проведення експериментальних досліджень взаємодії РП з штучними та біологічними мембранами.
Таблиця 1
Параметри гідрофобності антибактеріальних і регуляторних пептидів з встановленою і можливою мембранотропною активністю
Пептид Нш R Z
АБП 1,499±0,087 0,650±0,092 0,636±0,062
РП з встановленою нами мембранотропною активністю
Кіоторфін Tyr-Arg 1,8 1 0,735
Меланостатин Pro-Leu-Gly-NH2 1,67 0,5 0,655
Тироліберин Glu-His-Pro-NH2 1,52 2 0,222
Мет-ЕНК Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 1,31 0,0 0,786
Лей-ЕНК Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu 1,53 0,0 0,918
Љ-77 Lys(TFA)-Tyr-D-Ala-Gly-Phe(NO2)-NH2-AcOH-2H2O 1,55 0,25 0,844
Пентагастрин Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 1,50 0,25 0,813
Нейротензин Glu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu 1,749 1,6 0,497
Окситоцин H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 1,410 0,5 0,673
Вазопресин H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 1,193 0,8 0,448
Дезаміноокситоцин H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly ≥1,410 0,5 ≥0,673
Субстанція Р H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 1,477 1,2 0,472
Ангіотензин І Asp—Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-OH 1,926 1 0,811
Брадикінін Arg-Pro-Pro-Gly-Ser-Pro-Phe-Arg 1,499 1,7 0,313
M±m 1,539±0,052 0,843±0,169 0,634± 0,056
Інші РП з можливою мембранотропною активністю
Меланотропін, бомбезин, кальцитонін, глюкагон, АКТГ, інсулін, β-ендорфін, кортиколіберин, M±m 1,181±0,053 1,158±0,131 0,410±0,082
Поверхнева і мембранотропна активність регуляторних пептидів.
Для низки регуляторних пептидів з різними структурними особливостями досліджено поверхневу і мембранотропну активність. Всі досліджені пептиди проявляють слабко виражену поверхневу активність, формуючи локальні або розтягнуті адсорбційні моношари на поверхні розподілу фаз електроліт–повітря. Проте всі вони в тій чи іншій мірі взаємодіють з мембранними структурами з різними фізико-хімічними характеристиками, впливаючи на їх властивості.
Мембранотропні властивості дипептиду кіоторфіну, вплив оптичної ізомерії на особливості його взаємодії з мембраною. Кіоторфін (КТ) – опіоїдний дипептид мозку (Н-Туг-Arg-OH), викликає анальгезивний ефект в 4 рази більший, ніж мет-енкефалін, але зв’язується з іншим видом рецептора, з двома типами афінності [Ueda et al., 1989,2000]. Ми дослідили особливості мембранотропних властивостей КТ і залежність їх прояву від вмісту L- і D-амінокислот в його ізомерах, оскільки короткий дипептид є зручною моделлю для комбінування в ньому АКЗ з різною оптичною ізомерією (D-D, D-L, L-D, L-L). Основна роль в стереоселективності фармпрепаратів звичайно відводиться особливостям їх взаємодії з білковими рецепторами [Алексеев, 1998], ферментами і транспортуючими системами [Rentsch, 2002], різному розподілу в тканинах [Zhou et al., 2002]. Практично не приділяється уваги такому фактору, як механізми зв’язування цих ізомерів з мембранами клітин-мішеней, зокрема ролі ліпідного матриксу в реалізації стереоселективності.
Молекула природного КТ має унікальну амфіфільну структуру – вона включає високогідрофобний Tyr і полярний заряджений Arg. Проте, мінімальна довжина КТ, очевидно, не може дозволити йому глибоко проникнути в гідрофобний кор мембрани – полярний Arg, теоретично, повинен залишитися в зоні ліпідних головок. При цьому загальні параметри гідрофобності КТ досить високі – при рівному спввідношенні полярних і неполярних залишків (R=1) його середня гідрофобність Нϕ (1,8 ккал/моль), перевищує відповідний показник більшості інших мембраноактивних пептидів (табл.1), а дискримінантна функція Z з урахуванням цих двох показників – 0,735.
Слабко виражену поверхневу активність виявляє лише дипептид типу L-L, який формує розтягнуті моношари низької щільності (р=1,1 мН/м і ц=+574 мВ при концентрації дипептиду 10-5М). Інші ізомери в фізіологічних концентраціях (10-11–10-5М) практично не утворюють власних адсорбційних моношарів, хоча і концентруються у незначній кількості поблизу поверхні розподілу фаз “розчин електроліту–повітря”, значно збільшуючи граничний стрибок потенціалу (до +400 – +600 мВ ) при відсутності змін поверхневого тиску в системі.
Наявність ліпідного моношару на межі розподілу фаз сприяє значній інтенсифікації адсорбції дипептидів субфази і їх проникненню у моношар, але мембранотропна активність кожного з ізомерів різна і залежить також від початкової щільності мембрани. Найбільшою вона є при взаємодії дипептидів з мембранами початкової щільності 4-6 мН/м. В цьому діапазоні мембранотропна активність досліджених препаратів, достовірно розподіляється у ряд L-L > D-L > L-D > DD (рис.4).
Рис. 4. Залежність зміни поверхневого тиску в азолектинових мембранах від їх початкової щільності (р0) при взаємодії з ними оптичних ізомерів кіоторфіну (КТ, 10-6М).
При ущільненні мембран вище 8 мН/м, енантіомери з D-амінокислотними залишками практично повністю втрачають здатність взаємодіяти з фосфоліпідними мембранами, тоді як ізомер L-L не тільки не втрачає, а навіть продовжує збільшувати свою мембранотропну активність
Максимально модифікує азолектинові моношари ізомер із лівообертаючих амінокислот L-L, підвищуючи тиск в щільно упакованих моношарах до 20-25 мН/м. На відміну від дипептидів D-L і L-D концентраційна залежність змін поверхневого тиску азолектинових моношарів різної щільності L-L-дипептидом має виражений сигмоподібний характер з максимальною адсорбцією при концентраціях 5⋅10-9 – 5⋅ 10-7 М (рис.5). Характер зміни ГСП при цьому також відрізняється від інших оптичних ізомерів (рис.6).
Рис.5. Характер змін поверхневого тиску в азолектинових моношарових мембранах з близькою початковою щільністю (ро= 4,7±0,2 мН/м) при взаємодії з ними оптичних ізомерів кіоторфіну (КТ).
Рис.6. Характер концентраційної залежності зміни ГСП азолектинових мембран з близькою початковою щільністю (ро= 4,7±0,2 мН/м, цо=175± 5 мВ) при взаємодії з ними оптичних ізомерів кіоторфіну (КТ).
Найменшу активність виявляє форма D-D, яка навіть в концентрації 10-5 М викликає дуже незначні зміни стану азолектинового моношару за показниками як поверхневого тиску (рис.5), так і ГСП (рис.6). Ізомери D-L і L-D активніше взаємодіють з азолектиновими моношарами і викликають подібний характер змін поверхневого тиску в мембрані, але D-L в більшій мірі підвищує щільність азолектинових моношарів, проявляючи більш активну дію в області низьких концентрацій (10-11-10-9М). Характерним є і значне підвищення величини стрибка потенціалу модифікованого азолектинового моношару в області концентрацій цих двох оптичних форм дипептиду 10-7- 10-6 М, яке може свідчити про інтенсивне накопичення препаратів в полярній зоні мембрани.
Подібна динаміка змін характеристик ліпідного моношару під дією L-L-ізомеру пептиду свідчить про його активне вбудовування між ліпідними молекулами (в області гідрофобних жирнокислотних “хвостів”), тоді як ізомери типу L-D і D-L в більшій мірі концентруються в області полярних ліпідних головок за рахунок електростатичних взаємодій.
При взаємодії L-L-ізомера з моношарами, сформованими із ПМ міоцитів тонкого кишківника кроля мембранотропність дипептиду знижується, а характер змін ГСП стає подібним до змін, індукованих дипептидами типу L-D і D-L. Проте, як і у випадку фосфоліпідних мембран зберігається здатність L-L-ізомеру більш активно взаємодіяти з більш щільними моношарами з ПМ, зокрема, при концентраціях КТ вище 10 –8 М.
Отже, ліпіди в складі біологічних мембран сприяють активній взаємодії ізомера L-Tyr-L-Arg з ними, тоді як білки, які присутні в плазматичних мембранах, очевидно, завдяки своїм зарядам або гідрофільно-гідрофобному балансу, знижують інкорпорацію дипептиду в ділянку жирнокислотних хвостів ліпідного матриксу, і він концентрується в області полярних ліпідних головок, впливаючи, в основному, на електричні характеристики мембрани. Можливо, в даному випадку важливе значення має і надзвичайно малий розмір молекули РП, який не дає змоги гідрофобному залишку Tyr подолати гідрофільний бар’єр білково-вуглеводного шару і досягнути гідрофобного кору мембрани.
За зменшенням мембранотропної активності по відношенню до фосфоліпідного матриксу досліджувані оптичні ізомери дипептиду Tyr-Arg розташовуються в ряд: L-Tyr-L-Arg>D-Tyr-L-Arg>L-Tyr-D-Arg>D-Tyr-D-Arg, що повністю співпадає з розподілом їх анальгетичної активності [Громов, 1992] і свідчить, з одного боку, про значну роль оптичної активності амінокислот в складі біорегулятора у прояві його мембранотропних властивостей, а з другого – про важливу участь саме ліпідного матриксу мембрани в реалізації біологічної дії і стереоселективності ряду пептидних препаратів.
Мембранотропні властивості трипептиду меланостатину (меланотропін-інгібуючий фактор, МІФ-1). МІФ-1 належить до групи гіпоталамо-гіпофізарно-епіфізарних нейропептидів, як і інші нейропептиди, проявляє поліфункціональність (натрійуретичну [Громов,1992] і антиопіоїдну дію [Kastin et al.,1985], анальгезуючі властивості [Bocheva,Lazarova,2003], високу активність в різних поведінкових тестах [Булаев, 1987]). МІФ-1 складається з трьох незаряджених АКЗ (табл.1) і співпадає з C-кінцевим доменом окситоцину, яка, як вважається, відповідає за спрямовану доставку і контакт молекули гормона з рецептором [Папсуевич и др., 1986]. Всі три АКЗ в складі МІФ-1 належать до найбільш розповсюджених як в мембраноактивних АБП, так і в проаналізованих нами пептидах (рис.1). МІФ-1 має високі показники гідрофобності, які значно перевищують середні показники для внутрішньомембранних білків, що розташовуються в зоні найвищої гідрофобності ліпідного кору.
При формуванні ліпідних моношарів на поверхні 0,01 М КCl МІФ-1 практично не взаємодіє з ними – не викликає змін поверхневого тиску, але веде до повільних флуктуацій ГСП ( ±30-50 мВ). Проте, при застосуванні як субфази фізіологічного розчину (іонна сила 0,154 г-екв/л) МІФ-1 набуває здатності взаємодіяти з достатньо щільними азолектиновими моношарами – при цьому значні зміни поверхневого тиску (до 2 мН/м) відбуваються вже при концентрації МІФ-1 10–11 М (рис. 7). Розрахована мінімальна концентрація мембранотропної дії меланостатину в таких умовах Смін =8 · 10–15 М. Проте після досягнення наномолярних концентрацій пептиду інтенсивність процесу адсорбції знижується в 1,6 раза (ГІ= 1,739 · 10 -7 М/м2, вище наномолярних концентрацій ГІІ=1,094·10-7М/м2), не спостерігаються і зміни ГСП
|
