|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
РОМАНОВА
ОЛЕНА ПЕТРІВНА
УДК 577.346:217.612.014.613.648
ОЦІНКА ВПЛИВУ НА ЛЮДИНУ НИЗЬКОПОТУЖНОГО ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ В МАЛИХ ДОЗАХ ЗА ТЕСТОМ ЧАСТОТИ МІКРОЯДЕР
У ЛІМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ
03.00.01 – “радіобіологія”
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2000
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в лабораторії радіобіології Наукового центру “Інститут ядерних досліджень” НАН України.
Науковий керівник: кандидат біологічних наук
Бездробна Лариса Костянтинівна
Науковий центр “Інститут ядерних досліджень”
НАН України, зав.лабораторією радіобіології
Центра екологічних проблем атомної енергетики.
Офіційні опоненти: докор біологічних наук, професор
Цудзевич Борис Олександрович
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,
професор кафедри біохімії біологічного факультету;
кандидат біологічний наук,
Лавренчук Галина Йосипівна
Інститут експериментальної патології, онкології
і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,
старший науковий співробітник відділу радіобіології.
Провідна установа: Український науковий центр радіаційної медицини
АМН України .
Захист дисертації відбудеться “ 27 ” березня 2000р. о 16 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: Київ-127, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд.215.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету:
вул. Володимирська 58.
Автореферат розісланий “ 11 ” січня 2000р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. З кожним роком значно поширюється використання ядерних технологій і, як наслідок, збільшується кількість людей, які працюють в умовах професійного опромінення. В той же час, за останні десятиріччя на ядерних об’єктах відбувся ряд аварій, що призвели до забруднення радіонуклідами довкілля і опромінення населення [Neton J.C. et al., 1989]. Дана проблема стала життєво важливою для України після Чорнобильської катастрофи – найбільшої техногенної аварії в історії людства – коли постраждало більше 3,5 млн. її населення, основна частина якого продовжує проживати на забруднених радіонуклідами територіях.
Відомо, що пошкодження генетичного матеріалу соматичних й статевих клітин, які виникають при опроміненні в малих дозах, викликають два основних ризики для здоров’я людини – індукцію злоякісних новоутворень й спадкову патологію. Частота проявлення цих ефектів є функцією дози без наявності порогу [Coggle J.E.,1990; Мазурик В.К.,1999]. Тому є актуальною оцінка впливу на геном людини випромінювань в дозах, що перевищують фон на декілька порядків.
Однією з важливих проблем при вивченні ефектів малих доз є біоіндикація їхнього впливу. Для біологічної індикації й біодозиметрії променевого ураження організму та оцінки радіаційного ризику прийнято застосовувати головним чином облік аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові при рутинному забарвленні препаратів [Возилова А.В. и др., 1998; Stephan G. еt al., 1993]. Для оцінки дії пролонгованого опромінення в малих дозах більш адекватним є аналіз стабільних аберацій і мутацій [Пилинская М.А. и др., 1999; Nakamura N., et al., 1991; Brooks A.L., 1999]. Але для проведення популяційних обстежень людей використання хромосомного аналізу виявляється дуже трудомістким, потребує великих затрат часу. Автоматизація обліку хромосомних аберацій складна і поки що лише поодинокі лабораторії мають відповідне напівавтоматизоване обладнання [Сушкевич Г.Н., 1997]. Для визначення ряду соматичних мутацій розроблені автоматизовані технології, але вони передбачають використання коштовного обладнання. Все це спонукало в післячорнобильський період до пошуку більш простих і в той же час інформативних підходів для первинних цитогенетичних популяційних обстежень.
З цією метою в останні роки вивчається інформативність аналізу мікроядер (МЯ) в клітинах периферичної крові в умовах хронічного впливу малих доз опромінення [Пелевина И.И. и др.,1996, 1999; Ильинских Н.Н. и др., 1998; Wuttke K., et al., 1996].
МЯ формуються з ацентричних фрагментів та втрачених під час клітинного поділу цілих хромосом. Тому МЯ є індикатором і пошкоджень хромосом, і їхнього нерозходження, що веде до анеуплоїдії. Аналіз МЯ значно простіший і значно легше піддається автоматизації ніж аналіз метафазних хромосом. Крім того, є припущення, що у діапазоні малих доз МЯ-тест більш чутливий до дії іонізуючої радіації ніж тест хромосомних аберацій [Kormos С. et al., 1988].
На теперішній час існує ряд розробок методів автоматизованого обліку МЯ, серед яких найбільш перспективними є методи проточно-цитофлуориметричного аналізу [Schrelber G.A. et al., 1992; Bocker W. et al., 1996]. Але вони вимагають використання коштовних дволазерних проточних цитофлуориметрів і мають ряд методичних складностей.
Враховуючи зазначене вище, вивчення можливостей застосування мікроядерного аналізу для виявлення пошкоджень генетичного матеріалу лімфоцитів периферичної крові при хронічному низькопотужному опроміненні людини і автоматизація цього аналізу є доцільними й актуальними.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках Української національної програми ліквідації наслідків Чорнобильської катастрофи і соціального захисту громадян за темами “Автоматизована система біодозиметрії малих доз іонізуючої радіації та інших генотоксичних чинників навколишнього середовища” (1993-1995) № держреєстрації 0194U016675, “Вивчити вплив тривалої дії низьких рівнів іонізуючого опромінення різних видів на геном лімфоцитів крові з метою їх біоіндикації та прогнозування наслідків” (1993-1995) № держреєстрації 0194U016546, а також в рамках бюджетної теми Інституту: “Дослідити деякі механізми тривалої постійної дії іонізуючого випромінювання з малою потужністю дози на експериментальних тварин і людину з метою визначення зв`язку з віддаленими наслідками” (1996-1999) № держреєстрації 0197U016404.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є оцінка впливу низькопотужного іонізуючого випромінювання в малих дозах на людей, які проживають на радіаційно-забруднених територіях або працюють в умовах професійного опромінення, за тестом частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові; визначення придатності тесту для біоіндикації і біодозиметрії, можливості виявлення осіб з потенціальним ризиком для здоров’я.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:
- Дослідити характер дозової залежності частоти цитогенетичних пошкоджень у лімфоцитах периферичної крові людини при низькопотужному опроміненні in vitro в межах малих доз.
- Вивчити частоту МЯ в лімфоцитах периферичної крові клінічно здорових киян в залежності від статі, віку і звички до куріння.
- Дослідити частоту МЯ в лімфоцитах периферичної крові самоселів 30-кілометрової зони відчуження ЧАЕС і визначити її залежність від рівня радіаційного навантаження.
- Дослідити частоту МЯ в лімфоцитах периферичної крові людей за умов профопромінення і визначити її залежність від рівня радіаційного навантаження.
- Модифікувати і апробувати методику автоматизованого обліку МЯ в лімфоцитах периферичної крові людей на оригінальній проточно-цитофлуориметрічній системі, створеній в НЦ “Інституті ядерних досліджень”.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено частоту МЯ в лімфоцитах периферичної крові людини, опромінених in vitro при потужності дози і в межах доз близьких до умов профопромінення, і показано, що характер дозової залежності індукції МЯ в лімфоцитах крові людини складний нелінійний і подібний до характеру дозової залежності індукції аберацій хромосом.
Вперше встановлено залежність частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові людей від рівня забруднення територій їхнього проживання 90Sr, середньогрупових і індивідуалізованих доз опромінення на червоний кістковий мозок, а також більшу чутливість до низькопотужного опромінення в малих дозах людей молодого віку.
Модифіковано методику автоматизованого аналізу МЯ в лімфоцитах периферичної крові людей для оригінальної проточно-цитофлуориметричної системи, створеної в НЦ “ІЯД”, та для інших проточних цитофлуориметрів, в яких джерелом збудження флуорохромів є ртутна лампа.
Практичне значення одержаних результатів. Показано, що тест частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові можна застосовувати при обстеженнях людей для індикації впливу на них хронічного низькопотужного опромінення. Результати мікроядерного аналізу можуть бути підставою для рекомендації подальшого поглибленого обстеження стану здоров’я індивідуумів.
Запропонована модифікація методики автоматизованого обліку МЯ в лімфоцитах крові людей для оригінальної проточно-цитофлуориметричної системи, створеної в НЦ “ІЯД” (або інших проточних цитофлуориметрів, в яких джерелом збудження флуорохромів є ртутна лампа), дозволить завдяки значному прискоренню часу проведення аналізу при підвищенні вірогідності його результатів застосувати даний метод при популяційних обстеженнях людей, які зазнають впливу іонізуючого випромінювання.
Особистий внесок здобувача. Всі дослідження, результати яких викладені в дисертації, (крім розрахунків дозових навантажень), їхня статистична обробка й науковий аналіз виконані особисто здобувачем.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на Науковій конференції “Актуальные вопросы ретроспективной, текущей и прогнозной дозиметрии облучения в результате Чернобыльской аварии” (Україна, 1992), Міжнародному семінарі “Ядерные методы в изучении загрязнения окружающей среды” (Україна, 1993), Міжнародних конференціях “One Decade after Chernobyl: summing up the consequences of the Accident” (Австрія, 1996), “Radiation and Health”. (Ізраїль, 1996), “Отдаленные медицинские последствия Чернобыльской катастрофы” (Україна, 1998), на Міжнародних з’їздах: “Съезд по радиационным исследованиям” (Україна, 1995), “3 Съезд по радиационным исследованиям” (Росія, 1997), щорічних наукових конференціях НЦ “ІЯД” (1995, 1998,1999).
Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 3 статті, 1 препринт, 1 доповідь на Міжнародній конференції і 3 доповіді в Матеріалах щорічних наукових конференцій ІЯД НАН України, 4 тези доповідей на Міжнародних конференціях і з’їздах, 1 пріоритетна довідка про авторську заявку на винахід.
Структура і об’єм дисертації. Дисертація викладена на 131 сторінці машинописного тексту та складається з вступу, огляду літератури, власних досліджень, обговорення, висновків. Список використаної літератури нараховує 249 джерел, з них 155 англомовні. Матеріали дисертації проілюстровані 16 таблицями і 20 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи досліджень
Подана робота є цитогенетичним дослідженням, виконаним на лімфоцитах периферичної крові людей.
Згідно з поставленими задачами обстежені такі групи людей:
Жителі Києва: 102 клінічно здорові особи (75 чоловіків і 27 жінок) віком від 21 до 67 років. Всі обстежені не мали свідомого контакту з радіаційними і хімічними мутагенами.
Самосели 5 сіл 30-кілометрової зони відчуження ЧАЕС: Городище, Іллінці, Луб’янка, Опачичі, Куповате. До групи самоселів увійшли люди, які після евакуації 4 травня 1986р. самовільно повернулися в зону в період з червня 1986 по квітень 1987 року, а також ті, які зовсім не залишали зони після аварії. Обстежено 26 осіб (13 чоловіків і 13 жінок) віком від 21 до 60 років. Ніхто з обстежених самоселів не приймав участі у ліквідації наслідків аварії безпосередньо на ЧАЕС.
Співробітники Міжгалузевого науково-технічного центру “Укриття” та Об`єкту “Укриття”, які у 1986–1987рр. приймали участь у ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС і у наступні роки продовжували працювати в зоні відчуження ЧАЕС. Обстежено 22 особи (20 чоловіків і 2 жінки) віком 37 - 60 років.
Профперсонал НЦ “Інститут ядерних досліджень” НАН України, який працює у службах дозиметричного контролю та експлуатації реактора ВВР-М і циклотронів П-120 й П-240. Група сформована з 22 чоловіків віком від 26 до 67 років.
Всі обстежені особи на час взяття крові не мали гострих захворювань й загострення хронічних і у них не було діагностовано онкозахворювань.
Проводили модельні експерименти з опромінення in vitro цільної крові киян. Кров опромінювали при температурі 37°С гамма-квантами 60Со на установці “Еталон” у діапазоні доз 0,075сГр – 7,5сГр з потужністю дози 0,005сГр/хв. На період опромінення в аналогічних умовах витримували контрольні проби неопроміненої крові. Для апробації автоматизованого аналізу МЯ кров опромінювали при кімнатній температурі гамма-квантами в сховищі відпрацьованого палива на реакторі ВВР-М у діапазоні доз 5сГр – 100сГр з потужністю дози 5сГр/хв.
Аналіз МЯ проводили в лімфоцитах периферичної крові методом блокування цитокинезу (ЦБ-метод) [Колюбаева С.Н., 1991]. У деяких дослідженнях паралельно проводили аналіз аберацій хромосом при рутинному фарбуванні препаратів [Biol. Dosim.: Tech. Rep. №260, 1986]. Культивування лімфоцитів проводили: при аналізі ЦБ-методом – 72 год. з додаванням через 44 год. цитохалазину-Б, при аналізі хромосомних аберацій – 50 год. Аналізували зашифровані препарати під мікроскопом JENAVAL (Німеччина) зі збільшенням х900. При ЦБ-методі від кожного обстеженого аналізували по 1000 – 3000 двоядерних клітин, в експериментах in vitro – 5000 клітин. Показниками були частота МЯ і частота клітин з різною кількістю МЯ виражені в промілях. Аналіз хромосомних аберацій здійснювали з візуальним груповим каріотипуванням. Реєстрували всі аберації хроматидного і хромосомного типів. Пробіли не включали в число аберацій. Аналізували по 300 метафаз.
Розрахунок доз при опроміненні клітин in vitro проводили на підставі показників клінічного дозиметру 27012. На час опромінення використовували ТЛД дозиметри (з LiF пігулками).
Розрахунки ефективних доз опромінення самоселів виконували за стандартними програмами, базуючись на даних середньої щільності радіонуклідного (90Sr, 137Cs, 239Pu) забруднення територій проживання [ICRP Publication: 30, 67. Part 2, 74. Part 4], тривалості і конкретного часу проживання осіб.
Дози зовнішнього опромінення профперсоналу НЦ “ІЯД” НАН України були надані Відділом радіаційної безпеки. Дані отримані на підставі показань індивідуальних дозиметрів ІФКУ, ДПГ-03, Д-2П.
Отримані результати опрацьовували на персональному комп’ютері з використанням програми статистичної обробки результатів “Origin-4.10”. Використовували такі підходи математичної статистики: непараметричний критерій Вілкоксона-Манна-Уітні (U-критерій), кореляцію рангів Спірмена і параметричні методи регресійного й кореляційного аналізу.
Результати власних досліджень та їхнє обговорення
Вивчення залежності частоти мікроядер у лімфоцитах периферичної крові людини від дози опромінення in vitro
Дослідження індукції МЯ в лімфоцитах периферичної крові в умовах пролонгованого опромінення in vitro в діапазоні доз 0,075 сГр – 7,5 сГр виявило складний нелінійний характер дозової залежності (рис.1). Проведений нами паралельно аналіз аберацій хромосом показав подібну дозову залежність для загальної кількості аберацій.
При всіх вивчених дозах, за виключенням дози 1,5 сГр, спостерігали вірогідне підвищення частоти МЯ над спонтанним рівнем. Реєстрували лімфоцити з декількома цитогенетичними пошкодженнями, причому при МЯ-аналізі – клітини навіть з 3-а й 4-а МЯ.
Рис.1 Залежність виходу цитогенетичних пошкоджень у лімфоцитах людини від дози гамма-опромінення крові in vitro:
? – мікроядра, ? – хромосомні аберації.
Таким чином, результати нашого дослідження свідчать, що підвищення потужності дози над природним фоном приблизно на 4 порядки не можна розглядати як безпечне для клітини.
Вивчення частоти мікроядер у лімфоцитах периферичної крові різних категорій людей
Вивчення частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові киян
При обстеженні групи жителів м.Києва нами виявлено, що діапазон МЯ в лімфоцитах периферичної крові становить 4–20 на 1000 двоядерних клітин і при середньогруповому віці 42,6 років середня частота МЯ – (10,5±0,5)‰. Серед обстежених киян переважна кількість осіб мала клітини тільки з одним МЯ і тільки 10,8 % індивідуумів мали по 1 клітині з двома МЯ і 2,9 % - по дві клітини з двома МЯ.
Оскільки при вивченні впливу малих доз низькопотужного опромінення in vivo для отримання коректних результатів необхідно виключити можливий вплив на вихід показників, що вивчаються, інших чинників (фізіологічних, способу життя тощо), ми дослідили залежність частоти МЯ в лімфоцитах крові киян від віку, статі і звички до куріння.
Виявлена вікова залежність виходу МЯ в лімфоцитах крові киян. З кожним роком життя частота МЯ збільшувалась на 3%, що добре узгоджується з результатами робіт [M.Fenech, A.Morley, 1985; Huber R. еt al., 1989]. При порівнянні груп курців і некурців виявлено, що у курців кількість МЯ в лімфоцитах вірогідно вища ніж у осіб, що не курять у 1,3 рази; до того ж у курців спостерігалася тенденція до збільшення кількості клітин з декількома МЯ. Нами не виявлено вірогідної різниці за частотою МЯ в лімфоцитах між жінками й чоловіками однакового віку.
Обстеження киян проводили паралельно з обстеженням самоселів 30-кілометрової зони відчуження ЧАЕС, профконтингентів зони відчуження ЧАЕС і НЦ “ІЯД” НАН України. З киян формували відповідні за віком, статтю і звичною до куріння групи порівняння до кожної групи осіб, що підпадали під дію радіаційного чинника.
Вивчення впливу умов зони відчуження ЧАЕС на частоту МЯ в лімфоцитах периферичної крові самоселів.
При обстеженні групи самоселів визначено вірогідне (р<0,001) збільшення частоти МЯ в лімфоцитах їх крові (14,6±0,8)‰ у порівнянні з відповідною групою киян (10,0±0,5)‰. У 19% обстежених самоселів виявлені клітини з 2 МЯ, причому в трьох осіб по декілька лімфоцитів з 2МЯ. В групі киян 11,5% осіб мали по одній клітині з 2 МЯ.
При порівнянні обох груп відносно залежності виходу МЯ від віку осіб нами було показано, що, по-перше, у самоселів на відміну від киян така залежність відсутня (R=0,32 з р=0,1 і R=0,73 з p<0,0001 відповідно), що, імовірно, пов’язано з додатковим опроміненням, і, по-друге, середньогрупове збільшення частоти МЯ у самоселів обумовлено в основному підвищеною частотою МЯ в лімфоцитах осіб молодого й середнього віку. Вікові залежності вірогідно відрізняються тільки в інтервалі віку 21 – 52 роки (рис.2).
Оскільки групу самоселів склали особи з 5 сіл 30-кілометрової зони, ми спробували виявити кореляцію між частотою МЯ в лімфоцитах їх крові і рівнем радіонуклідного забруднення територій проживання, а також розрахунковими середньогруповими дозами опромінення.
Враховуючи, що період півжиття лімфоцитів периферичної крові людини становить приблизно 3 роки, ми проводили аналіз не лише відносно інтегральних доз опромінення, а і доз за останні 3 роки перед обстеженням. Аналіз проводили за показником індукованої (надспонтанної) частоти МЯ в лімфоцитах самоселів. Надспонтанну частоту визначали як різницю між середньогруповою частотою МЯ в лімфоцитах самоселів з конкретних сіл і середньогруповою частотою МЯ в лімфоцитах відповідних підгруп киян. Виявлена вірогідна кореляція середньогрупової частоти індукованих МЯ в лімфоцитах самоселів з забрудненням 90Sr територій сіл і середньогруповими дозами на червоний кістковий мозок та внутрішнього опромінення на все тіло за весь післяаварійний період і за останні 3 роки перед обстеженням (табл.1).
Рис.2 Залежність частоти МЯ в лімфоцитах крові від віку
самоселів (•) і киян ()
Нами проведено аналіз залежності частоти МЯ в лімфоцитах самоселів від їхніх індивідуалізованих доз опромінення на червоний кістковий мозок (20мЗв – 140мЗв), на все тіло за весь післяаварійний період (зовнішнього: 12мЗв – 97мЗв і внутрішнього: 13мЗв – 96мЗв) і за останні 3 роки (зовнішнього: 2мЗв – 10мЗв і внутрішнього: 1мЗв – 5мЗв) та обчислено кореляційні зв’язки (табл.2, табл.3). Наведені у табл.2 результати регресійного аналізу залежності індивідуальної частоти надспонтанних МЯ в лімфоцитах самоселів від доз опромінення свідчать про відсутність кореляції між ними, але тенденційно зв’язок сильніший з дозами на червоний кістковий мозок і дозами на все тіло за останні 3 роки. Аналіз даних за критерієм Спірмена також не виявив кореляційного зв’язку. Щоб уникнути можливого впливу вікової радіочутливості на результати дослідження, нами було
відібрано для аналізу 9 самоселів однакового віку (36-38 років), які отримали різні дози опромінення (табл.3). Виявлена кореляція частоти МЯ з дозою опромінення на червоний кістковий мозок.
Беручи до уваги залежність індукції цитогенетичних пошкоджень в лімфоцитах крові від віку людей при гострому опроміненні [Бочков Н.П., 1971], ми провели аналіз такої залежності у самоселів за умов пролонгованої дії радіації. Була виявлена обернена лінійна кореляція між віком обстежених і частотою індукованих МЯ на одиницю дози опромінення, що свідчить про більшу радіочутливість молодих осіб. Як свідчать коефіцієнти кореляції, більш виразний зв’язок з віком визначається для частоти МЯ на одиницю дози на червоний кістковий мозок і на все тіло за останні 3 роки (табл.4).
Таблиця 2
Параметри лінійної залежності надспонтанної частоти МЯ в лімфоцитах крові самоселів від доз опромінення (n=26)
Таблиця 3
Коефіцієнти рангової кореляції частоти МЯ в лімфоцитах крові з індивідуалізованими дозами радіаційних навантажень для самоселів зони відчуження у віці 36-38 років (р = 0,05; n = 9)
*- вірогідна кореляція рангів за Спірменом
Напевно, що низькопотужне опромінення може призводити в геномі стовбурових клітин кісткового мозку до змін на молекулярному рівні, які при пролонгації опромінення на наступних стадіях визрівання лімфоцита і під час його циркуляції в периферії сприятимуть підвищенню нестабільності його генетичного апарату. Геном клітин кісткового мозку дітей, імовірно, є більш радіочутливим, що підтверджується визначеною нами найбільшою радіочутливістю лімфоцитів трьох осіб, яким на час початку пролонгованого опромінення було 11 – 13 років. Відомо, що в клітинах людей активність процесів репарації ушкоджень генетичного матеріалу з віком уповільнюється [Виленчик М.М., 1987]. Але ми припускаємо, що опромінення в умовах зони відчуження може гальмувати в людей похилого віку уповільнення репараційних процесів, хоча це потребує ретельного вивчення.
Таблиця 4
Параметри лінійної залежності надспонтанної частоти МЯ в лімфоцитах крові на одиницю дози опромінення від віку самоселів
Вивчення частоти мікроядер у лімфоцитах крові персоналу, що працює в умовах професійного опромінення.
При аналізі МЯ в лімфоцитах периферичної крові персоналу зони відчуження ЧАЕС і ядерних установок НЦ “ІЯД” було виявлене вірогідне збільшення середньогрупової частоти МЯ і частоти клітин з 2 МЯ порівняно з киянами (табл.5). У персоналу зони відчуження реєстрували навіть лімфоцити з 3-а й 4-а МЯ, чого не спостерігалося ні в групі профперсоналу НЦ “ІЯД”, ні в групі порівняння киян. Ми не мали даних про дозові навантаження та їхній розподіл у часі для профконтингенту зони. Можливо, виявлена у них підвищена нестабільність хромосом лімфоцитів, присутність клітин з множинними МЯ є в основному наслідком того, що дані особи зазнали значного впливу радіації під час ліквідації наслідків аварії. Дестабілізацію генома у ліквідаторів через 5 і 9 років після аварії, виявлену за МЯ-тестом з наявністю множинних МЯ в лімфоцитах, відмічали у роботах [Komar Е. et.al, 1996; Пилинская М.А., 1992]. Можна припустити, що лімфоцити з множинними МЯ, які ми спостерігали через 8-9 років, незважаючи на елімінацію клітин з периферичної крові, чи то є довгоживучі периферичні клітини, чи то вони обумовлені сумацією в геномі пошкоджень на молекулярному рівні, що зберігаються впродовж ряду поколінь стовбурових клітин органів імуногенезу і пошкоджень, що індукуються на їх фоні de novo за умов профопромінення в малих дозах. В основну групу обстеженого персоналу зони відчуження з 20 осіб ми не включили дві особи, які суттєво відрізнялися від інших за частотою мікроядер в лімфоцитах крові (72‰ і 75‰ проти максимального показника в основній групі 25‰). Нами було з’ясовано, що ці співробітники під час аварії отримали дози вищі за 100 сГр і продовжують у післяаварійний період активно виконувати роботи на 4 блоці ЧАЕС.
Підвищення частоти клітин з 2МЯ у профперсоналу НЦ “ІЯД” вказує на можливість індукції таких клітин і при хронічному профопромінені в малих дозах. Так, у киян клітини з 2МЯ зустрічалися у 10% осіб, у профперсоналу НЦ “ІЯД” - у 59%, а у профперсоналу зони відчуження ЧАЕС - у 87%.
Обстежена група профперсоналу НЦ “ІЯД” була сформована з осіб, які мали стаж роботи від 2 до 37 років і отримали дози опромінення за весь період роботи від 4мЗв до 367мЗв, за останні 3 роки – від 3мЗв до 38мЗв і за останній рік – від 0,6мЗв до 6мЗв.
Нами було проведено порівняльне дослідження підгруп співробітників НЦ “ІЯД”, що працюють на різних ядерних установках (циклотрони, реактор, “гарячі” камери) і мають різні радіаційні навантаження й умови роботи. Аналіз
отриманих результатів не виявив залежності між середньогруповими частотою МЯ й частотою клітин з 2МЯ і дозовими навантаженнями (за весь час роботи, за 3 і 1 останні роки перед обстеженням). В реальних умовах при роботі на різних атомних установках людина зазнає впливу радіації різної якості і хоча дози від густоіонізуючої компоненти невеликі, але завдяки високій ЛПЕ біологічна ефективність такого випромінювання може бути вагомою. Не виключено, що неурахування також фізичною дозиметрією інгаляційної компоненти опромінення ускладнює виявлення зв’язку між дозами і пошкодженнями хромосом. Крім того, відсутність кореляційного зв’язку між частотою МЯ і дозою опромінення може бути обумовлена різним розподілом дозових навантажень на персонал впродовж всього часу професійної діяльності. На це вказує відсутність такого зв’язку в середині окремих підгруп профперсоналу, який працює в однакових радіаційних умовах .
Таким чином, отримане в наших дослідженнях вірогідне перевищення середньогрупової частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові самоселів зони відчуження ЧАЕС, профконтингенту зони відчуження і НЦ “ІЯД”, свідчить про придатність МЯ аналізу для групової біоіндикації надфонового низькопотужного опромінення і визначення осіб з ризиком для здоров’я. На підставі визначення нелінійного характеру дозової залежності частоти МЯ в лімфоцитах периферичної крові при зовнішньому пролонгованому опроміненні in vitro і відсутності кореляції з дозами зовнішнього опромінення in vivo при проживанні або професійній діяльності людей в умовах хронічного надфонового опромінення можна заключити, що МЯ-тест не придатний для біодозиметрії малопотужного випромінювання. Проте, враховуючи наявність вірогідної кореляції між частотою МЯ і дозою внутрішнього опромінення на кістковий червоний мозок у самоселів зони відчуження ЧАЕС, доцільно проводити окремі дослідження для визначення придатності МЯ-теста для біодозиметрії випромінювання, що діє на червоний кістковий мозок.
Розробка модифікації автоматизованого методу реєстрації мікроядер
В НЦ “ІЯД” була створена оригінальна проточна цитофлуориметрична система реєстрації МЯ в лімфоцитах периферичної крові людини, в якій джерелом збудження флуорохромів є ртутна лампа [Меленевский А.Э. и др. 1994]. На основі методик запропонованих M.Nusse (1984) і G.Schreiber (1992) для обліку МЯ на проточному цитофлуориметрі ми розробили власну модифікацію метода, що дозволила підвищити ефективність виявлення МЯ і спростила процедури підготовки й аналізу зразків.
Для забарвлювання ДНК ми використали пару барвників – етидійбромід (ЕБ) та олівоміцин (ОлМ). Для збудження флуоресценції ОлМ вибрані смуги з діапазоном довжин хвиль 405 нм - 436 нм, а свічення флуоресценції реєструється в інтервалах з довжиною хвиль 480-550 нм та 600-650 нм. Оригінальність застосування цієї пари барвників в нашій системі полягає в тому, що збудження флуоресценції ЕБ відбувається лише за рахунок фотонів флуоресценції ОлМ. Це забезпечує значне послаблення фонового свічення ЕБ і призводить до підвищення чутливості методу. Також, на відміну від методики G.Schreiber розрахунок частоти МЯ проводили не відносно долі ядер у другому клітинному циклі, що визначаються в окремому експерименті, а відносно ядер, що знаходяться у стадіях S, G2, M першого і другого поділу, вміст ДНК в яких становить 120-220 % від вмісту ДНК в ядрах на стадіях G0 і G1. Цей підхід значно спрощує аналіз.
Для підбору оптимальних умов розділення ядер і МЯ (при мінімальному виході ядерних уламків) й стабільного їхнього забарвлення нами було досліджено залежність інтенсивності лізису лімфоцитів і забарвлювання ядерної ДНК від іонної сили розчину, концентрації в ньому іонів магнію, необхідних для зв’язку ДНК з ОлМ, від концентрації барвників. Проведені дослідження виявили, що оптимальним є такий лізуючий розчин: 15 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2, 3 мМ Na-цитрату, 94,2 мг/мл цукрози, 0,02 % тритону Х-100, 10 мкг/мл РНКази, 10 мкг/мл ЕБ, 20 мкг/мл ОлМ на 1х106 лімфоцитів. Експериментально було визначено діапазон реєстрації сигналів флуоресценції, що відповідає МЯ. В нашій системі він становить 0,5 – 5,0 % ДНК відносно ДНК всіх хромосом, що знаходяться в ядрі в стадії G0 й G1.
Дана методика була апробована при вивченні залежності виходу МЯ в лімфоцитах крові здорових киян при її гамма-опроміненні in vitro у діапазоні доз 5сГр – 100сГр (потужність дози 5сГр/хв). Аналіз МЯ проводили паралельно автоматизованим і візуальним методами (рис.3). Результати окремих вимірювань скоректовано на індивідуальні спонтанні значення вмісту МЯ для кожного з киян. Мінімальна доза гамма-опромінення, яку можна таким чином вірогідно визначити, становить 5сГр – 10сГр, що значно менше ніж методом, запропонованим G.Schreiber з співавторами (50сГр). При аналізі лімфоцитів ПЦФ-методом, як і при аналізі ЦБ - методом цих же проб, отримано кореляцію між частотою МЯ і дозою опромінення. Але при обліку МЯ ПЦФ-методом систематично визначається вірогідно вища у порівнянні з ЦБ-методом частота МЯ (в цілому на 20 %). Більша кількість МЯ, що реєструється при ПЦФ-аналізі, обумовлена тим, що нормування зареєстрованої кількості МЯ проводиться не на кількість лімфоцитів, що поділилися, а на пропорційну їм величину (відносно ядер, що знаходяться у стадіях S, G2, M першого і другого поділу). Враховуючи, що цим способом в одній пробі аналізуються десятки тисяч клітин, а при візуальному аналізі звичайно 1000 клітин, надійність отриманих результатів автоматизованим способом напевно повинна бути значно вищою.
Таким чином, отримані результати свідчать про можливість і доцільність використання розробленої нами модифікації методу автоматизованого обліку МЯ в лімфоцитах периферичної крові з метою біоіндикації дії радіаційного чинника на людину в малих дозах.
Рис.3 Залежність частоти індукованих гамма-квантами МЯ (‰) в
лімфоцитах периферичної крові донорів від дози опромінення
in vitro: Ў – ПЦФ-аналіз, < – ЦБ-аналіз
| 
