|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА
ШАХМАН
ОЛЕНА ВАСИЛІВНА
УДК 577. 115.3+577.161.3+577.352.333
ОСОБЛИВОСТІ ФІЗІОЛОГІЧНОЇ ТА МЕМБРАНОТРОПНОЇ ДІЇ БІОЛОГІЧНО АКТИВНОГО КОМПЛЕКСУ ФОСФОЛІПІДІВ З ГІДРОБІОНТІВ
03.00. 04 – Біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник – доктор біологічних наук, член-кор. НАН України
Донченко Георгій Вікторович,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,
завідувач відділу біохімії коферментів.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст.наук.співр.
Малишева Маргарита Костянтинівна,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідувач відділу нейрохімії;
кандидат біологічних наук
Клімашевський Віталій Мар’янович,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,
ст. наук. співр. відділу біохімії ліпідів.
Провідна установа – Київський університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії.
Захист відбудеться “22” лютого 1999 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий “21” січня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За останні роки увага дослідників звернена до питання застосування фосфоліпідів та поліненасичених жирних кислот, як лікувальних препаратів широкого спектру біологічної дії, що виявляють ефект при різних інтоксикаціях у печінці, ендокринних розладах та серцево-судинних захворюваннях [Patel J.M., 1993].
Останнім часом зроблено великий крок у розшифруванні значення ліпідних компонентів мембран, які виконують не лише структурну роль, але й беруть участь у ключових процесах передачі регуляторних сигналів, регуляції активності мембранозв’язаних ферментів. Адаптогенний характер при екстремальних ситуаціях та патологічних станах має зміна рівня фосфоліпідів, що пов’язані із змінами процесу їх синтезу та обміну речовин. Фосфоліпіди, як поверхнево-активні речовини, відіграють важливу роль у забезпеченні респіраторної функції та захисті легень від контакту з різними мікрочастками та з мікроорганізмами [Верболович В.П., 1983]. Біологічні мембрани тканин з різною функцією мають у своєму складі фосфоліпіди з певними варіантами жирнокислотних залишків. Від жирнокислотного складу фосфоліпідів залежить їх метаболічна активність, а також щільність або рідинність мембран [Правдина И.М., 1975]. На відміну від ссавців ліпіди морських організмів багаті полієновими жирними кислотами, особливо омега - ненасиченими ейкозапентаєновою та докозагексаєновою кислотами [Metzman M.S., 1978]. Питання про біологічні властивості, специфічну фізіологічну активність фосфоліпідів з морських організмів та механізм обміну в мембранах клітин не достатньо з’ясовано. Різноманітний жирнокислотний склад фосфоліпідів обумовлює існування різних пулів фосфоліпідів одного виду, що спричиняє виконання ними різних функцій -– від структурних та антиоксидантних до функцій регуляції активності ферментів, транспорту, передачі сигналів, - всіх процесів, які перебігають на рівні мембран. Тому вивчення біологічних властивостей, специфічної фізіологічної дії фосфоліпідів з морських організмів та їх регуляторної ролі в мембранах тканин організму визначає актуальність роботи у цьому напрямку.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені дослідження є органічною складовою частиною наукового напрямку роботи лабораторії технології біопрепаратів відділу коферментів Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України. Окремі розділи роботи виконувались згідно з планами науково-дослідних робіт по темах: “Розробка технології одержання із морських організмів фізіологічно активних сполук специфічної дії для потреб медицини” (НДР № державного реєстру ИА 01007145 р.), “Вивчення взаємозв’язку природних антиоксидантів та фосфоліпідів в регуляції структурно-функціонального стану мембран клітин з різною функцією” та науково-дослідних робіт, які одержали приоритетне фінансування за підсумками республіканських конкурсів: “Розробка нового засобу на основі фосфоліпідів з морських організмів, що має мембраностабілізуючі, антиоксидантні і сурфактантні властивості, впливаючого на обмінні та репаративний процеси”, “Регуляторний механізм обміну фосфоліпідів у мембранах клітин печінки і легень та роль природних антиоксидантів в регуляції структурної і функціональної організації мембран”, “Функціональні зміни репродуктивних та дихальних органів тварин під впливом малих доз радіації та розробка нових ефективних засобів відновлення змінених функцій за допомогою специфічних біорадіопротекторів з молюсків”.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення хімічного складу, специфічної фізіологічної активності, біологічних властивостей комплексу “морських” фосфоліпідів, що були виділені з молюсків, та вивчення їх обміну у мембранах клітин для створення природного ефективного профілактичного та лікувального засобу ліпідної природи з гідробіонтів.
Віповідно до основної мети в роботі вирішувались наступні завдання:
- Вивчити хімічний склад природного комплексу фосфоліпідів, отриманого з гонад головоногих молюсків, та визначити кількісний та якісний вміст фосфоліпідів, жирних кислот і амінокислот.
- Дослідити біологічні властивості та специфічну фізіологічну дію біопрепарату, створеного на основі комплексу “морських“ фосфоліпідів.
- Вивчити антиоксидантні властивості комплексу фосфоліпідів in vitro та in vivo та його вплив на систему антиоксидантного захисту організму.
- Дослідити роль “морських” фосфоліпідів у модуляції структурно-функціонального стану мембран клітин тварин.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було вивчено чімічний склад комплексу фосфоліпідів з гонад головоногих молюсків і показано, що їх головна відмінність від фосфоліпідів ссавців полягає в особливостях жирнокислотного складу. На основі “морських” фосфоліпідів вперше створено та охарактеризовано новий ефективний, природний, лікувально-профілактичний засіб - біопрепарат “Кальмофіл”, встановлено його сурфактантну, антиоксидантну та мембраностабілізуючу дію. Виявлено, що мембранотропна дія фосфоліпідів з гідробіонтів пов’язана з регуляцією структурно-функціонального стану мембран і що даний фосфоліпідний комплекс має широкий спектр фізіологічної та фармакологічної активності.
Практичне значення отриманих результатів. Базуючись на наведених експериментальних даних, виявлено, що досліджуваний препарат “Кальмофіл” є ефективним у лікуванні ряду експериментальних патологій: він запобігає розвитку набряку легень, коригує недостатність сурфактанту та поліпшує стан
печінки при токсичному гепатиті. Показано його антиоксидантні властивості, здатність впливати на активність антиоксидантних ферментів у тканинах з різною функцією, нормалізувати фосфоліпідний склад мікросомальних мембран, змінювати склад жирних кислот мембранних фосфоліпідів. Запропоновано застосування препарату з “морських” фосфоліпідів для лікування та профілактики хвороб, які супроводжуються окислювальним стресом.
Одержано "Методику державних випробувань” та “Настанову” для застосування препарату у ветеринарії під назвою “Морефіл”.
Для розробки медичного засобу “Кальмофіл” складено документи доклінічних випробувань для представлення у фармакологічний комітет МОЗ України.
Особистий внесок здобувачки полягає у виконанні експериментальної частини роботи, підборі та обробці літературних даних. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на засіданнях відділу біохімії коферментів, наукових семінарах Інституту біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, V Міжнародній конференції “Биоантиоксидант”.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті та 1 тези доповіді.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, висновків і списку літератури з 292 найменувань. Робота викладена на 120 сторінках основного тексту, ілюстрована 5 рисунками і 17 таблицями.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
Фосфоліпідний комплекс із головоногих молюсків отримували за методом Даценко З.М. та ін. (Авт. Свід 1175486 СССР А 61К 37/22).
Експерименти проводилися на щурах-самцях лінії Вістар вагою 120-150 г, які перебували на стандартному раціоні годівлі та на Е-авітамінозній дієті. Об’єктом досліджень служила печінка та легені.
Експериментальний Е-гіповітаміноз у щурів моделювали, утримуючи їх з чотиритижневого віку на напівштучній дієті без вітаміну Е протягом 4 місяців за методом В.Б. Спиричева та ін. (1979). Для корекції Е-гіповітамінозного стану щурів одній групі вводили перорально по 2 мг вітаміну Е у вигляді олійного розчину на 100 г маси тіла тварини на добу протягом двох тижнів, іншій групі – протягом такого ж часу внутрішньоочеревинно вводили “Кальмофіл” по 50 мг на 100 г маси тіла на добу у вигляді емульсії у фізіологічному розчині, продовжуючи утримувати щурів на Е-авітамінозній дієті.
Інтоксикацію CCl 4 у щурів моделювали:
1) для досліду з хронічним ССl4-індукованим гепатитом - шляхом внутрішньом’язевого введення 50% олійного розчину ССl4 з розрахунку 0,4 мл/100 г маси тварини (ЛД50) протягом 4 діб. Коригуючий вплив “Кальмофілу” вивчали при його внутрішньоочеревинному введенні 10 мг/100 г маси тіла тварини починаючи з 4 до 12 доби;
2) для досліду з гострим ССl4-індукованим гепатитом - шляхом одноразового внутрішньоочеревинного введення 50% олійного розчину ССl4 з розрахунку 0,2 мл/100 г маси тварини (ЛД25), іншій групі одночасно з ССl4 вводили у такий же спосіб по 50 мг 50% олійного розчину “Кальмофілу” на 100 г маси тіла. Контрольній групі тварин вводили такий же об’єм олії.
Ліпідні екстракти отримували за методом L.Folch et al. (1957). Холестерин визначали за методом К.И.Розенцвейга (1962), вміст фосфоліпідів у ліпідних екстрактах за методом P.S.Chen (1956), вміст індивідуальних фосфоліпідів визначали за кількістю неорганічного фосфору за допомогою молібдатного реагенту за методом V.E. Vaskovsky (1975), вміст вуглеводів за методом R.J.Dimler (1952), вміст загального азоту за методом Д.Л.Фердмана (1957).
Хроматографічне розділення індивідуальних фосфоліпідів проводили за методом двовимірної тонкошарової хроматографії на платівках з силікагелем КСК-2 та платівках Sorbfil (СРСР). При розгонці у першому напрямку використовували систему хлороформ:метанол:бензол:28% аміак (65:30:10:6-8), а в другому - хлороформ:метанол:бензол:ацетон:льодова оцтова кислота (70:30:10:5:4:1) (V.I. Svetashev; V.E. Vaskovsky, 1972).
Ідентифікацію фосфоліпідів проводили за допомогою специфічних реакцій на їх функціональні групи (М. Кейтс, 1975; V.E. Vaskovsky, N.A. Latyshev, 1975; C.M. van Gert et al., 1973).
Вміст жирних кислот визначали хроматографічним методом за допомогою газо-рідинного хроматографа “Carlo Erba” (Italy) з попереднім метилюванням зразків (J.P. Carreau, J.P.Dubaco, 1978). Для кількісного аналізу метилових ефірів жирних кислот використовували набивні колонки розміром 3,5м х 3 мм. Як носій застосовували Chromatron NAW-DMSC із 7,5% нанесеною фазою Silar-5 СР (Serva, Германія). Відсотковий вміст жирних кислот в екстракті розраховували за площею піків.
Поверхневий натяг визначали за методом втягнутої сили пластинки за допомогою вертикальних терезів Вільгельма за методом А.А Биркун (1981).
Сурфактанти легень кролів та щурів одержували за методом R.H. Notter et al. (1983). Мікросоми тканин щурів виділяли за методом J.B. Shenkman et al. (1974). Вміст загального білку визначали за методом O.H. Lowry, et al. (1951). Супероксиддисмутазну фракцію отримували на основі методів J.M. Cord, I. Fridovich et al. (1969), B.B. Keele et al. (1971) у модифікації для мікросом.
Визначення активності супероксиддисмутази (СОД) мікросом проводили за методом Marklund S. еt al. (1974). Активність каталази визначали за методом М.А. Королюк та інш. (1988). Інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) вивчали по накопиченню малонового діальдегіду (МДА) за методами Ю.А. Владимирова та інш. (1972), І.Д. Стальной (1977), та по утворенню дієнових кон’югатів (ДК) за методом Ю.А. Владимирова та інш. (1972) та И.Р. Бияшевой та інш. (1991).
Результати дослідів оброблені статистично з використанням t-критерія Ст’юдента по И.А.Ойвину (1960). Вірогідними вважали результати при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.
1. Вивчення хімічного складу фосфоліпідного комплексу з гонад молюсків
Таблиця 1.1.
Хімічний склад фосфоліпідного комплексу, виділеного з гонад головоногих молюсків.
Примітка. У таблиці наведено узагальнені дані хімічного складу фосфоліпідних комплексів з гідробіонтів, що були отримані з різної сировини.
Результати досліджень хімічного складу фосфоліпідного комплексу, отриманого із гонад головоногих молюсків, свідчать, що до його складу входить до 80% фосфоліпідів, незначна кількість холестерину, вільних жирних кислот, вуглеводів, амінокислот, пептидів та слідові залишки вітаміну Е (табл.1.1).
Серед фосфоліпідів 70% становить фосфатидилхолін та у значно меншій кількості фосфатидилетаноламін, сфінгомієлін, фосфатидилінозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилдигліцерин.
При порівняльному дослідженні фосфоліпідного комплексу, отриманого з гідробіонтів, фосфоліпідів курячих яєць та різних тканин ссавців, виявлено, що “морські” фосфоліпіди крім основних жирних кислот, які характерні для всіх тварин, тобто пальмітинової (С 16:0), стеаринової (С 18:0), олеїнової (С 18:1), містять такі життєво необхідні кислоти, як ліноленова (С 18:3) та значну кількість біологічно активних жирних кислот- арахідонову (С 20:4), ейкозапентаєнову (С 20:5), докозагексаєнову (С 22:6), які у складі фосфоліпідів іншого походження містяться у слідових кількостях, або зовсім відсутні (табл.1.2).
Таблиця 1.2
Відсоткове співвідношення метилових ефірів жирних кислот у складі фосфоліпідів із різних джерел.
Приимітка. Дані складу ЖК з курячих яєць, тканин серця, печінки та мозку тварин взяті з літератури (Л.Д.Бергельсон; “Avanti” Polar Lipids,1995).
2. Сурфактантно-подібні властивості фосфоліпідного комплексу із гонад кальмарів
Виявлено подібність хімічного складу фосфоліпідного комплексу із гонад молюсків і сурфактантів легень ссавців, у якому фосфоліпіди також складають до 80% поряд з незначною кількістю холестерину, вільних жирних кислот, вуглеводів, пептидів. Серед фосфоліпідів у обох випадках переважає фосфатидилхолін (табл.2.1).
При вивченні біологічних властивостей “морських” фосфоліпідів виявлено, що комплекс, виділений з гонад головоногих молюсків, проявляє поверхневу активність, як і сурфактант легень тварин. Мінімальний поверхневий натяг препарату та сурфактанта щура становив 11,7±0,8 та 10,3±0,6 відповідно, а максимальний - 46,5±0,8 та 42,3±0,2.
Таблиця 2.1.
Хімічний склад фосфоліпідного комплексу із гонад головоногих молюсків і сурфактантів з легень ссавців (% від загальної кількості).
Примітка.У таблиці наведено узагальнені дані хімічного складу сурфактантів легень різних тварин.
При інгаляційному застосуванні препарату “Кальмофіл” на основі “морських” фосфоліпідів з молюсків при інтоксикації тварин аміаком, бензином, мепротаном виявлено позитивний вплив на загальний стан тварин та на їх виживання, а також, зокрема, на нормалізацію порушених функцій легень, - зниження інтенсивності процесу піноутворення, нормалізацію клітинної реакції сурфактанту легень, полегшення ходу токсичного процесу, як показано у табл.2.2., що свідчить про сурфактантноподібні властивості препарату.
Таблиця 2.2.
Стан поверхнево-активних властивостей легень досліджуваних тварин.
3. Антиоксидантні властивості “морських” фосфоліпідів
При дослідженні антиоксидантних властивостей препарату “Кальмофіл” у порівнянні із загальновідомим антиоксидантом вітаміном Е у дослідах in vitro виявлена дозозалежна здатність препарату гальмувати ПОЛ (табл.3.1).
Таблиця 3.1
Накопичення МДА у гомогенаті печінки щурів в процесі спонтанного ПОЛ при додаванні окремо вітаміну Е та препарату “Кальмофіл” в дослідах in vitro (n=7, M±m).
Примітка. * - відмінності, вірогідні у порівнянні з контролем (р<0,05).
Антиоксидантній дії 100 мкг вітаміну Е, тобто пригніченню ПОЛ на 50%, відповідає кількість препарату, що дорівнює 500 мкг.
При підвищенні показників окислювального стресу, МДА та ДК, у мембранах мікросом печінки та легень щурів з патологією, обумовленою недостачею природного антиоксиданта вітаміна Е (експериментального Е–гіповітамінозу), виявлено здатність “Кальмофілу” нормалізувати ці показники (табл.3.2). Причому виявлено, що в мембранах мікросом печінки за Е-гіповітамінозу інтенсивність процесів ПОЛ збільшується значно більше, ніж у мембранах мікросом тканини легень, та встановлено більш виражений вплив фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів на зниження окислювального стресу, обумовленого недостачею природного антиоксиданту, вітаміну Е, у мембранах мікросом печінки щурів.
Таблиця 3.2
Накопичення продуктів ПОЛ у мікросомальних фракціях легень та печінки щурів при експериментальному Е-гіповітамінозі та при введенні вітаміну Е і препарату “Кальмофіл” у дослідах in vivo (n=7, M±m).
Примітки.*- відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **- для нормальної групи і групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05); ***- для групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05).
“Кальмофіл” здатен також впливати на активність ферментів системи антиоксидантного захисту (СОД та каталази) мембран мікросом тканин легень та печінки щурів за умов Е-гіповітамінозу, як видно з табл.3.3.
Ці дані демонструють здатність “морських” фосфоліпідів коригувати гомеостаз різних тканин (легень та печінки) на рівні клітинних мембран шляхом стимуляції системи їх антиоксидантного захисту, а саме активностей антиоксидантних ферментів СОД та каталази.
Таблиця 3.3.
Активність ферментів антиоксидантної системи захисту в мікросомальних фракціях тканин легень та печінки щурів при експериментальному Е-гіповітамінозі та при введенні in vivo вітаміну Е і препарату “Кальмофіл” (n=7, M±m).
* - відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **- для групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05).
4. Вплив фосфоліпідного комплексу з морських організмів на корекцію складу фосфоліпідів мембран мікросом в умовах патологічного стану
Рис.4.1. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом легень щурів (n=5, M ±m); зліва направо: 1- контроль; 2- Е-гіповітаміноз; 3- Е-гіповітаміноз+вітамін Е; 4- Е-гіповітаміноз+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).
Виявлено мембраностабілізуючий вплив “Кальмофілу” у дослідах in vivo по корекції фосфоліпідного спектру мембран мікросом печінки та легень щурів, порушеного як за умов Е-гіповітамінозу, так і інтоксикації ССl4. Як показано на рис4.1, рис.4.2 та рис.4.3, введення “морських” фосфоліпідів майже у 2 рази знижувало вміст лізоформ фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну мембран мікросом обох тканин, який значно зростав за умов Е-гіповітамінозу та ССl4 - інтоксикації і є, як відомо, одним з показників патології.
Рис. 4.2. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом печінки щурів (n=5, M±m); зліва направо: 1–контроль; 2- Е-гіповітаміноз; 3- Е-гіповітаміноз+вітамін Е; 4- Е-гіповітаміноз+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).
Рис. 4.3. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом печінки щурів при інтоксикації CCl4 (n=5, M±m); зліва направо: 1– контроль; 2- CCl4; 3-+CCl4 вітамін Е; 4- CCl4+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).
Після терапії Е-гіповітамінозу щурів “Кальмофілом” виявлено тенденцію до зростання, а при терапії інтоксикованих тварин CCl4,- вірогідне зростання кількості фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну у мембранах мікросом тканин легень та печінки, кількість яких зменшувалась за патології. Встановлено також нормалізацію відсоткового вмісту інших фосфоліпідів: сфінгомієліну, фосфатидилсерину, дифосфатидилгліцерину та фосфатидилгліцерину, який порушувався у мембранах мікросом при нестачі вітаміну Е чи інтоксикації ССl4.
Нормалізуючий вплив “Кальмофілу” на жирнокислотний склад фосфоліпідів мембран мікросом печінки продемонстровано при інтоксикації тварин ССl4 (табл.4.3).
Таблиця 4.3.
Вміст жирних кислот у мембранах мікросом печінки після дії ССl4 та на його фоні препарату “Кальмофіл” (n=5, M±m).
*-відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **-для групи з ССl4 (р<0,05); ***-для нормальної групи і групи з ССl4 (р<0,05).
Введення щурам ССl4 призводить до підвищення вмісту у фосфоліпідах мікросом печінки стеаринової і арахідонової кислоти та зниження олеїнової та лінолевої кислоти, а введення “Кальмофілу” наближає ці показники до норми.
| 
