|
Національна Академія Наук України
Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця
КІРІЧОК ЮРІЙ ВІКТОРОВИЧ
УДК 611.813.14:612.822.3.615.015.44
НОВІ ФАРМАКОЛОГІЧНІ ВПЛИВИ НА КАЛІЄВІ КАНАЛИ У ПІРАМІДНИХ НЕЙРОНАХ ГІПОКАМПУ: СЕЛЕКТИВНА БЛОКАДА КАНАЛІВ ЗАТРИМАННОГО ВИПРЯМЛЕННЯ
03.00.02 - біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2000
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі фізико-хімічної біології клітинних мембран
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук Кришталь Олег Олександрович
зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук Малишева Маргарита Костянтинівна, зав. відділом нейрохімії Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.
Кандидат біологічних наук Пархоменко Микола Тимофійович, провідний науковий співробітник відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. Паладіна НАН України.
Провідна установа: кафедра біофізики Національного Університету ім. Тараса Шевченка, м. Київ
Захист відбудеться “17” жовтня 2000 р. о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.
Автореферат розісланий 15 вересня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук Сорокіна- Маріна З. О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.
Актуальність теми. Калієві канали виконують важливі функції для забезпечення нормальної роботи нервової системи. Вони відповідають за реполяризацію мембрани, визначають часове розподілення потенціалів дії, що генеруються нервовою клітиною, а також визначають їх форму. Калієві канали керують значенням потенціалу спокою, збудливістю клітини та контролюють її об’єм. Вони регулюють викид медіаторів та гормонів (Hille B, 1994).
Водночас, під час деяких патологічних процесів (інсульт, депресія, що поширюється та хвороба Альцгеймера), калієві канали задіяні в нейродегенеративних механізмах, що призводять до припинення функціонування нервової системи та загибелі клітини (Obrenovitch et al., 1995; Yu et al., 1997; Gido et al., 1997; Kristian et al., 1997; Yu et al., 1998). Наприклад, підвищення позаклітинної концентрації іонів калію, що має місце у перші хвилини гіпоксії, в основному обумовлено роботою потенціал-керованих калієвих каналів (Zetterstrom et al., 1995). Під час ішемічного інсульту позаклітинна концентрація калію може зростати до 80 мМ (Sykova, 1983; Kristian et al., 1997). Таке підвищення позаклітинного калію може суттєво спустошити енергетичні запаси нервової тканини, можливо, шляхом стимулювання метаболізму в клітинах нейроглії (Katsura et al., 1992). Надлишковий калій також може дифундувати в позаклітинному просторі до прилягаючих ділянок нервової тканини, порушеним фокальною ішемією у меншому ступені (пенумбра), викликаючи їх деполяризацію і розширення області мозку, враженого ішемією (Obrenovitch et al., 1995). В результаті ішемічного пошкодження мозку нервові клітини підлягають як некрозу, так і апоптозу. (Lee et al., 1999). Деякі види нейронального апоптозу на початковій стадії супроводжуються зростанням амплітуди калієвого струму затриманого випрямлення (IDR) та зв’язаною з цим втратою внутрішньоклітинного калію. Блокування каналів затримуваного випрямлення веде до пригнічення апоптоза. (Yu et al., 1997; Yu et al., 1998). Є свідчення того, що збільшення вихідного калієвого струму затриманого типу може також брати участь в апоптозі нейронів, що викликається b-амілоідним білком. (Yu et al., 1998).
При патології ЦНС канали затриманого випрямлення, що повільно інактивуються, ймовірно, є основним шляхом виходу іонів калію з деполяризованих нейронів. Таким чином, селективне блокування калієвих каналів затриманого випрямлення може запобігти пошкодженню нервової тканини при деяких патологічних станах. На сьогоднішній день відомо дуже мало як природних (Eccles et al., 1994; Guatteo et al., 1996), так і синтезованих органічних сполук (Krause et al., 1998; Mathie et al., 1998; Nobile et al., 1998), що є селективними по відношенню до калієвих каналів затриманого випрямлення. Тому пошук таких сполук є актуальною задачею сучасної фармакології і нейрофізіології.
Дослідження проводилися згідно з планами наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця та Міжнародного Центру молекулярної фізіології за темою “Молекулярні механізми інтегративної функції нервових клітин в нормі та при патології мозку”.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення особливостей механізму дії сполуки BIIA388Cl ([R,S]-[3,4-дигідро-6,7-диметоксиізохінолін-1-іл]-2-циклогексил-N-[3,3-дифенілпропіл]-ацетамід) гідрохлориду, що виявляє нейропротекторні властивості, на потенціал- керовані калієві струми в мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура і його вплив на синаптичну передачу. Ми також планували вивчити вплив блокаторів потенціал- керованих кальцієвих каналів L-типу німодипіну і ніфедипіну та Т-типу мібефрадилу на потенціал- керований калієвий струм затриманого випрямлення (IDR) у мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:
1. Використовуючи метод пэтч-кламп у конфігурації “ціла клітина” визначити залежність доза-ефект для впливу BIIA388Cl на IDR у мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура. Визначити потенціал-залежність блокування. Визначити вплив BIIA388Cl на інактиваційні властивості IDR. Встановити наявність або відсутність взаємодії молекули BIIA388Cl, що блокує канал, із позаклітинними іонами К+ і з вхідними та вихідними потоками іонів К+. Перевірити чи блокує BIIA388Cl канал із внутрішньої сторони мембрани.
2. З'ясувати, як впливає BIIA388Cl на калієвий струм, що швидко активується та інактивується (IА ), в мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура.
3. Визначити вплив BIIA388Cl на натрієві і кальцієві струми в мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура. Зробити висновок про селективність BIIA388Cl як блокатора IDR.
4. З'ясувати як впливає BIIA388Cl на популяційні спайки, що виникають у зоні СА1 пірамідних нейронів гіпокампа у відповідь на стимуляцію коллатералей Шаффера.
5. Використовуючи метод пэтч-кламп у конфігурації “ціла клітина” визначити залежність доза-ефект для дії німодипіна і ніфедипіна на IDR у мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура. З'ясувати вплив мібефрадила на IDR. Довести, що дія блокаторів кальцієвих каналів на калієві канали є прямою і не опосередкована пригніченням входу кальцію через потенціал-керовані кальцієві канали.
Наукова новизна одержаних результатів. В роботі доведено, що сполука BIIA388Cl є селективним блокатором калієвого струму затримуваного випрямлення IDR у пірамідних нейронах гіпокампа щура та не викликає епілептичної активності у зрізах гіпокампу in vitro. Запропоновано обгрунтований механізм взаємодії молекули BIIA388Cl з калієвим каналом затриманого випрямлення. Крім того в роботі показано, що блокатори потенціал- керованих кальцієвих каналів L-типу німодипін, ніфедипін та блокатор потенціал- керованих кальцієвих каналів Т- типу мібефрадил блокують калієві канали затриманого випрямлення в концентраціях, що використовуються у терапії та експериментальних дослідженнях для блокування потенціал-керованих кальцієвих каналів.
Практичне значення отриманих результатів. Результати дисертації можуть знайти практичне застосування у фармакології, оскільки знайдений селективний блокатор калієвих каналів затриманого випрямлення, що не викликає епілептичної активності в зрізах гіпокампа in vitro. BIIA388Cl може бути корисним як препарат для лікування гострих інсультів і нейродегенеративних хвороб, таких як хвороба Альцгеймера. Виявлений вплив терапевтичних концентрацій німодипіна на калієвий струм затриманого випрямлення, поряд із “класичним” впливом на потенциал- керовані кальцієві струми L-типу, може вносити вклад у нейропротекторну дію німодипіна. Цю властивість німодипіна необхідно враховувати при створенні нейропротекторних препаратів на його основі.
Особистий внесок здобувача. Автором були виконана основна частина електрофізіологічних експериментів і статистичної обробка отриманих даних. Здобувач приймав активну участь у плануванні експериментів, обговоренні отриманих результатів і формулюванні висновків. Дослідження впливу BIIA388Cl на калієві струми проводились спільно з к.б.н. Т. Цинцадзе, дія німодипіна і ніфедипіна на калієвий струм затримуваного випрямлення досліджувалась спільно з аспіранткою Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця О. Островською.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладалися та обговорювалися на 5-ому міжнародному конгресі нейронаук IBRO (Ізраїль, Ієрусалім, 1999), на 29-ой щорічній конференції товариства нейронаук “Society for Neuroscience” (США, Майамі Біч, 1999), на симпозіумі Keystone “Potassium Channels: structure, function and therapeutic utilities”(США, Тахо Сити, 2000). Результати роботи доповідалися на семінарі Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (Київ, 2000).
Публікації. Результати роботи опубліковані в трьох наукових статтях і тезах трьох докладів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертації складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел з 244 найменувань. Робота викладена на 107 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 29 рисунками та містить 2 таблиці.
МЕТОДИКА досліджень.
Об’єкт досліджень. Дослідження дії BIIA388Cl, німодипіну, ніфедипіну і мібефрадилу на потенціал- керовані калієві каналі проводилися на ізольованих нейронах гіпокампа щура віком 14-18 діб. Гостроізольовані нейрони отримували за допомогою стандартного метода ферментативної обробки зрізів гіпокампа товщиною 300-500 мкм з використанням протеазы з Aspergillus oryzae, тип ХХIII, Sigma (Kiskin et al., 1991). Ізольовані нейрони виділялися при багаторазовому перепусканні потрібних ділянок зрізу через скляні піпетки (діаметр кінчика 0.1-0.5 мм).
Електрофізіологічні досліди. Трансмембранні струми реєструвалися методом “пэтч-кламп” у конфігурації “ціла клітина”. Стандартний зовнішній розчин містив (у мМ): NaCl 125, KCl 5, MgCl2 2, CaCl2 2, Glucose 10, Hepes- NaOH 10; pН= 7.4. Скляні мікропіпетки заповнювалися розчином KF 110, TRIS-base 20; pН= 7.4 (HCl), і мали опір 0.5-2 МОм. Розчини, що містили досліджувані речовини, прикладалися на клітину методом “фіксації концентрації”(Krishtal et al., 1983), який дозволяв швидко змінити позаклітинний розчин за 10-20 мс. Виміри популяційних потенціалів проводилися на поперечних зрізах гіпокампа щурів віком 20- 21 діб. Товщина зрізів складала 300-500 мкм. Позаклітинне відведення здійснювалося з області пірамідних нейронів зони СА1 за допомогою ніхромового електрода, товщиною 60 мкм. Колатералі Шафера стимулювалися з частотою 0.2 Гц біполярним ніхромовим електродом. Для збереження зрізів, а також для виміру популяційних потенціалів використовувався розчин NaCl 138, KCl 2.7, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, CaCl2 2.5, MgCl2 0.5, глюкоза 15, що постійно насичувався карбогеном (95% O2 + 5% CO2), pН= 7.4.
Всі електрофізіологічні експерименти проводилися при кімнатній температурі (19-240С).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
Вплив BIIA388Cl на сумарний калієвий струм. При додаванні у зовнішній розчин, BIIA388Cl пригнічує сумарний калієвий струм (СКС), викликаючи також прискорення кінетики спаду струму (рис.1). Струми, які показані на рис.1, були отримані при деполяризації клітинної мембрани до +30 мВ від підтримуваного потенціалу VH = -110 мВ. Ці струми являють собою суму швидкого (IA) і затриманого (IDR) калієвих струмів через мембрану пірамідного нейрона.
Рис.1. Дія BIIA388Cl (0.5 мкМ), що пригнічує сумарний калієвий струм, розвивається поступово, але не за механізмом “use-dependence”. А. При постійній рівномірній стимуляції ступінь блокування СКС зростає, поступово досягаючи стаціонарного рівня. Нейрон стимулювався кожні 5 секунд. Протокол стимуляції показаний поряд з осцилограмами струмів. Тривалість кожного стимулу 400 мсек. В. Рівень стаціонарного блокування може бути досягнутий без стимуляції нейрона, якщо піддати гіперполяризовану клітинну мембрану дії BIIA388Cl на протязі 3 хвилин.
Нейрон стимулювався з частотою один раз у п'ять секунд. Після додавання BIIA388Cl його здатність блокувати СКС розвивалася повільно від одного послідовного запису струму до іншого (рис.1А). Але, не дивлячись на це, сполука не створювала феномена “use-dependence”. Це добре помітно з рис. 1Б: після тривалого впливу речовини (протягом 3 хвилин) на гіперполяризовану мембрану нейрона та при відсутності стимуляції клітини ступінь блокування струму зберігалася постійною від одного запису до наступного при поновленні стимуляції. Поступове збільшення ступеня блокування калієвого струму після прикладення BIIA388Cl, ймовірно, пов’язане з тим, що сполука має проникнути у ліпідний бішар раніше, ніж отримати доступ до центрів зв’язування на калієвому каналі. Таким чином, порівнюючи частини А ї Б рис.1, можна побачити, що рівень стаціонарного блокування СКС може бути досягнутий або при постійній стимуляції, або при достатньо тривалому впливі речовини на гіперполяризовану мембрану нейрона. Початкова фаза СКС (включаючи його пік) відчуває менший вплив із боку BIIA388Cl, ніж пізня (рис.1А і Б). Відповідно кінетика спаду СКС робиться більш швидкою.
СКС складається із швидкої (IA) і затриманої (IDR) компоненти. Оскільки BIIA388Cl пригнічує пік СКС значно слабкіше за його пізню фазу, ця речовина може мати різні впливи на IA і IDR. Якщо IA блокується слабкіше, ніж IDR, це може, принаймні частково, пояснювати прискорення кінетики спаду сумарного струму. Для перевірки цієї гіпотези були виконані роздільні виміри швидкої і затриманої компонент.
Вплив BIIA388Cl на швидкий (IA) калієвий струм. BIIA388Cl викликав пригнічення IA, хоча чутливість цього струму до BIIA388Cl була істотно нижче, ніж у сумарного калієвого струму. Сполука не впливала на потенціалозалежність стаціонарної інактивації IA, але зменшувала його амплітуду при всіх тестових потенціалах. В присутності BIIA388Cl кінетика IA залишалася незмінною. Неможливо було досягти повного блокування IA через обмежену розчинність досліджуваної сполуки в позаклітинному розчині. Приблизне значення IC50, рівне 40 мкМ, було отримано шляхом екстраполяції наявної ділянки кривої доза-ефект в обшир великих концентрацій BIIA388Cl. Оскільки речовина має слабкий ефект на IA, добре виражене пригнічення СКС обумовлено, в основному, дією BIIA388Cl на калієвий струм затриманого випрямлення IDR.
BIIA388Cl як високоафінний блокатор калієвих каналів затриманого випрямлення. У пірамідних нейронах гіпокампа при підтримуваному потенціалі -70мВ IA практично цілком інактивований. Тому IDR може бути зареєстрований окремо від IA при VH ≥ -70 мВ. Підпороговий калієвий струм, що швидко активується та повільно інактивується (ID), спостерігається в пірамідних нейронах in situ (при роботі із зрізами) (Storm, 1988), але він, ймовірно, зникає в процесі ізоляції цих нейронів. Ми не змогли виявити навіть незначної присутності ID у випадку гостроізольованих клітин. Так, 100 mМ 4-амінопіридина (4-АР), концентрація достатня для повного блокування цього струму, не змінювала амплітуду СКС в гостроізольованих нейронах гіпокампа (n=7). Калієві струми, що активуються іонами Са2+ теж були відсутні у наших дослідах, оскільки внутрішньоклітинний розчин містив аніон F-, який пригнічує потенціал- керовані Са2+ струми та запобігає входу кальцію у клітину. Це дозволило ідентифікувати
Рис. 2. BIIA388Cl прискорює кінетику спаду IDR. При підвищенні концентрації сполуки швидкість спаду струму зростає монотонно. BIIA388Cl доданий до позаклітинного розчину у концентраціях 10, 20, 50, 100 та 200 нM. Відповідні цим концентраціям осцилограми струмів нормалізовані на контрольну амплітуду для наочної демонстрації прискорення спаду IDR. Апроксимування часового ходу струму при різних концентраціях BIIA388Cl проводилося моноекспоненціальною функцією в інтервалі між 80 і 400 мс після подачі тестового імпульсу. Відповідні постійні часу спаду показані на рисунку. Приведено протокол стимуляції. Для усунення IA у проміжку між кондиціонуючим та тестовим імпульсами клітину витримували на протязі 80 мс при потенціалі -20 мВ. Таким чином, прискорення кінетики спаду струму не було обумовлено появою IA на фоні пригніченого IDR.
струм, що повільно інактивується, який виміряли за цих умов, як IDR. Ми виявили, що IDR є надзвичайно чутливим до BIIA388Cl. Сполука пригнічувала IDR із прискоренням кінетики спаду струму. Швидкість спаду зростала при підвищенні концентрації сполуки (рис. 2). Таким чином, цей ефект, ймовірно, пояснювався взаємодією BIIA388Cl із калієвими каналами після їх відкривання.
Залежність доза-ефект, що описує спроможність BIIA388Cl блокувати IDR, була виміряна на піку струму і на його пізній фазі. Ці виміри дали значення IC50, рівне 300 ± 30 нМ для пікового значення IDR і 120 ± 20 нМ для значення струму, взятого на 300 мсек після початку деполяризаційного зміщення до +50 мВ (рис.3). З рис.3 видно, що BIIA388Cl вже в концентрації 10 нМ має помітний ефект на калієвий струм затриманого випрямлення. Реполяризація клітинної мембрани швидко знімала здатність сполуки блокувати калієвий канал, причому звільнення від блоку відбувалося по моноекспоненціальному закону з характерним часом 22 мс
Рис.3. Залежність доза-ефект для впливу BIIA388Cl на IDR, що виміряна на піку (IC50=300 ± 30 нМ) і на 300 мсек після початку деполяризаційного зміщення. (IC50=120 ± 20 нМ). Кожна точка показує середнє значення за трьома різними клітинами. Протокол вимірів приведений поруч із осцилограмами струмів. Ефект BIIA388Cl на калієвий струм затриманого випрямлення помітний вже в концентрації 10 нМ.
Рис. 4. Реполяризація мембрани знімає здатність BIIA388Cl блокувати канали затриманого випрямлення. A: Вихід каналів із блокованого стана був досліджений за допомогою двохімпульсного протоколу. Кількість каналів, що відновилися, виявлялася за допомогою повторного тестового імпульсу, поданого з невеличкою перемінною затримкою dt після закінчення першого імпульсу (протокол стимуляції показаний на рисунку). Ліворуч показана контрольне сімейство струмів (dt = 5...85 мс), праворуч - сімейство струмів, зареєстрованих у присутності при 0.5 мкМ BIIA388Cl. Струми, отримані в результаті кожної парної стимуляції, були нормовані на амплітуду струму, викликаного першим стимулом. Б: Залежність пікової амплітуди струму, викликаного другим тестовим імпульсом, від тривалості dt інтервалу між стимулами (при 0.5 мкМ BIIA388Cl). Амплітуда струму зростала моноекспоненціально з постійною часу 22±3 мс.
(рис.4). Таке усунення блока можна пояснити швидким роз'єднанням молекули BIIA388Cl із молекулою калієвого каналу під час реполяризації.
Дія BIIA388Cl на IDR при різних тестових потенціалах показана на рис. 5, де зображені родини СКС у контрольному розчині і після додавання 0.5 мкМ BIIA388Cl. Для одержання відповідних їм вольт- амперних характеристик IDR у контролі і у присутності сполуки, ми вимірювали амплітуду СКС на 50 і 400 мс від початку імпульсу, що деполяризує мембрану (рис. 5Б). Для більшості клітин дія BIIA388Cl не залежала від потенціалу (рис. 5В). Проте, сполука, ймовірно, мала комплексну дію: значна потенціалозалежність (посилення блоку із збільшенням деполяризації) все ж таки спостерігалася на 3 клітинах з 11 (рис.6).
Це розходження у дії BIIA388Cl може пояснюватися тим, що пірамідні нейрони гіпокампа експресують різні типи каналів затриманого випрямлення (Martina et al., 1998).
Сполука не сильно, але помітно змінювала потенціалозалежність стаціонарної інактивації IDR. Додавання 0.5 mМ BIIA388Cl викликало зсув кривої стаціонарної
Рис.5. Для більшості клітин дія BIIA388Cl не залежить від тестового потенціалу. А: Дія 0.5 мкМ BIIA388Cl на СКС в одному із пірамідних нейронів гіпокампа при різних тестових потенціалах. Приведено протокол стимуляції. Б: Вольт- амперна характеристика IDR, яка відповідає струмам, показаним у частині А рисунку. Амплітуда IDR була виміряна на 50 мс (n, q) і на 400 мс (l, m) від початку тестового імпульсу. Зафарбовані позначки на графіку відповідають контрольному позаклітинному розчину, незафарбовані- розчину, що містить 0.5 мкМ BIIA388Cl. В: Графік потенціалозалежності дії 0.5 мкМ BIIA388Cl на IDR. Блокування оцінювалося на 50 мс (q) і на 400 мс (m) від початку тестового імпульсу. Кожна точка показує середнє значення (n= 4) незаблокованої фракції IDR при кожному мембранному потенціалі.
Рис. 6. Потенціалозалежна дія BIIA388Cl на IDR спостерігалася на незначній фракції клітин (3 клітини з 11). А: Дія 0.5 мкМ BIIA388Cl на СКС в одному із пірамідних нейронів гіпокампа, що демонструє потенціалозалежне блокування при різних тестових потенціалах. Приведений протокол стимуляції. Б: Вольт-амперна характеристика IDR, що відповідає струмам, показаним у частині А рисунку. Амплітуда IDR була виміряна на 65 мс (n, q) і на 400 мс (l, m) від початку тестового імпульсу. Зафарбовані позначки на графіку відповідають контрольному позаклітинному розчину, незафарбовані- розчину, що містить 0.5 мкМ BIIA388Cl. В: Потенціалозалежність дії BIIA388Cl на досліджуваному нейроні. Блокування оцінювалося на 65 мс (q) і на 400 мс (m) від початку тестового імпульсу. I0 - контрольний струм, I- струм у присутності 0.5 мкМ BIIA388Cl.
інактивації у бік гіперполяризації на значення 4.1 ± 0.3 мВ (n=4) і викликало суттєве уповільнення виходу IDR із інактивації (рис.7). Характерний час виходу з інактивації, що складає у контролі 221 ± 2 мс, після додавання 0.5 mМ речовини збільшився до 348 ± 9 мс. Це говорить про те, що молекула BIIA388Cl зв’язується із каналом затриманого випрямлення в інактивованому стані і стабілізує цей стан. Ми також з'ясували чи конкурує молекула BIIA388Cl і іони К+ за зовнішній центр зв'язування іонів К+ у порі каналу затриманого випрямлення. Дія BIIA388Cl, практично не змінилася, коли позаклітинна концентрація калію була збільшена з 5 мМ до 130 мМ. При цих концентраціях калію в позаклітинному розчині 0.2 мкМ BIIA388Cl блокувала IDR відповідно до (52 ± 9) % і (48±11) % від контрольного оцінювалось на 400 мсек від початку деполяризації мембрани нейрона, n=4). Цей
Рис.7. Вплив BIIA388Cl на інактиваційні властивості IDR. А: Нормована залежність стаціонарної інактивації IDR від мембранного потенціалу в контролі і в присутності 0.5 mМ BIIA388Cl (n=3). Контроль:Vh = (-93.9 ± 0.3) мВ; k = (10.4 ± 0.3) мВ
BIIA388Cl 0.5 мкМ: Vh= (-98.0 ± 0.3) мВ; k= (12.5 ± 0.3) мВ. Амплітуда IDR вимірювалась на 50-й мсек після деполяризаційного зміщення мембранного потенціалу, щоб усунути домішку IА.
Б: Вихід IDR із інактивації в контролі і після додавання 0.5 mМ BIIA388Cl (n=4). Контроль:t= (221 ± 2) мс; BIIA388Cl 0.5 мкМ :t= (348 \(177) 9) мс.
результат свідчить на користь алостеричного приєднання молекули BIIA388Cl до калієвого каналу затриманого випрямлення. Для перевірки цієї гіпотези ми також порівняли ступені дії BIIA388Cl на вхідний і вихідні потоки іонів К+ (рис.8) через калієвий канал затриманого випрямлення У випадку, якщо молекула BIIA388Cl
Рис.8. Вольт- амперна характеристика вхідного і вихідних струмів через калієві канали затриманого випрямлення в умовах, коли рівноважний калієвий потенціал дорівнює +20 м. Додавання 0.2 mМ BIIA388Cl не викликає феномена “вихідного випрямлення”. Протокол стимуляції показаний на рисунку.
зв'язується у зовнішньому усті каналу, потік іонів К+, прямуючи до виходу, повинний виштовхувати блокатор із пори (Hille B, 1994). Це повинно призвести до зменшення блокування сполукою вихідного калієвого потоку в порівнянні із вхідним. Тому, в присутності у зовнішньому розчині BIIA388Cl, вольт- амперна характеристика повинна проявити феномен “вихідного випрямлення”. Проте, у наших дослідах сполука однаково ефективно блокувала вхідний і вихідні потоки (рис. 8), що підтверджує гіпотезу про алостеричне приєднання молекули BIIA388Cl до калієвого каналу.
Додавання 20 mМ BIIA388Cl у внутрішньоклітинний розчин не впливало на СКС, у той час як така ж концентрація сполуки в позаклітинному розчині викликала повне блокування затриманої компоненти калієвого струму. З даного досліду можна зробити висновок, що центр(и) зв'язування BIIA388Cl із калієвим каналом доступні тільки із зовнішньої сторони мембрани.
На рис. 9 показана дія BIIA388Cl на викликані популяційні спайки в зоні СА1 у
Рис. 9. Вплив BIIA388Cl (1mМ) і ТЕА (25 мМ) на популяційні спайки, що реєструються в зоні СА1 у відповідь на стимуляцію коллатералей Шаффера в гіпокампі щура.
зрізах гіпокампа щура. BIIA388Cl не збільшував тривалість спайку навіть у концентрації 1mМ. Водночас додавання 25 мМ ТЕА призводило до значного поширення спайка і появи епілептичної активності (рис. 9). BIIA388Cl зменшував амплітуду спайка, ймовірно, через його помірну дію на потенціал- керовані кальцієві і натрієві струми. Додавання 10 mМ BIIA388Cl у позаклітинний розчин викликало зменшення амплітуди кальцієвих струмів N-типу до (57.4 ± 13.7) % від контрольного значення (n=3), а натрієвих до (50.1 ± 18.1) % від контрольної амплітуди (n=3).
Німодипін пригнічує калієвий струм затриманого випрямлення (IDR), прискорюючи кінетику спаду струму. Німодипін відомий як селективний блокатор потенціал- керованих кальцієвих каналів L-типу. Незважаючи на це, ми виявили вплив німодипіну на калієвий струм затриманого випрямлення в мембрані пірамідних нейронів гіпокампа щура Так, німодипін, доданий у мікромолярних концентраціях у позаклітинний розчин, викликає пригнічення IDR, що супроводжується, як і у випадку з BIIA388Cl, прискоренням кінетики спаду струму (рис.10А). Залежність доза- ефект, що описує спроможність німодипіна блокувати IDR, була виміряна на 500 мсек після деполяризації мембрани до +30 мВ Ці виміри (рис. 10Б) дали значення IC50 рівне 2 ± 0.2 mМ. З рис.10А помітно, що німодипін має суттєвий вплив на IDR вже в концентрації 0.4mМ.
У мембрані пірамідних нейронів гіпокампа присутні два види калієвих каналів, що активуються іонами Са2+. Один із них IC, одночасно активується як деполяризаційним зміщенням, так й іонами Са2+, що входять через потенціал керовані Са2+-канали (Lancaster et al., 1987). Інший, IAHP, залежить тільки від внутрішньоклітинної концентрації іонів Са2+ (Lancaster et al., 1987). Обидва струми цілком блокуються швидким хелатором іонів Са2+ BAPTA при додаванні його у внутрішньоклітинний розчин, а також іонами Cd2+ у позаклітинному розчині. У зв'язку з цим, необхідно було довести, що німодипін діє на калієві канали безпосередньо, а не пригнічує лише калієві каналів, що активуються Са2+,
Рис. 10. Дія німодипіна на калієвий струм затримуваного випрямлення (IDR). А: Німодипін блокує IDR с прискоренням кінетики спаду струму. Протокол стимуляції показаний на рисунку. Для усунення швидкого калієвого струму (IA), безпосередньо перед тестовим імпульсом подавався попередній імпульс, що інактивував IA. Б: Крива доза- ефект для блокування IDR німодипіном. Вплив різних концентрацій німодипіна на IDR оцінювалася на 500 мсек після деполяризації мембрани до +30 мВ. Кожна точка на графіку отримана усередненням по 10 клітинах.
шляхом блокування потенціал- керованих Са2+-каналів і зменшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Для цього дія німодипіна на калієвий струм була відтворена у присутності 10 мМ ВАРТА у внутрішньоклітинному розчині для швидкого хелатування іонів Са2+, водночас з 300 мкМ Cd2+ у позаклітинному розчині для пригнічення потенціал- керованих Са2+-каналів. За цих умов німодипін також пригнічував калієвий струм із прискоренням кінетики спаду. Це свідчить про те, що німодипін безпосередньо діє на потенциал- керовані калієві канали. Німодипін у концентрації 4мкМ блокував IA до (59 ± 13) % контрольного значення амплітуди цього струму (n=3).
Вплив ніфедипіна на калієвий струм затриманого випрямлення (IDR). Ніфедипін пригнічував СКС, прискорюючи кінетику спаду струму. Оскільки ніфедипін, в основному, блокував пізню фазу СКС, з цього можна зробити висновок, що він блокує IDR. Крива доза- ефект для дії ніфедипіна на IDR була побудована на підставі амплітуд СКС на 400 мс від початку тестового імпульсу, де є присутнім лише калієвий струм затриманого випрямлення. Спорідненість ніфедипіна до калієвого каналу затриманого випрямлення виявилася значно слабкішою за спорідненість німодипіна. Константа половинного блокування для ніфедипіна (IC50) склала 44 ± 1 мкМ, у той час, як для німодипіна вона дорівнювала 2 ± 0.2. мкМ. Встановлена різниця в спорідненості німодипіну і ніфедипіну до калієвих каналів затриманого випрямлення може пояснити той факт, що перша сполука має більш виражені нейропротекторні властивості (див. обговорення результатів).
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Молекула BIIA388Cl зв'язується із калієвим каналом у відкритому і інактивованому станах. Для опису механізму блокування суттєвим є питання про те, у якому із станів каналу сполука з ним зв'язується. Отримані нами експериментальні дані дозволяють зробити висновок, що BIIA388Cl зв'язується з каналом у відкритому і інактивованому станах, у той час як закритий стан каналу затриманого випрямлення, очевидно, має низьку спорідненість до сполуки. Відсутність блокування каналу в закритому стані випливає з того, що початкова швидкість росту IDR не змінюється при додаванні BIIA388Cl (див. рис.3) (Hille B, 1994). Зсув кривої стаціонарної інактивації (рис. 7) говорить про зв'язування молекули BIIA388Cl із калієвим каналом у інактивованому стані. Про це також можна казати по зміні кінетики виходу каналів із інактивованого стану. Якщо істотна фракція інактивованих каналів зв'язується з блокатором, вихід струму з інактивації відбувається повільніше в порівнянні з контрольними умовами. Дійсно, вихід IDR із інактивації сповільнювався при додаванні BIIA388Cl (рис. 7Б.). В присутності BIIA388Cl у позаклітинному розчині пікова амплітуда IDR зменшується і зростає швидкість спаду струму (рис. 3). У рамках нашої гіпотези про механізм блокування, прискорення кінетики спаду струму в присутності сполуки обумовлене тим, що поряд із інактивацією відкритих каналів, відбувається їхнє поступове блокування сполукою. Свідченням на користь такої моделі є те, що велика концентрація сполуки викликає більше прискорення спаду IDR (рис. 2). Інше пояснення прискорення кінетики спаду струму в присутності сполуки може полягати в різкій зміні швидкості інактивації каналу, що викликається зв’язуванням з BIIA388Cl. У такому випадку при підвищенні концентрації BIIA388Cl ми також спостерігали б збільшення фракції струму, що швидко інактивується, але швидкість інактивації цього струму не залежала б від концентрації блокатора. Це є свідченням на користь того, що сполука блокує відкритий стан каналу, а не викликає різкі зміни швидкості інактивації калієвого каналу. Пригнічення IDR на піку струму пояснюється тим, що на початку тестового імпульсу, в присутності сполуки, у інактивованому стані знаходиться більше каналів (рис. 7А), ніж це було в контролі. Процес блокування відкритих каналів викликає додаткове пригнічення піка IDR. При переході каналу в закритий стан (під час реполяризації мембрани) молекула BIIA388Cl швидко відокремлюється від каналу (рис. 4), що не дозволяє сполуці розвити класичний феномен “use-dependence”.
Стаціонарне пригнічення калієвого струму позаклітинним BIIA388Cl може бути досягнуто або при регулярному стимулюванні клітинної мембрани, або під час достатньо тривалого впливу сполуки на гіперполяризовану мембрану (рис.1). Це, імовірніше за все, свідчить про те, що ліпофільна молекула BIIA388Cl повинна проникнути в ліпідний матрікс, щоб одержати доступ до центру (або центрам), з котрим(ми) вона зв’язується і здійснює блокування каналу. У те ж самий час BIIA388Cl, доданий у внутрішньоклітинний розчин, не впливає на калієвий струм затриманого випрямлення. Це, говорить про те, що центр зв'язування молекули BIIA388Cl знаходиться із зовнішньої сторони мембрани.
Характер потенціалозалежності впливу BIIA388Cl на калієві канали. На більшості досліджуваних нейронів (8 клітин із 11) блокування не залежало від потенціалу (рис.5). Ситуація ускладнювалася тим, що в 3 клітинах із 11 спостерігалася суттєва потенціалозалежність блокування (збільшення пригнічення із збільшенням деполяризації) (рис. 6). Таке розходження в характері блокування може пояснюватися гетерогенністю калієвих каналів, що експресуються в нейронах гіпокампу (Maletic-Savatic et al., 1995; Martina et al., 1998). Калієві канали затриманого випрямлення в пірамідних нейронах гіпокампу складаються в основному з Kv2 субодиниць, хоча в 17% клітин була також показана експресія Kv3 субодиниць (Martina et al., 1998).
Ймовірно, молекула BIIA388Cl алостерично зв'язується із калієвим каналом. Оскільки сполука BIIA388Cl повинна бути заряджена позитивно за фізіологічними значеннями рН, відсутність потенціалозалежності блоку в більшості досліджуваних нейронів говорить про те, що речовина не є блокатором пори, а, ймовірно, приєднується до каналу алостерично (далеко від центрів зв'язування калію). В 3 нейронах із 11, у яких спостерігалася потенціалозалежність блокування, пригнічення струму посилювалося з деполяризацією. Проте, у випадку позитивно зарядженого блокатора пори, напрямок зміни ступеня блокування повинний бути зворотним, що є свідченням відсутності блокування пори і у цьому випадку. Підвищення позаклітинної концентрації калію не впливало на спорідненість BIIA388Cl до калієвого каналу затриманого випрямлення, крім того, BIIA388Cl однаково ефективно пригнічує вхідний і вихідні потоки іонів К+ через калієвий канал затриманого випрямлення (рис. 8). Вищенаведені факти також свідчать про алостеричне зв'язування молекули BIIA388Cl із каналом.
Можливості фармакологічного застосування сполуки BIIA388Cl. Пошук нових фармакологічних препаратів, що мають нейропротекторну дію, є надзвичайно актуальною задачею. Клінічні випробування блокаторів NMDA-рецепторів у якості нейропротекторів при ішемії головного мозку не виправдали очікувань, хоча ці сполуки і демонстрували свою ефективність у різноманітних моделях ішемії головного мозку в лабораторних дослідах (Lee et al., 1999). Це навіть поставило під сумнів саму важливість ексайтотоксичності як основного фактора загибелі клітин у результаті ішемії (Lee et al., 1999). У зв'язку з цим, ймовірно, найближчим часом акцент протиішемічної терапії, усунеться з блокування глутаматних рецепторів. Відбудеться пошук нових препаратів, що впливають на інші механізми постішемічного ушкодження нервової тканини. Зокрема, селективне блокування калієвих каналів затриманого випрямлення може виявитися перспективним із погляду нейропротекції.
Відповідно до існуючої в даний час концепції IA і IC дають основний внесок у процес реполяризації мембрани нейронів ЦНС під час потенціалу дії. IDR менше задіяний у цьому процесі, ймовірно, через більш повільну кінетику активації. Проте в патологічних умовах IDR стає одним із головних шляхів виходу калію з деполяризованих нейронів завдяки своєї низької спроможності інактивуватися. Тому селективне блокування IDR (особливо його пізньої фази) може розірвати ланцюг подій, що ведуть до деполяризації нейронів, що поширюється, викликаної надлишковим виходом іонів К+ у позаклітинний простір, і пов'язаному з цим ураженню нервової тканини. BIIA388Cl реально здійснює селективне блокування пізньої фази IDR і не викликає епілептичної активності в зрізах гіпокампу. У зв'язку з цим ця сполука може бути запропонована в якості можливого нейропротекторного засобу.
Зниження концентрації внутрішньоклітинного калію може активувати нейрональний апоптоз. Це може бути обумовлене зниженням [К+]i нижче фізіологічного рівня та активуванням, внаслідок цього, переходу прокаспази-3 в активну форму (каспаза-3), що є важливим чинником у розвитку апоптозу (Bortner et al., 1997). Клітини утрачають внутрішньоклітинний калій на ранній стадії розвитку деяких форм апоптозу, при цьому ті з них, у яких відсутній ефективний механізм підтримки об’єму, стискуються. Первинне зменшення концентрації внутрішньоклітинного калію зв'язують із збільшенням провідності клітинної мембрани, обумовленої калієвими каналами затриманого випрямлення (Yu et al., 1997). Було показано, що блокатори потенціал- керованих калієвих каналів ТЕА і 4-АР, додані в позаклітинний розчин, перешкоджають розвитку апоптозу (Beauvais et al., 1995; Yu et al., 1997).
Ймовірно, апоптоз грає важливу роль у загибелі клітин внаслідок фокальної і глобальної ішемії (Choi, 1996; Lee et al., 1999). BIIA388Cl, що селективно блокує IDR, може перешкоджати розвитку апоптозу (рис .4.2.) і збільшувати кількість життєздатних клітин після ішемії, особливо в пенумбральному обширі, де апоптоз може бути основним механізмом загибелі нейронів і глії.
Таким чином, сполука BIIA388Cl може бути запропонована в якості нейропротекторного препарату, що пригнічує депресію, що поширюється, і апоптоз в умовах ішемії, шляхом блокування калієвих каналів затриманого випрямлення. Помірний вплив BIIA388Cl на потенціал- керовані кальцієві і натрієві канали, повинен посилювати нейропротекторні властивості цієї сполуки.
| 
