|
Національна Академія Наук України
Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
Скляр Тетяна Володимирівна
УДК 579.222.6
Особливості енергетичного обміну штамів
Neisseria gonorrhoeae з різною стійкістю
до антибіотиків
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету.
Захист відбудеться “21 ” вересня 2005 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 Київ ГСП, вул. Академіка Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології
і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 Київ ГСП, вул. Академіка Заболотного, 154.
Автореферат дисертації розіслано 11 серпня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема стійкості до антибіотиків є актуальною як для мікробіології, так і для медицини в цілому. Незважаючи на велику кількість досліджень у даній галузі, проблема далека від розв’язання. Відкриття і застосування нових антибіотиків проблему не вирішує. Шляхи її вирішення пов’язані з детальним вивченням біології патогенних мікроорганізмів, пошуком факторів, що знижують резистентність. Все це відкриває нові можливості та підходи у раціональній антибіотикотерапії інфекційних захворювань. Особливе значення це має по відношенню до штамів гонококів, які спричиняють різні інфекційні захворювання, котрі впливають на статеву систему людини (Коляденко, 1993).
Поява все більшої кількості резистентних штамів гонокока, на думку ряду авторів, пов’язана з пластичністю метаболічних реакцій, котрі лежать в основі біохімічних механізмів стійкості (Knapp, 1999; Кубанова, 2004). Дані літератури стосовно генерації протонрушійної сили, величини її компонентів (мембранного потенціалу і концентраційного градієнту протонів, генераторів трансмембранного електрохімічного потенціалу іонів водню, динаміці синтезу АТФ при наведенні мембранного потенціалу і градієнту протонів) у штамів Neisseria gonorrhoeae з різною стійкістю до антибіотиків, відсутні. Що стосується функціонування Н+-АТФазного комплексу, то є лише поодинокі роботи, присвячені ультрацитохімічному вивченню АТФази у клітинах штамів гонокока (Дмитриев, 1987).
Все це свідчить про те, що стійкість до антибіотиків є складним біологічним явищем, пов’язаним з еволюцією патогенних бактерій та метаболізмом мікробної клітини. Тому необхідне всебічне вивчення фізіолого-біохімічних властивостей, реакцій енергетичного обміну у чутливих та стійких до антибіотиків штамів гонокока з метою пошуку високоефективних препаратів, які підвищують ефективність боротьби з ними.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлені дослідження є частиною роботи, яка виконується на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету в рамках програми науково-дослідної держбюджетної теми № 4-031-03 “Фізіолого-біохімічні процеси, які лежать в основі синтезу біологічно активних речовин, патогенності і взаємовідносин у мікроорганізмів”, і яка координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти і науки України.
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було порівняльне вивчення основних біологічних властивостей і енергетичних процесів у гонококів з різною стійкістю до антибіотиків.
Відповідно до поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
- визначити основні параметри росту штамів гонококів, стійких і чутливих до антибіотиків;
- вивчити фактори патогенності та їх взаємозв’язок з наявністю ознак стійкості до антибіотиків;
- визначити основні джерела конвертованої енергії в клітинах досліджуваних штамів гонокока;
- вивчити компоненти і величину протонрушійної сили, а також вплив енергетичних інгібіторів на її генерацію;
- визначити АТФазну активність у штамів Neisseria gonorrhoeae, стійких до антибіотиків, і вплив факторів навколишнього середовища на активність цього ферменту;
- дослідити динаміку синтезу АТФ при наведенні мембранного потенціалу і градієнту протонів у клітинах гонокока.
Об’єкт дослідження – штами Neisseria gonorrhoeae, з різним спектром і рівнем стійкості до антибіотиків із музею культур кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського національного університету.
Предмет дослідження – процеси трансформації енергії, які відбуваються на мембрані клітин гонокока.
Методи дослідження – мікробіологічні, вірусологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хімічні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що в клітинах гонококів присутні два основних джерела конвертованої енергії: трансмембранна різниця електрохімічних потенціалів і внутрішньоклітинний пул АТФ. Показано, що шляхом утворення іонних градієнтів, можливо наведення мембранного потенціалу і градієнту протонів, в результаті чого іде синтез АТФ.
Вперше визначена величина протонрушійної сили (183-192 мВ) клітин N. gonorrhoeae та її компонентів: трансмембранної різниці електричного потенціалу (103-145 мВ) і концентраційного градієнту протонів (80-47 мВ).
Показана наявність основних генераторів мембранного потенціалу гонококів: дихальний ланцюг, Н+-АТФаза і трансгідрогеназа.
Встановлено основні параметри функціонування Н+-АТФазного комплексу у штамів N. gonorrhoeae з різним рівнем стійкості до антибіотиків: оптимальне значення рН для мембранної АТФази гонококів знаходиться в межах 6,0-6,5; температурний оптимум 37о-45оС.
Показано, що Na+, Ca2+ спричиняють незначний вплив на АТФазну активність, у той час як Mg2+ збільшують АТФазну активність в 1,5-2,0 рази.
Вперше встановлено, що у антибіотикорезистентних штамів N. gonorrhoeae, АТФазна активність у 2,0-2,5 рази вища, ніж у чутливих, що свідчить про інтенсивніший енергетичний обмін.
Практична значимість роботи. Отримані в процесі виконання роботи експериментальні результати є науковою основою для розробки методів раціонального використання антибіотиків і інших лікарських препаратів у терапії інфекційних захворювань, що спричиняються штамами N. gonorrhoeae, стійкими до антибіотиків.
Використання лікарських препаратів, які пригнічують систему енергозабезпечення, зможе підвищити ефективність антибіотикотерапії за інфекцій, етіологічним фактором яких є гонокок.
Матеріали дисертаційної роботи використані у програмах таких дисциплін кафедри мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету: “Мікробіологія”, “Вірусологія”, “Медична мікробіологія”, “Вчення про антибіотики”, “Фізико-хімічні методи в мікробіології” і “Сучасні методи дослідження інфекційних захворювань”.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Експериментальна робота виконана особисто здобувачем. Автор проаналізувала наукову літературу з даної проблеми, узагальнила одержані експериментальні дані, провела порівняльний аналіз з відомими літературними даними. Автором самостійно визначена величина протонрушійної сили та її компонентів (мембранного потенціалу і концентраційного градієнту протонів) клітин гонокока, АТФазна активність чутливих і стійких штамів N. gonorrhoeae; також встановлено внутрішньоклітинний вміст АТФ у цих штамів. Планування основних напрямків роботи, обговорення одержаних результатів і підготовка публікацій за результатами досліджень проходило за безпосередньої участі наукового керівника д.б.н., проф. А.І. Віннікова. Вивчення культурально-фізіологічних властивостей гонококів здійснювалось спільно з к.б.н. В.Г. Гаврилюк, ас. О.В. Крисенко, котрі є співавторами відповідних публікацій.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), V Міжнародній конференції “Альянс Франсез” (Дніпропетровськ, 1998), ІІ Міжнародній конференції “Наука і освіта” – 1999 (Черкаси, 1999); ІІ з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); V Міжнародній конференції “Наука і освіта” – 2002 (Дніпропетровськ-2002), ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); VIII з’їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002); VІ Міжнародній конференції “Наука і освіта” – 2003 (Дніпропетровськ-2003), Х з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 22 наукових праці, із них – 8 статей у фахових виданнях та 14 тез конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури (3 розділи), експериментальної частини (4 розділи), обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, який включає 169 найменувань (з яких – 133 іноземні). Робота викладена на 131 стор. машинописного тексту, ілюстрована 18 рисунками і 17 таблицями.
Огляд літератури
Розділ 1. Особливості культурально-фізіологічних властивостей і обмінних процесів бактерій роду Neisseria
У даному розділі наведені основні таксономічні ознаки гонококів, особливості їх фізіологічних властивостей, а також основні катаболічні шляхи гонококів.
Розділ 2. Процеси трансформації енергії у бактерій роду Neisseria
Наведені основні положення хеміосмотичної концепції Мітчела. Розглянуті основні джерела конвертованої енергії у бактерій: АТФазний комплекс, дихальний ланцюг, протонрушійна сила.
Розділ 3. Механізми стійкості гонокока до клінічно значимих антибіотиків
У цьому розділі наведені дані стосовно біохімічних і генетичних механізмах стійкості гонокока до найефективніших у клінічному значенні антибіотиків, таких як пеніцилін, аміноглікозиди, цефалоспорини ІІІ покоління, фторхінолони.
Експериментальна частина
Розділ 4. Матеріали та методи досліджень
Характеристика штамів гонокока та умови їх культивування
Об’єктом дослідження були штами N. gonorrhoeae із колекції культур кафедри мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету (табл. 1).
Вирощування здійснювали на поживному середовищі, запропонованому Бідновою і Яцухою (1993 р.). Культивування гонокока проводили при 37оС в 10% атмосфері СО2 протягом 16-18 годин.
Таблица 1
Характеристика досліджуваних штамів Neisseria gonorrhoeae
Примітки: 1. * - знижена чутливість; 2. Tс – тетрациклін; 3. Cm – хлорамфенікол; 4. Pn – пеніцилін; 5. Sp – спектиноміцин; 6. Str – стрептоміцин; 7. Cfr – цефуроксим; 8. Cfk – цефокситин.
Визначення фізіолого-біохімічних властивостей
Вирощування гонококів здійснювали в рідкому поживному середовищі при струшуванні на шутелі при температурі 37оС протягом 24-48 год. Оптичну густину проб вимірювали спектрофотометричним засобом при довжині хвилі 540 нм. Кількість життєздатних клітин (колонієутворюючих одиниць – КУО) визначали методом Коха. Для оптимізації склада поживного середовища використовували поживні середовища з різним вмістом сироватки ВРХ – від 0 до 20%, а також середовища з різною концентрацією гумату натрію – від 0,005 до 0,02%.
Параметри росту (швидкість поділу клітин і тривалість генерації) обчислювали загальноприйнятим методом (Шлегель, 1988). Здатність окислювати і зброджувати вуглеводи визначали за методикою, запропонованою Коліковою (1978). Протеазну активність визначали за методикою, яка була описана Ізмайловою (1968). Гемолітичну і гіалуронідазну активність реєстрували згідно загальновизнаним методикам (Герхард, 1984). При вивченні лізоцимної активності у даних штамів був використаний метод “п’ятачків” (Воронина, 1988).
Одержання безклітинного гомогенату і фракцій мембранних везикул гонокока
Вивчення обмінних процесів у гонокока проводились на цілих клітинах, безклітинному гомогенаті і фракції мембранних везикул. Клітини гонококів вирощувалися на МПБ до кінця експоненціальної фази росту при 37оС в атмосфері 10% СО2 у стаціонарних умовах. Далі клітини відділяли центрифугуванням при 5000 об/хв упродовж 20 хв., двічі промивали і ресуспендували залежно від мети експерименту: або в 40 мМ трис-HCl буфера (рН 7,0 або 8,0) з додаванням 3 мМ MgCl2, або в 40 мМ розчині морфолінетанолсульфонової кислоти (рН 5,0 або 6,0) з додаванням 3 мМ MgCl2.
Безклітинний гомогенат одержували в результаті ультразвукової обробки клітин при 22 кГц протягом 3 хв. з інтервалом 30 секунд на ультразвуковому дезінтеграторі УЗДН-А, незруйновані клітини, видаляли центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин. Фракцію мембранних везикул одержували диференційним центрифугуванням при 22000 g (30 хв.) для осадження цілих клітин і великих клітинних фрагментів та при 144000 g (60 хв.) на холоді (при температурі – 4оС).
Методи визначення активності АТФази гонокока
АТФазну активність мембран гонокока визначали за приростом неорганічного фосфору (Рн) при гідролізі АТФ. Неорганічний фосфор визначали в надосадочній рідині за методом Лоурі-Лопеса в модифікації Скулачова.
Активність АТФази виражали в нмолях АТФ, гідролізованого 1 мг білка за 1 хв. Розрахунок активності АТФази проводили за формулою:
де: Pн – приріст неорганічного фосфору; ρ – мг білка в пробі;
k = 0,031 – середнє значення екстинції при 1 мкг Рн у пробі.
Концентрацію білку оцінювали за методом Lowry (1951).
Вимірювання протонрушійної сили та її компонентів
Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів на мембранних везикулах гонококів вивчали методом Liberman, Skulachev з використанням синтетичних проникаючих іонів: тетрафенілфосфонію (ТРР+) та фенілкарбаундекаборану (ФКБ–). У дослідах з мембранними везикулами використовували тефлонову кювету, яка була поділена на дві ячейки фосфоліпідною мембраною, яка використовувалась як селективний електрод. Вимірювальна схема складалася з хлорсрібних електродів порівняння, іономера ЭВ-74 і самописця КСП-4 з вбудованою схемою компенсації.
При визначенні величини компонентів протонрушійної сили: (ΔР) мембранного потенціалу (Δψ) і концентраційного градієнту протонів (ΔрН) на цілих клітинах гонококів, як зонди використовували іони ТРР+ і саліцилової кислоти (SAL–) і електроди, селективні за цими іонами, конструкції Грінюса. Вимірювання проводили в термостатованій кюветі об’ємом 5 мл при 37оС при перемішуванні на магнітній мішалці.
Розрахунок величин Δψ і ΔрН здійснювали по рівнянням, запропонованим Грінюсом, на основі даних по розподіленню ТРР+ і SAL– відповідно.
В експериментах по індукуванню іонних градієнтів клітини гонококів навантажували KCl, при інкубації їх у розчині 0,3 М KCl на 40 мМ трис-HCl (рН 7,0) протягом 30 хв, потім відмивали від KCl при центрифугуванні на холоді (2-4оС). Градієнтний потік К+ на цитоплазматичній мембрані клітин утворювали додаванням валіноміцину в концентрації 1 мкМ, градієнт рН – додаванням у середовище HCl або трис-основи.
Для визначення кількості АТФ, яка синтезується при утворенні мембранного потенціалу або градієнту рН, проводили екстракцію клітин 30%-ною трихлороцтовою кислотою за методом Коля. Кількість АТФ в екстрактах визначали за методом Хемплінга, при використанні додаткової ферментативної системи, яка містить гексокіназу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу. Кількість АТФ розраховували за кількістю вимірюваного при 340 нм відновленого НАДФН.
Використовували такі інгібітори: інгібітор дихального ланцюга ціаністий калій (KCN) – 10-3 М; інгібітор Н+-АТФаза N1N1-дициклокарбодиімід (ДЦКД) – 10-6-10-3 М; протонофорний роз’єднувач m–хлоркарбонілціанідфенілгідразон (ХКФ) – 10-5М.
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Лакіним (1990). Достовірність результатів досліджень оцінювали згідно з t-критерієм Стъюдента при 5% рівні значимості.
Розділ 5. Особливості фізіолого-біохімічних властивостей штамів гонококів, чутливих та стійких до антибіотиків
Аналізували такі фактори патогенності гонококів: протеазна, лізоцимна та гіалуронідазна активність.
Протеазна активність виявлена у всіх досліджуваних штамів. Лізоцимна активність була присутня у всіх штамів Neisseria gonorrhoeae, за винятком штаму “В”. Штами “А” і “Е” - низьколізоцимактивні, діаметр зон затримки росту 6,5±0,5 мм і 7±1 мм відповідно. Штами “Д” і “Е” - високолізоцимактивні, діаметр зон затримки росту – 12±2 мм і 10±1 мм відповідно. Також у ході досліджень було відмічено, що максимальна продукція літичного ферменту відбувається у перші 24-48 год. інкубації. У цей же час відбувається автоліз гонококів.
Гіалуронідазна активність була виявлена у штамів “Д”, “Е”, “С”, відсутня була у штамів “А” і “В” N. gonorrhoeae. Нами був визначений мінімальний об’єм взвесі штамів гонокока, який забезпечує руйнування згустку гіалуронової кислоти. Для штаму “Д” – 0,2 мл; для штаму “Е” - 0,3 мл; для штаму “С” - 0,4 мл. Отримані результати узгоджуються з результатами експериментів, які були отримані на клінічних штамах гонокока (Вороніна, 1982, 1998; Жукова, 1988, 1994).
Наведені дані свідчать про те, що набуття стійкості до антибіотиків впливає на деякі фізіолого-біохімічні властивості досліджуваних гонококів, які належать до факторів патогенності.
Досліджені закономірності росту 5 колекційних штамів гонококів на поживних середовищах різноманітного складу, за різних рН середовища і температурному режимі з метою підбору оптимальних умов для одержання популяцій фізіологічно активних клітин.
Вивчалась можливість культивування досліджуваних штамів гонококів у рідкому поживному середовищі, яке не містить сироватки ВРХ. Встановлено, що на рідкому поживному середовищі, що не містить сироватки ВРХ, не спостерігали росту жодного із штамів. З метою оптимізації поживного середовища за вмістом сироватки ВРХ і встановленню її оптимальної концентрації, дослідили ріст всіх штамів у середовищах, що містили від 5 до 20% сироватки ВРХ (табл. 2).
При порівнянні динаміки росту всіх штамів гонококів був виявлений однотиповий її характер, у зв'язку чим у табл. 2 наведено дані для штаму “В” чутливого до антибіотиків та для штаму “А” - стійкого. При зміні вмісту сироватки ВРХ із 5% - до 20% в поживному середовищі, константа швидкості поділу коливалася в межах 0,58-0,96 клітинних поділів за годину, а тривалість генерації становила з 1,75 до 1,03 год. З збільшенням концентрації сироватки ВРХ від 0 до 20% змінюються параметри росту гонокока, скорочується лаг-фаза, збільшується константа швидкості поділу, скорочується тривалість генерації. Все це можна розглядати, можливо, як рістстимулюючу дію даної добавки на обмінні процеси бактерій.
Таблиця 2
Фізіологічні параметри росту Neisseria gonorrhoeae (штамів “А” і “В”) на рідких поживних середовищах з різним вмістом сироватки ВРХ і гумату натрію
Примітки: 1 – середовище без сироватки; 2-4 – середовища з різним вмістом сироватки ВРХ (2 – 5%, 3 – 10%, 4 – 20%); 5-8 – середовища з 20%-м вмістом сироватки, збагачені гуматом натрію в концентрації відповідно 0,02, 0,015, 0,005 і 0,01%
У своїх дослідженнях ми також аналізували вплив гумату натрію на параметри росту N. gonorrhoeae з метою оптимізації поживного середовища (табл. 2) Показано, що при збільшенні концентрації гумату натрію до 0,01% лаг-фаза скорочується до 1,1 год., константа швидкості поділу збільшується до 1,08 клітинних поділів за год., тривалість генерації скорочується з 1,08 до 0,93 год. Однак за концентрації гумату натрію 0,02% у середовищі спостерігали зворотну картину. Можна припустити, що гумат натрію в низьких концентраціях стимулює ріст і розмноження гонокока, а у вищих – його затримує.
Встановлено, що 20% сироватки ВРХ і 0,01% гумату натрію в середовищі для культивування гонокока є оптимальним для росту і розмноження даного мікроорганізму.
На наступному етапі дослідили ріст штамів у процесі періодичного культивування при температурі від 23оС до 42оС. Одержані результати вказують на залежність росту гонококів від температури. Константа швидкості поділу збільшується до 0,92 у фазі експоненціального росту з підвищенням температури до 36,5оС, тривалість генерації скорочується до 1,09 год., що можна розглядати як оптимальну температуру культивування даного мікроорганізму.
Наступна серія експериментів була присвячена вивченню впливу рН середовища на ріст і розмноження даних штамів.
Ріст гонококів спостерігався при рН=6,5-7,7. Із підвищенням рН спостерігається збільшення числа КУО. Найбільше значення КУО (5⋅1010) відмічено за рН 6,8-6,9, а найменше – за рН 7,7-102, що можна розглядати як оптимальне значення рН для росту і розмноження гонокока.
Отже не виявлено істотної різниці між ростовими характеристиками штамів N. gonorrhoeae, чутливих і стійких до антибіотиків.
Розділ 6. Генерація протонрушійної сили у гонококів
У даному розділі наведено експериментальні дані з вивчення основних джерел конвертованої енергії у гонококів.
Залежність величини протонрушійної сили та її складових (мембранного потенціалу і концентраційного градієнту протонів) від рН середовища інкубації, для досліджуваних штамів мала однотиповий характер, тому на рисунках представлені дані для штаму “В” чутливого до антибіотиків, та для штаму “А” – стійкого.
При зміні рН середовища інкубації ми спостерігали зміну величини мембранного потенціалу (Δψ) і рН-градієнту (ΔрН) (рис. 1).
 
а б
Рис. 1. Вплив рН на величину протонрушійної сили і її складових у клітин N. gonorrhoeae а - штаму “В”, б – штаму “А”, t=37оС (середовище інкубації: 40 мМ MES-буфер (рН 5,0-6,0) або 40 мМ трис-HCl буфер (рН 7,0-8,0),
1 мкМ ТФФ+, 80 мкМ саліцилової кислоти і клітин (5,0 мг/мл))
При зміні рН середовища від 5 до 8 ΔрН знижувався з –80 мв до – 47 мв, а Δψ зростав з – 103 мВ до – 145 мВ. Протонрушійна сила (Δр) зі зміною рН практично не змінювалася і становила 192-183 мВ. Таким чином, у слабокислому середовиші переважає концентраційний градієнт іонів водорода, а в слаболужному – мембранний потенціал, а величина протонрушійної сили за різних значеннях рН практично не змінюється. Отже, можна зробити висновок, що обидві складові протонрушійної сили (трансмембранна різниця електричних потенціалів і концентраційний градієнт іонів водню) – еквівалентні, що відповідає основним постулатам теорії Мітчела.
Генерацію трансмембранної різниці електричних потенціалів на мембранних везикулах вивчали за допомогою аніонів фенілдикарбаундекарборону (ФКБ)–.
Встановлено, що додавання сукцинату, АТФ індукує поглинання ФКБ– вивернутими везикулами. Характер поглинання ФКБ– вказує на наявність двох генераторів мембранного потенціалу (дихального ланцюга і Н+-АТФази). Аналізували дію на мембранний потенціал гонокока інгібіторів енергетичного обміну клітини: KCN, ДЦКД і ХКФ. Показано, що при додаванні KCN в інкубаційну суміш мембранний потенціал знижується до 62 мВ. При додаванні ДЦКД в інкубаційну суміш Δψ зменшується до 65 мВ. Розсіюється мембранний потенціал лише за одночасного пригнічування дихального ланцюга і Н+-АТФази.
У ході наших досліджень було показано, що у гонокока присутня і трансгідрогеназа, яка каталізує енергозалежну реакцію, в результаті якої відновлюється НАДФ+ за рахунок окислення НАДН (рис. 2). Наведені експерименти свідчать про те, що окислення надлишка НАДФН через НАД+, котре каталізується трангідрогеназою, приводить до утворення мембранного потенціалу такої ж орієнтації, як і за окислення дихальних субстратів і гідролізу АТФ. Отже, трансгідрогеназа являє собою додаткову ділянку накопичення енергії в дихальному ланцюзі гонокока.
Енергія, яка вивільняється за окисленні НАДФН у ході трансгідрогеназної реакції, витрачається на поглинання ФКБ–. Енергозалежне поглинання ФКБ– є індикатором генерації мембранного потенціалу. Таким чином, акумуляція ФКБ– у мембранах N. gonorrhoeae є доказом того, що трансгідрогеназна реакція спряжена з генерацією мембранного потенціалу, зі знаком “+” у внутрішньовезикулярному просторі.
Встановлено, що величина мембранного потенціалу клітин гонокока, яка генерується трансгідрогеназною реакцією, знаходиться в межах 62-86 мВ. Вона набагато нижча величини Δψ в інтактних клітинах N. gonorrhoeae (103-145 мВ).
Оскільки нами було показано, що додавання АТФ у ході функціонування Н+-АТФазного комплексу приводить до генерації трансмембранної різниці електричних потенціалів, у подальших експериментах вивчали синтез АТФ при створенні іонних градієнтів. Дослідження проводили з використанням штаму “В”.
З метою оцінки можливості синтезу АТФ при наведенні трансмембранної різниці потенціалів, клітини, навантажені іонами К+, інкубували в безкалієвому середовищі, що містило 40 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4; 0,6 мг білку на 1 мл, без субстратів; 10 мМ KCN, щоб виключити окисні процеси в клітині. Початковий вміст АТФ у клітинах штаму “В” – (0,053±0,011) мМ (табл. 3).
Внесення валіноміцину після 3 хв. інкубації при 37оС приводить до синтезу АТФ. Збільшення концентрації валіноміцину до 30 мкм спричиняє приріст концентрації внутрішньоклітинного АТФ на 0,225 мМ (табл. 3).
Таблиця 3
Залежність синтезу АТФ від концентрації валіноміцину
при наведенні градієнту К+ у клітинах штаму “В”
В експериментах по наведенню градієнту рН на мембрану інкубаційне середовище містило 40 мМ трис-HCl, рН 7,4; 10 мМ KCN, 0,5 мг білка на 1 мл середовища. Наведення градієнту рН приводило до синтезу АТФ (0,10 мМ) за 30 с. Внесення в середовище трис-основи збільшувало рН від 5,0 до 7,4, що приводило до дисипації градієнту рН. Концентрація АТФ при цьому знижувалася до початкового рівня (табл. 4).
Таблиця 4
Вплив градієнту рН на внутрішньоклітинну концентрацію АТФ
штаму “В” N. gonorrhoeae
| 
