|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
Кримський державний медичний університет
ім. С.І. Георгієвського
Климчук Лариса Феофанівна
УДК 616-001.17-02:612.112.91/.94.08
Морфофункціональні зміни нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів крові за дії тяжкої термічної травми
14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Сімферополь – 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії ім. І.Я. Горбачевського Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Кузів Оксана Євстахіївна, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, професор кафедри патологічної анатомії з секційним курсом та судової медицини.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Каширина Надія Костянтинівна, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського, завідувач кафедри гістології, цитології, ембріології;
доктор медичних наук, професор Пушкар Михайло Степанович, Вінницький державний медичний університет ім. М.І. Пирогова, завідувач кафедри гістології, цитології, ембріології
Провідна установа: Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра гістології, цитології, ембріології.
Захист відбудеться 5 березня 2003 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.600.02 Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (95006, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (95006, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7).
Автореферат розісланий 23 січня 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради К 52.600.02
кандидат медичних наук, доцент М.Ю. Новіков
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Опіки складають важливу медичну, соціальну та економічну проблему.
В наш час широкого застосування механізації та автоматизації, швидкого росту тяжкої індустрії та хімічної промисловості, а також використання електричної та атомної енергії в науці та техніці сприяло значному збільшенню частоти опікових травм (Воздвиженский С.И. и соавт., 1994; Козинец Г.П., Повстяной Н.Е., 1994; Rudowsky N., 1980; Rozen K., 1993).
Актуальність цієї проблеми визначається не тільки частотою, але й тяжкістю ураження, складністю та довготривалістю лікування, високою летальністю (Козинец Г.П., 1992; Смирнов С.В. і співавт., 1997; Повстяний М.Є. і співавт, 1999).
Необхідно відзначити, що за останні роки, завдяки сучасним методам лікування, структура летальності при опіковій хворобі суттєво змінилась. Більшість хворих з тяжкими опіками, виведені із стану шоку і гострої токсемії, помирають у більш пізні стадії хвороби.
Аналіз літературних даних стосовно експериментальних та клініко-імунологічних досліджень (Пекарский Д.Е., 1982; Лозовой В.П., 1985; Пылаев С.И., 1985; Alexander M., 1977; Edwans S., 1994) дозволяє зробити висновок, що за тяжкої опікової травми порушуються всі ланки антиінфекційного захисту організму, як неспецифічних чинників, так і специфічної імунологічної реактивності Т- і В-систем імунітету. Вторинний імунодефіцит, який виникає за опікової хвороби, обумовлює розвиток інфекції в рані, а також генералізацію інфекційного процесу. На сьогодні в перебігу опіків сепсис є однією із провідних причин смерті (50-60 % за Вихрієвим Б.С. (1986), Кузіним М.І. із співавт. (1982), Колкером І.І. із співавт. (1980), Алексеєвим А.А. із співавт. (1999)).
Генералізація інфекції у тяжкоопечених може відбуватися у будь-якій стадії хвороби в післяшоковому періоді, що обумовлено різким пригніченням імунних механізмів, які виникають безпосередньо після травми і супроводжують опікову хворобу на всіх її стадіях. Тому, на думку І.І. Колкера (1980), тяжку опікову хворобу необхідно розглядати як захворювання з вторинною (набутою) імунологічною недостатністю, за якої особливо пригнічені клітинні механізми імунітету.
Висока патогенність і антибіотикорезистентність мікроорганізмів, специфіка термічної травми, за якої неможливо попередити розмноження бактерій у рані, розвиток вторинної імунологічної недостатності складає великі труднощі в профілактиці та лікуванні опечених хворих і спонукає шукати нові підходи до вирішення цієї актуальної проблеми.
В науковій літературі є поодинокі дослідження (Кузів О.Є., 1983; Сморщок Ю.С., 1993; Мащенко В.А. і співавт., 1994), присвячені вивченню морфофункціонального стану нейтрофільних гранулоцитів крові хворих з опіками, проте відсутні дослідження з вивчення мембранної активності фагоцитів залежно від рівня ендотоксемії.
Останнім часом все більшого значення набувають дослідження, що пов’язані із відкриттям особливої субпопуляції лімфоцитів – природних клітин-кілерів. На відміну від інших ефекторних клітин, ці лімфоцити не потребують для індукції цитотоксичного ефекту попередньої імунізації. Природні кілери крові верифікуються як великі грануловмісні лімфоцити (ВГЛ) (Бутенко А.К., 1987; Herberman R., 1986, 1993; Zak K.P. et al., 1991; Fehneger T. et al., 1997) і майже не досліджені у хворих із термічною травмою.
Найбільш перспективним є використання методу визначення кількості ВГЛ крові в поєднанні з електронно-мікроскопічними дослідженнями, які дозволяють більш точно ідентифікувати ці клітини та оцінити їх функціональний стан за субмікроскопічною будовою, а саме за ультраструктурою цитоплазматичних гранул – основних органел, які визначають цитотоксичний ефект ВГЛ. У доступній літературі відсутні роботи, в яких би одночасно досліджувались кількісні та якісні зміни ВГЛ, зокрема морфометрія, та ультраструктура, що дуже важливо для отримання більш повної інформації про стан клітин-ефекторів природного імунітету за опікової травми.
Лімфоцити визнані центральною клітиною імунної системи, яка включає в себе розмаїту за формою та функцією популяцію клітин. Пошкоджуючий чинник може викликати активацію або депресію імунної системи, що обов’язково знаходить своє відображення в будові лімфоцитів. Однак, в доступній літературі ми не знайшли єдиної класифікації лімфоцитів за морфологічними ознаками та робіт, які б оцінювали загальну імунологічну реактивність організму за допомогою морфометричного аналізу лімфоцитів у крові в динаміці опікової травми.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною п’ятирічної комплексної наукової програми кафедри гістології, цитології та ембріології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського за темою "Життєздатність ксено- та аутодермотрансплантатів при різних методах консервування" (номер держреєстрації 0100U005062). Автор особисто виконала розділ стосовно патогенетичного обгрунтування різкого пригнічення клітинних чинників неспецифічної резистентності організму на підставі вивчення впливу системної ендотоксемії на морфофункціональний стан нейтрофільних гранулоцитів та великих грануловмісних лімфоцитів периферійної крові за дії термічної травми, що відображено в матеріалах дисертації. На основі вивчення морфометричних параметрів лімфоцитів периферійної крові розробила критерії та провела оцінку загального стану імунної реактивності в тяжкоопечених і запропонувала її для впровадження в практику опікових відділень.
Мета дослідження: з’ясувати роль структурної перебудови циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів і великих грануловмісних лімфоцитів у забезпеченні функції клітинної ланки неспецифічної резистентності та на основі морфометричних параметрів лімфоцитів периферійної крові розробити критерії оцінки загальної імуноздатності організму тяжкообпечених.
Для реалізації мети було поставлено такі задачі:
- Розкрити вплив термічної травми на структуру і функцію нейтрофільних гранулоцитів як основної клітинної ланки протиінфекційного захисту організму хворих з опіками різного ступеня тяжкості.
- Дати кількісну, морфометричну та субмікроскопічну характеристику великих грануловмісних лімфоцитів периферійної крові здорових осіб і виділити критерії їхньої функціональної активності.
- Дослідити кількісні, морфометричні та ультраструктурні зміни великих грануловмісних лімфоцитів периферійної крові в різні терміни після опікової травми.
- Вивчити вплив ендогенної інтоксикації на функціональну активність великих грануловмісних лімфоцитів периферійної крові хворих з термічними опіками тяжкого ступеня.
- Провести комплексне світлооптичне, морфометричне та елекронно-мікроскопічне вивчення лімфоцитів периферійної крові здорових осіб та прокласифікувати лімфоцити на основі розроблених критеріїв.
- Дати оцінку загальній реактивності організму на основі морфометричного аналізу лімфоцитів периферійної крові хворих з термічною травмою.
Об’єкт дослідження: нейтрофільні гранулоцити і лімфоцити крові, великі грануловмісні лімфоцити.
Предмет дослідження: структурно-функціональна перебудова нейтрофільних гранулоцитів, великих грануловмісних лімфоцитів та лімфоцитів крові при дії термічної травми на організм.
Методи дослідження:
- морфологію нейтрофільних гранулоцитів, великих грануловмісних лімфоцитів крові та лімфоцитів визначали за допомогою світлооптичного та електронно-мікроскопічного методів;
- функціональну активність клітинних чинників неспецифічної резистентності оцінювали методами визначення фагоцитарного числа, фагоцитарного індексу та індексу бактерицидності, а також шляхом визначення площі азурофільних гранул у великих грануловмісних лімфоцитах периферійної крові;
- морфометричні дослідження проводили для класифікації лімфоцитів периферійної крові і виведення лімфоцитарних кривих у здорових осіб та у хворих на термічну травму за допомогою комп’ютерної системи обробки зображень IBAS-2000;
- рівень системної ендотоксемії визначали спектрофотометрично за вмістом середніх молекул в сироватці крові.
Наукова новизна одержаних результатів. В роботі дістало подальший розвиток вчення про ультраструктурні зміни та функціональну активність нейтрофільних гранулоцитів крові хворих за дії термічної травми різного ступеня тяжкості.
Вперше показано зміну мембранної активності та збільшення вмісту гіперактивних нейрофільних гранулоцитів периферійної крові у хворих в міру наростання ендотоксемії за тяжкої термічної травми.
Вперше було визначено відносну і абсолютну кількість, морфометричні параметри та морфологічні особливості великих грануловмісних лімфоцитів крові у хворих з тяжкою термічною травмою і показано, що остання викликає різке зменшення кількості та функціональної активності великих грануловмісних лімфоцитів протягом усіх термінів спостереження і навіть на час виписки хворих із стаціонару не досягає показників здорових осіб.
За даними світло-, морфометричного та електронно-мікроскопічного дослідження розроблено класифікацію лімфоцитів крові здорових осіб і вперше виділено IV типи лімфоцитів у залежності від стану ядра і цитоплазми.
На основі запропонованої класифікації типів лімфоцитів крові вперше проведено оцінку загального стану реактивності організму хворих з тяжкою термічною травмою і виявлено депресію імунної системи, обумовлену різким зменшенням кількості лімфоцитів І і ІІ типів.
Практичне значення одержаних результатів. Нами отримані дані, які свідчать про різке пригнічення функції нейтрофільних гранулоцитів і великих грануловмісних лімфоцитів крові як важливих клітинних чинників неспецифічної резистентності протягом всієї опікової хвороби, однак, найбільш вираженої на 11-21 добу після тяжкої термічної травми. Структурною основою депресії функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів є гіперактивність їх мембран, що створює передумови саморуйнування клітин та різке зменшення кількості і розмірів цитотоксичних гранул великих грануловмісних лімфоцитів за одночасного значного зменшення їх вмісту в периферійній крові тяжкоопечених, що залежало від рівня ендотоксемії. Встановлено, що навіть на час клінічного видужання і виписки хворих із стаціонару показники клітинної ланки неспецифічної резистентності не досягали рівня здорових осіб.
Виявлені нами морфо-функціональні зміни нейтрофільних гранулоцитів та великих грануловмісних лімфоцитів периферійної крові вимагають подальшого пошуку та розробки шляхів корекції для підвищення природної опірності організму хворих за дії тяжкої термічної травми.
Вперше на основі запропонованої класифікації лімфоцитів крові пропонується високоінформативний морфометричний метод оцінки загальної реактивності організму тяжкоопечених, а отримані результати можуть слугувати основою для проведення адекватної терапії та одночасно методом контролю її ефективності.
Перевага методу полягає в швидкому підрахунку розмірів лімфоцитів крові, кількісного виразу отриманих даних, не вимагає великої кількості крові для дослідження та дорогих реактивів.
Результати досліджень впроваджено у навчальний процес кафедри гістології, цитології та ембріології Івано-Франківської державної медичної академії, кафедри патологічної анатомії з курсом судової медицини Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського, в опіковому відділенні міської лікарні № 1 м. Тернополя, опікових центрах м. Житомира і м. Рівного.
Особистий внесок здобувача. Проведена розробка основних теоретичних і практичних положень дослідження. Самостійно здійснено підбір та обстеження хворих з опіковою травмою, забір матеріалу, вивчено та проведено морфометричне дослідження мазків периферійної крові, підготовлено матеріал для проведення електронної мікроскопії. Статистично опрацьовано дані, інтерпретовано отримані результати, сформульовано основні положення, висновки та практичні рекомендації. У роботах, що опубліковані в співавторстві, здобувачем самостійно зібрано матеріал, проведено огляд літератури за темою роботи, здійснено статистичну обробку даних, зроблено узагальнення та висновки.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднені на підсумкових наукових конференціях (Тернопіль, 1999; 2000; 2001; 2002); ІV Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000), ІІІ Міжнародному конгресі з інтегративної антропологї (Бєлгород, 2000); V Міжнародному конгресі студентів і молодих учених, приурочений до 10-ї річниці незалежності України (Тернопіль, 2001); VІ Міжнародному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2002).
Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 14 наукових працях, із них 4 статті – у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, та 10 – у збірниках і матеріалах конференцій та конгресів.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 174 сторінках і складається із вступу, 4 розділів, висновків, рекомендацій щодо наукового і практичного використання здобутих результатів, списку використаних літературних джерел (всього 265 найменувань). Робота проілюстрована 17 таблицями та 58 рисунками. Ілюстрації, таблиці, список використаних джерел викладені на 43 сторінках.
Основний зміст роботи
Матеріал і методи дослідження. Робота грунтується на обстеженні 115 осіб, 95 із них склали хворі віком від 16 до 60 років (64 чоловіків і 31 жінка), які знаходились на лікуванні в опіковому відділенні Житомирської обласної лікарні ім. О.Ф. Гербачевського і отримували загальноприйняте комплексне лікування.
Першу групу склали 48 пацієнтів із опіковою травмою середнього ступеня тяжкості – індекс тяжкості ураження (ІТУ) – 60 од. при наявності глибоких опіків ІІІА – ІІІБ ступенів до 15 %. Другу групу – 47 потерпілих з опіками тяжкого ступеня – ІТУ – 61-90 од. при наявності глибоких опіків ІІІА – ІІІБ та ІV ступенів за площею 20-35 %. Дослідження проведено на 3-4, 11-14 і 21-24 доби та на час виписки хворих із стаціонару. Групою порівняння були 20 практично здорових осіб (первинних донорів крові), серед них 13 чоловіків і 7 жінок віком від 18 до 50 років.
Важкість ендогенної інтоксикації оцінювали шляхом вивчення неспецифічної токсичності плазми крові, яку визначали за вмістом молекул середньої маси їх низько- і високомолекулярних фракцій та ступенем ультраструктурних змін нейтрофільних гранулоцитів крові. Вміст середньомолекулярних пептидів і їх фракцій у крові донорів та опечених вивчали шляхом прямої спектрофотометрії (Габиелян Н.И., Липатов В.И., 1983).
Характер, послідовність і ступінь деструкції та мембранної активності сегментоядерних нейтрофілів, обумовлених загальною токсичністю плазми крові, вивчали за допомогою елекронного мікроскопа згідно методики З.А. Бутенко (1974). Лейкоцитарну плівку, яку виділяли із гепаринізованої венозної крові опечених хворих та донорів шляхом центрифугування, фіксували в 2,5 % розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері з наступною дофіксацією у 1 % розчині чотирьохокису осмію, дегідратували в спиртах і ацетоні, контрастували уранілацетатом і заливали в епоксидні смоли. Із залитих в епонові смоли зразків виготовляли ультратонкі зрізи, які контрастували за Рейнольдсом і вивчали в електронному мікроскопі ЕМВ-100В.
Вивчали фагоцитарний індекс (ФІ) – число активно фагоцитуючих нейтрофілів із 100 клітин; фагоцитарне число (ФЧ) – середнє число мікробних тіл, захоплених одним нейтрофілом; індекс бактерицидності (ІБ) – відсотковий вираз співвідношення всіх вбитих до всіх захоплених бактерій нейтрофільним гранулоцитом.
ВГЛ підраховували в мазках периферійної крові, фарбованих за Романовським-Паппангаймом (загальноприйнята методика). З метою чіткого забарвлення азурофільних гранул використовували фосфатний буфер концентрацією 0,1 моль/л (рН 7,2-7,4) для розведення фарби. Відсотковий вміст ВГЛ підраховували за відношенням до інших лейкоцитів (200 клітин у мазках крові) та лімфоцитів (100 лімфоцитів). Абсолютний вміст ВГЛ в 1 л крові вираховували на основі їхнього відсоткового вмісту і загального числа лейкоцитів (Кіндзельський Л.П. і співавт., 1995).
До сьогодні відсутній інтегральний тест для визначення імунологічного стану організму. Основними клітинами, які здійснюють імунологічний захист і забезпечують імунний гомеостаз є популяція лімфоцитів, а тому морфометричний аналіз цих клітин у периферійній крові дає можливість здійснити оцінку стану лімфоцитів, що дозволить судити в значній мірі про захисні сили організму. Матеріалом для дослідження служили мазки периферійної крові донорів та хворих з тяжкою опіковою травмою, до виготовлення яких ставились високі вимоги. Останні повинні були бути тонкими з максимально рівномірним розподілом клітин по всьому предметному склі. Мазки фіксували сумішшю Нікіфорова і фарбували за Романовським-Паппангаймом. Вимірювання проводили по 50 лімфоцитів у кожному мазку, зберігаючи правила випадкового вибору. Заміряли площу ядра (Sn), площу цитоплазми (Sc), максимальний діаметр ядра (dNmax), мінімальний діаметр ядра (dNmin), максимальний діаметр цитоплазми (dCmax) мінімальний діаметр цитоплазми (dCmin) лімфоцитів та середньої площі гранул ВГЛ периферійної крові. Вимірювання проводили за допомогою системи обробки зображень ІВАS-2000 в лабораторії електронної мікроскопії Інституту нейрохірургії АМН України (завідувач – доктор медичних наук, професор А.Т. Носов).
Статистична обробка отриманих даних проведена на кафедрі медичної інформатики з курсом фізики Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського (завідувач – доктор медичних наук А.А. Гудима) з використанням програми табличного процесора Microsoft Excel на мікропроцесорі Celeron-333.
Результати дослідження та їх обговорення. У результаті проведених досліджень встановлено підвищення токсичних властивостей сироватки крові у ранньому післяшоковому періоді (3-4 доба), пропорційно тяжкості термічної травми (в 1,43 рази (р<0,05) у хворих з опіками середнього ступеня тяжкості та в 1,68 рази (р<0,05) у хворих з опіками тяжкого ступеня). При цьому відмічено збільшення концентрації низькомолекулярної фракції середніх молекул, проте, особливо стрімко зростала проти норми високомолекулярна фракція середніх молекул.
Лише 14,6 % нейтрофільних лейкоцитів периферійної крові здорових осіб знаходяться в активованому стані, тобто здатні захоплювати і перетравлювати бактерії. Наші дані співпадають із результатами інших авторів (Галанкін В.Н., Токмаков А.М., 1987; Пигаревский В.Е. и соавт., 1982). За дії опікової травми уже на 3-4 добу значна кількість лейкоцитів переходить в активований стан, що проявляється у збільшенні кількості фагоцитуючих лейкоцитів проти норми (в 4,4 рази – у хворих з опіками середнього ступеня тяжкості та в 5,5 рази – у хворих з опіками тяжкого ступеня). Така значна активація нейтрофільних гранулоцитів характеризує кількісну сторону реакції цієї системи. Одночасно зростає і фагоцитарне число, що свідчить про захоплення значної кількості бактерій на тлі підвищеного числа активованих клітин. Нарешті, індекс бактерицидності нейтрофільних гранулоцитів опікових хворих, як інтегральний показник функції, знижується в міру наростання тяжкості перебігу термічної травми.
Ендотоксини активують систему нейтрофільних гранулоцитів (Спас В.В., 1990; Усенко Ю.Д., Мальцева Л.А., 1999), проте та ж сама токсемія, яка викликає активацію системи фагоцитів, пошкоджує клітини, які знаходяться в крові, що підтверджується проведеними нами електронно-мікроскопічними дослідженнями. В лейкоцитах виявляли різку дегрануляцію, дестабілізацію плазматичних і ядерних мембран і дрібні ділянки цитолізу. Ці пошкодження були настільки значними, що нейтрофільні гранулоцити не були спроможні в повному обсязі перетравлювати мікроорганізми.
Проте, уже на 3-4 добу після опікової травми появляються нейтрофільні гранулоцити з електронно-мікроскопічними ознаками помірно вираженої мембранної активності (наявність лобоподій, фагосом та дегрануляція зернистості цитоплазми, зменшення гранул глікогену), яких більше виявляли у периферійній крові хворих з тяжким ступенем проти пацієнтів з середнім ступенем тяжкості опікової травми.
Найбільш виражені патологічні зміни з боку сегментоядерних лейкоцитів спостерігався на 7-14 добу, що обумовлено різким зростанням вмісту токсичності сироватки крові в залежності від ступеня тяжкості опікової травми (за середнього – в 1,6 рази, а за тяжкого – у 1,9 рази). Ще більше клітин в порівнянні із нормою та попереднім терміном спостереження переходять в активний стан (у хворих за опіків середнього ступеня тяжкості їх було уже 67,7 %, а тяжкого – 79,8 % проти 14,6 % у здорових осіб) з одночасним зростанням поглинаючої здатності нейтрофільних гранулоцитів. Однак, індекс бактерицидності, як загальний показник функціональних можливостей фагоцитів, прогресивно знижується в міру наростання ендотоксикозу. Наші дослідження підверджуються результатами інших авторів, які показали, що більшість нейтрофільних гранулоцитів опікових хворих втрачають здатність стримувати ріст стафілококів, а вираженість ендотоксикозу корелює з площею ураження шкіри (Саркисов Д.С. и соавт., 1988; Пермяков Н.К. и соавт., 1989; Bjerknes R. et al., 1989).
Електронно-мікроскопічні дослідження свідчать, що в період токсемії (7-14 доба спостереження) в периферійній крові опікових хворих виявляли переважно нейтрофільні гранулоцити з ознаками підвищеної мембранної активності. Необхідно вказати, що частка гіперактивних клітин корелює із тяжкістю опікової хвороби та рівнем токсемії.
Так, у периферійній крові хворих з опіками тяжкого ступеня домінували нейтрофільні гранулоцити з електронно-мікроскопічними ознаками надзвичайно підвищеної мембранної активності, яка поєднувалася з явищами альтерації та дистрофії. На високу мембранну активність вказувала нерівність контурів клітин, чисельні тонкі довгі та короткі вирости цитоплазми, які не мали органел. Множинні фагосоми були різні за розмірами і мали неправильну форму. Зернистість цитоплазми різко зменшена внаслідок вираженої дегрануляції. Вміст гранул виходив за межі органел і проявлявся чисельними осередками лізису і просвітленням матриксу цитоплазми по периферії спустошених гранул. Необхідно вказати, що в цитоплазмі нейтрофільних гранулоцитів із гіперактивністю мембран виявляли великі вакуолі з лапчастим вмістом, який за своїм виглядом нагадував клапті плазми поза лейкоцитами. Біля вакуолей локалізувались дегранульовані зерна, що свідчило про вихід їхнього вмісту в просвіт вакуолі. Наявність множинних осередків цитолізу, "порційного" некрозу гіалоплазми вказували на початок деструкції клітин, вміст яких у крові зростав. Гіперактивність мембран нейтрофільних гранулоцитів створює умови для саморуйнування і відповідно зниження їхньої функціональної активності, що підтверджується зниженням їхнього індексу бактерицидності в 1,2 рази проти норми на 14 добу після травми тяжкого ступеня.
Необхідно зазначити, що в названий термін спостереження внаслідок лейкоцитозу зростав у 2,5 рази абсолютний вміст нейтрофільних гранулоцитів, хоча відносний – зріс лише у 1,1 рази проти норми. Відносний вміст паличкоядерних нейтрофілів зростав у 2,4 рази, а абсолютний – у 5,7 рази. Зареєстровано появу в периферійній крові юних нейтрофільних гранулоцитів. Отже, ендотоксини подразнювали мієлоїдний паросток червоного кісткового мозку, що за опікової травми поряд з лейкоцитозом обумовлювало різкий зсув лейкоцитарної формули вліво, який корелював із тяжкістю ендотоксемії.
У більш пізні терміни спостереження (21-24 доба) відбувалось деяке зниження концентрації середньомолекулярних пептидів і їх фракцій в крові. Більш виражено це було у хворих з термічними опіками середнього ступеня, в меншій мірі – у хворих з опіками тяжкого ступеня. Незважаючи на тенденцію до зниження концентрації токсинів у крові, вміст їх протягом спостереження був високим і пропорційним тяжкості опікової травми (в 1,2 рази у хворих з опіками середньої тяжкості та в 1,4 рази у хворих з опіками тяжкого ступеня).
Ендотоксемія викликала глибоку альтерацію субклітинних структур більшості лейкоцитів крові опечених, особливо, за тяжкого перебігу хвороби.
В системному кровоплині, де переважали нейтрофільні гранулоцити з гіперактивністю мембран, формувались агрегати-емболи, які складались із гіперактивних нейтрофільних гранулоцитів, тромбоцитів, іноді лімфоцитів. Можливо, активація оксидантного метаболізму нейтрофільних гранулоцитів ендотоксинами з утворенням вільних радикалів кисню, лізосомних ферментів, лейкотриєнів та інших біологічно активних сполук в агрегатах-емболах, які з плином крові заносились в різні органи і системи та ініціювали там пошкодження органів і тканин, зокрема, серця, легень, печінки та інших. Твердження про те, що високі ступені ендотоксемії можуть супроводжуватись токсин-індукованим за участю нейтрофільних гранулоцитів пошкодженням органів і тканин існує в науковій літературі (Маянская Н.Н. и соавт., 1990).
Підтвердженням наявності високого рівня токсемії є подальше зростання відсоткового (у 4,1 рази) та абсолютного (у 10,3 рази) вмісту паличкоядерних, наявність юних нейтрофілів, за найвищого лейкоцитозу на 21-24 добу в периферійній крові хворих з опіковою травмою тяжкого ступеня.
Виражена альтерація сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів є не тільки об’єктивним критерієм зміни субмікроскопічної організації у відповідь на токсемію, але інтегральною оцінкою їх функціональних можливостей. Чим глибша деструкція ультраструктурних компонентів нейтрофільних гранулоцитів периферійної крові хворих з тяжкою опіковою травмою, тим більше виражене порушення їхньої функції.
На 21-24 добу спостереження виявляли подальше пригнічення фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів пропорційно тяжкості опікової травми (фагоцитарний індекс зростав у 4 рази у хворих з травмою середнього ступеня і майже у 5 разів у хворих з опіками тяжкого ступеня проти показників здорових осіб). Фагоцитарне число в обох групах наближалось до норми. Проте, індекс бактерицидності, як якісний показник функції нейтрофільних гранулоцитів, залишався значно зниженим, особливо у хворих з опіками тяжкого ступеня (в 1,2 рази проти норми).
У процесі одужання морфофункціональні показники нейтрофільних лейкоцитів та вміст молекул середньої маси в плазмі тягнулись до рівня нормальних величин, проте не досягали їх на час клінічного одужання і моменту виписки хворих із стаціонару.
Отже, зміни фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів неоднонаправлені. З одного боку, за опікової хвороби значно зростає кількість фагоцитуючих нейтрофілів крові, а з іншого – спостерігається пригнічення їх поглинальної спроможності.
Стосовно бактерицидної здатності нейтрофільних гранулоцитів як інтегрального показника функціональних можливостей, то вона прогресивно зменшувалася в міру наростання ендотоксемії. Суттєве зниження бактерицидної здатності розглядається нами як виражена якісна недостатність активованої системи нейтрофільних гранулоцитів.
У 47 потерпілих із опіковою травмою тяжкого ступеня вивчили кількість та ультраструктуру ВГЛ периферійної крові в різні терміни спостереження.
Вміст ВГЛ у периферійній крові здорових осіб складає (4,35±0,07) % всіх лейкоцитів, а їх абсолютна кількість (0,217±0,020) х 109.л-1. Відносна кількість лімфоцитів донорів склала (29,67±1,47) %, а ВГЛ серед них відповідно була (14,67±0,98) %. Отримані результати узгоджуються з даними інших досліджень (Бутенко А.К., 1987).
Проведені нами світлооптичні та морфологічні дослідження підтверджують, що на відміну від типових лімфоцитів перших трьох типів практично всі ВГЛ периферійної крові мали значну площу цитоплазми, але не всі містили гранули, останні різнились і за розмірами, на що вказують дані літератури (Herberman R., 1993; Hoogeveen Y. et al., 1992) .
Нами вперше підраховано і встановлено, що в периферійній крові здорових осіб серед лімфоцитів IV типу більше половини (63,3 %) складають ВГЛ, площа ядра яких дорівнює (88,450±1,135) мкм2, а ядерно-цитоплазматичне відношення – 2,450±0,125, що підтверджує, що вони мають значну площу цитоплазми ((40,920±1,437) мкм2). В останній знаходяться гранули, середня кількість яких складає 1,7 і які займають 4,91 % площі клітини.
Уже на 3-4 добу після опікової травми тяжкого ступеня в периферійній крові хворих у порівнянні із здоровими були виявлені кількісні та морфологічні ознаки пригнічення функціональної активності ВГЛ крові, про що свідчило зниження їх відсотку серед лейкоцитів у 2,8 рази, серед лімфоцитів – 1,9 рази, а їх абсолютна кількість серед лімфоцитів взагалі та серед лімфоцитів IV типу, зокрема, - у 1,6 рази. Площа ядра і цитоплазми ВГЛ у цей термін спостереження суттєво підвищилася, що привело до зниження ядерно-цитоплазматичного співвідношення, яке склало 2,13 проти здорових осіб 2,45.
Підтвердженням зниження функціональної активності ВГЛ крові на світлооптичному рівні було те, що в їхній цитоплазмі виявляли одну, рідко дві азурофільні гранули, переважали ВГЛ, в яких не було гранул, або множинні дрібні, пилоподібні зерна. Морфометричні дослідження показали, що середня площа гранул знизилась у 1,4 рази, кількість гранул, що припадає на одну клітину, – у 1,9 рази, а їхня питома вага у цитоплазмі ВГЛ зменшилась до 3,45 % проти норми.
Із наростанням токсемії на 11-14 добу після тяжкої опікової травми спостерігалось статистично достовірне зменшення відносного вмісту ВГЛ у 5,2 рази серед лейкоцитів і в 2,5 рази серед лімфоцитів та у 2,1 рази в абсолютній кількості серед лімфоцитів проти здорових осіб. Зниження кількості ВГЛ крові супроводжувалось вираженою відносною лімфоцитопенією, з тенденцією до зростання абсолютного вмісту лімфоцитів внаслідок значного лейкоцитозу.
Площа ядер ВГЛ знизилась із (40,924±1,437) мкм2 у здорових осіб до (37,128±1,109) мкм2, а цитоплазми відповідно з (88,454±1,135) мкм2 до (82,700±2,145) мкм2, при цьому ядерно-цитоплазматичне відношення склало 2,22.
Різко зменшилась кількість ВГЛ серед лімфоцитів IV типу у 2,5 рази проти норми, а у 4,8 рази зменшилась абсолютна кількість гранул і на одну клітину в середньому припадає 0,89 гранули за зменшення її середньої площі у 1,4 рази, а питома вага їх у цитоплазмі ВГЛ складає лише 3,50 %.
В цей період у хворих з опіковою травмою тяжкого ступеня виявлені ще більш виражені, ніж на 3-4 добу після травми, світло- та ультраструктурні зміни ВГЛ крові, переважно деструктивного характеру.
Клітини часто з нерівними, хвилястими контурами поверхні з мікроворсинками різними за величиною і довжиною: короткі тонкі або/і широкі. Специфічні гранули, в порівнянні з такими у ВГЛ здорових людей, дрібні, частина їх дегранульована. У більшості ВГЛ вакуолізована цитоплазма, джерелом вакуоль є дегранульовані зерна, гранулярна ендоплазматична сітка, мітохондрії та структурні компоненти комплексу Гольджі. Отримані дані свідчать про наростання функціональних порушень системи ВГЛ крові і, як наслідок, природного імунітету у хворих з тяжкою опіковою травмою в стадії токсемії.
У стадії септико-токсемії (21-24 доба після термічної травми тяжкого ступеня) в периферійній крові хворих відсоток ВГЛ серед лейкоцитів досягнув найнижчого рівня і був у 6 разів нижче норми, а серед лімфоцитів – у 2,2 рази відповідно, а їх абсолютна кількість серед лімфоцитів була найнижчою за весь термін спостереження.
Зниження кількості ВГЛ периферійної крові супроводжувалося вираженою відносною лімфоцитопенією, на тлі суттєвого (р<0,05) зростання абсолютної кількості лімфоцитів внаслідок найвищого лейкоцитозу (12,53±0,56) х109 л-1 проти (4,99±0,05) х109 л-1 у здорових осіб.
За світлооптичного дослідження виявляли значно більше в порівнянні із стадією токсемії ВГЛ з вакуольною дистрофією ядра і цитоплазми. В 1,5 рази зменшилась кількість ВГЛ серед лімфоцитів IV типу, середня кількість гранул в цитоплазмі ВГЛ знизилась у 4,1 рази, а питома площа гранул в цитоплазмі клітини склала всього лише 3,36 %.
За електронно-мікроскопічного дослідження виявлено подальше наростання деструктивних змін з боку субмікроскопічної організації ВГЛ крові хворих, що характеризувалось вираженою вакуолізацією цитоплазми та альтерацією ультраструктурних компонентів мітохондрій, канальців гранулярної ендоплазматичної сітки та пластинчастого комплексу Гольджі. Великі електронно-щільні (азурофільні) гранули в цитоплазмі ВГЛ крові виявлялись дуже рідко, як правило, поодинокі, переважають дрібні та дегранульовані.
Отже, отримані нами дані показують, що в усіх стадіях опікової хвороби, які супроводжуються вираженою токсемією, мали місце значні кількісні та морфологічні зміни ВГЛ (природних кілерів) крові, що вказує на значне пригнічення функціональної активності ефекторних клітин природного імунітету у тяжкоопечених хворих, найбільш виражені на 21-24 добу після травми.
Отримані результати узгоджуються з даними літератури, які вказують на пригнічення функціональної активності ВГЛ внаслідок токсемії (Koller M., 1989).
В процесі одужання і на час виписки хворих із стаціонару суттєво нижчим проти норми був показник не тільки відносного вмісту ВГЛ серед лейкоцитів, але й серед відносного і абсолютного вмісту лімфоцитів. Незважаючи на покращення світло- та морфометричних показників функціональна активність ВГЛ крові хворих після опікової травми тяжкого ступеня залишалась зниженою, про що свідчило зменшення кількості ВГЛ у 1,4 рази проти норми, хоча вміст лімфоцитів IV типу за своєю кількістю досягав показників здорових. Ці результати ще раз переконливо доводять, що кількість ВГЛ не залежить від абсолютного вмісту лімфоцитів у периферійній крові потерпілих. Середня площа азурофільних гранул та їх питома площа в цитоплазмі ВГЛ крові мали лише тенденцію до зростання.
За електронно-мікроскопічного дослідження було встановлено, що на час виписки хворих із стаціонару в периферійній крові часто виявляли ВГЛ із деструктивними змінами в цитоплазмі, дрібними і в переважній більшості дегранульованими азурофільними гранулами та паралельно-трубчастими структурами з альтерацією їх мембранних компонентів.
Морфологічну оцінку популяції лімфоцитів периферійної крові практично здорових людей провели на світлооптичному, морфометричному та електронно-мікроскопічному рівнях, що дало нам можливість виділити критерії класифікації цих клітин (табл. 1).
Необхідно звернути увагу, що І тип лімфоцитів складає лише 3,8 % і це можуть бути стовбурові клітини, які зустрічаються в крові (Чертков И.Л., Фриденштейн А.К., 1984), і клітини пам’яті та нульові лімфоцити, які не несуть маркерів Т- і В-лімфоцитів (Хаитов Р.М., 2000).
Лімфоцити IV типу, на противагу клітинам І типу, знаходяться в стані активної функціональної діяльності, однак, нашими дослідженнями встановлено, що лише 63,31 % із них є ВГЛ крові.
Лімфоцити ІІ і ІІІ типів знаходяться на шляху бласт-трансформації – шляху активної участі в імунній відповіді.
Найбільший вміст в периферійній крові лімфоцитів ІІІ типу, майже порівну – ІІ і IV типів.
Розробивши таку класифікацію лімфоцитів периферійної крові донорів, ми апробували її у хворих з опіковою травмою тяжкого ступеня для оцінки загального стану імунної системи.
На 3-4 добу після тяжкої опікової травми популяція лімфоцитів І типу збільшилась у 3,1 рази (рис. 1) із одночасним суттєвим зменшенням цитоплазми, що привело до зростання ядерно-цитоплазматичного співвідношення на 18,7 % проти норми.
Зріс вміст і лімфоцитів ІІ типу на 12,8 % проти норми (рис. 1), за майже незмінених параметрів ядра і цитоплазми.
Кількість лімфоцитів ІІІ типу зменшилась у 1,2 рази проти норми (рис. 1) за тенденції до зростання площі ядра і цитоплазми та зниження ядерно-цитоплазматичного співвідношення. Зменшилась також кількість лімфоцитів ІV типу на 17,3 % проти норми, без суттєвих змін морфометричних показників цієї групи клітин.
Таблиця 1. Робоча класифікація лімфоцитів периферійної крові здорових осіб
На 11-14 добу після тяжкої опікової травми лімфоцитів І типу в периферійній крові хворих було уже в 1,6 рази вище, ніж в нормі, і в 1,9 рази менше проти 3-4 доби спостереження. Загальна площа клітин, площа ядер та цитоплазми суттєво (р<0,001) зменшилась проти норми та попереднього терміну спостереження, що привело до зростання ядерно-цитоплазматичного співвідношення на 80,3 % проти норми та на 51,9 % проти попереднього терміну спостереження.
Перерозподіл лімфоцитів ІІ типу в загальному пулі клітин супроводжувався зменшенням їх кількості в периферійній крові і на 11-14 добу після травми був на 8,8 % нижче норми та на 19,2 % проти попереднього терміну спостереження.
Зміна кількості клітин викликає зміну параметрів лімфоцитів ІІ типу. Так, суттєво (р<0,001) проти норми та попереднього терміну зменшується площа ядер за одночасного статистично достовірного (р<0,001) зростання площі цитоплазми, що супроводжувалось зниженням ядерно-цитоплазматичного співвідношення, яке було найнижчим за весь термін спостереження і склало 3,97, що в 1,22 рази менше проти норми.
У периферійній крові хворих відбувалося подальше підвищення кількості лімфоцитів ІІІ типу і їх число зросло на 15,0 % у порівнянні із попереднім терміном спостереження.
Підвищення кількості лімфоцитів ІІІ типу поєднувалось із високостатистично достовірним (р<0,001) зменшенням площі ядра та цитоплазми цих клітин проти норми та попереднього терміну спостереження. Ядерно-цитоплазматичне співвідношення склало 4,38.
Зросла на 4,3 % кількість лімфоцитів IV типу в периферійній крові тяжкоопечених проти норми і на 26,1 % проти попереднього терміну спостереження. Лімфоцити були дрібнішими як результат високостатистично достовірного (р<0,001) зменшення площі ядра і цитоплазми, що привело до суттєвого (р<0,001) зростання ядерно-цитоплазматичного співвідношення як проти здорових осіб, так і попереднього терміну спостереження.
На 21-24 добу після тяжкої опікової травми у периферійній крові відбувається подальший перерозподіл лімфоцитів у загальному пулі клітин. Так, лімфоцити І типу досягнули найнижчої кількості за весь термін спостереження і їх число було на 52,8 % або у 2,1 рази менше, ніж у здорових, і у 6,5 рази проти 3-4 доби спостереження.
Перерозподіл лімфоцитів І типу поєднувався із зміною величини клітин, вони стають крупнішими за рахунок суттєвого (р<0,001) зростання площі ядра і цитоплазми в порівнянні із клітинами попереднього терміну спостереження, однак, залишаючись меншими за розмірами (р<0,05) проти лімфоцитів за норми та 3-4 доби після термічної травми.
Ядерно-цитоплазматичне співвідношення лімфоцитів І типу мало лише тенденцію до зниження проти попереднього терміну спостереження (11,45 відповідно проти 11,88), але залишалось суттєво (р<0,001) високим у порівнянні з нормою та на 3-4 добою після термічної травми.
У периферійній крові тяжкоопечених на 21-24 добу спостереження продовжувала зменшуватись і досягала найнижчого значення кількість лімфоцитів ІІ типу. Їх число знижувалося на 56.1 % проти показника здорових осіб, на 50,3 % проти 3-4 доби спостереження і на 38,5 % проти попереднього терміну спостереження. Лімфоцити за розмірами збільшувалися, що обумовлено суттєвим (р<0,001) підвищенням проти норми площі ядра і цитоплазми клітини. Ядерно-цитоплазматичне співвідношення стало на 14,3 % нижче за рівень здорових осіб.
Кількість лімфоцитів ІІІ типу в периферійній крові продовжувала зростати і на 21-24 добу досягала найвищого значення і була на 14,5 % вищою від кількості цих клітин у здорових осіб, на 17,3 % проти попереднього терміну спостереження і на 34,9 % відповідно 3-4 доби після травми.
Збільшення кількості лімфоцитів ІІІ типу супроводжувалося суттєвим (р<0,05) зростанням площі ядра і цитоплазми клітин у порівнянні із відповідними показниками клітин донорів та суттєвим зниженням ядерно-цитоплазматичного співвідношення проти всіх попередніх термінів спостереження.
Загальне число лімфоцитів IV типу було вище за норму на 26,6 %, на 53,0 % їх було більше, ніж на 3-4 добу після травми і всього на 21,4 % було більше у порівнянні із вмістом цих клітин на 11-14 добу після опіку. Ці клітини були крупними внаслідок суттєвого (р<0,05) зростання площі ядра та цитоплазми (р<0,001), що супроводжувалось зниженням ядерно-цитоплазматичного індексу.
На час виписки хворих із стаціонару перерозподіл лімфоцитів у загальному пулі клітин виглядав так: кількість лімфоцитів ІІ типу досягала рівня здорових осіб, число лімфоцитів ІІІ і ІV типу лише наближалось, але не досягало рівня показника донорів, а лімфоцити І типу за своєю кількістю перевищували норму.
Перерозподіл числа лімфоцитів кожного типу супроводжувався відповідними змінами з боку морфометричних параметрів клітин, які були різнонаправленими залежно від їхнього типу. Так, лімфоцити І типу були дрібнішими проти здорових осіб, внаслідок суттєвого (р<0,001) зменшення площі ядра і цитоплазми, що супроводжувалось зростанням (р<0,001) ядерно-цитоплазматичного індекса.
Характерною особливістю зміни морфометричних показників у лімфоцитів ІІ, ІІІ і ІV типів було зростання площі цитоплазми (р<0,001; р<0,05) проти норми і внаслідок цього зниження ядерно-цитоплазматичного відношення.
Таким чином, отримані результати свідчать, що протягом всього терміну спостереження відбувається перерозподіл клітин у загальному пулі лімфоцитів. У відповідь на дію термічної травми тяжкого ступеня в периферійній крові потерпілих зменшується кількість лімфоцитів І і ІІ типів внаслідок зростання в основному числа лімфоцитів ІІІ і ІV типів. Ці кількісні зміни супроводжуються відповідними змінами морфометричних показників.
Виходячи із положення, що імунна відповідь включає розпізнавання антигена, що веде за собою проліферацію та диференціацію лімфоцитів в ефекторні клітини, видалення антигена з організму, а також запам’ятовування контакту із ним, то різке зменшення в пулі лімфоцитів І і ІІ типів на 11-21 добу вказує на різке пригнічення імунної системи, а зростання лімфоцитів І типу в період виписки хворих із стаціонару є цілком логічним. В період одужання імунна система повертається до стану, що нагадує початковий. Проте в ній появляються якісно нові клітини – клітини пам’яті. Ці клітини можуть відноситись до класів В- чи Т-лімфоцитів, але морфологічно клітини пам’яті нічим не відрізняються від "наївних" "нульових" малих лімфоцитів (Чекнев С.Б., 1989).
Зростання площі цитоплазми та зниження ядерно-цитоплазматичного співвідношення свідчило про підвищення функціональної активності лімфоцитів і просування їх по шляху диференціації в напрямку ефекторних клітин (Ярилин А.А., 1999).
Проведення морфометричного аналізу лімфоцитів периферійної крові дає цілісне уявлення про стан імунної системи та її зміни в динаміці розвитку опікової хвороби тяжкого ступеня.
На основі проведених досліджень пропонуємо схему патогенетичного впливу ендотоксемії на імунну реактивність хворих, що обумовлює ризик виникнення інфекційних ускладнень у хворих з термічною травмою тяжкого ступеня. Ендотоксемія приводила до подразнення червоного кісткового мозку, що супроводжувалось, з одного боку, підвищенням кількості нейтрофільних гранулоцитів, а з іншого – появою мієло- та метамієлоцитів у кровоплині. Та ж сама ендотоксемія викликала гіперактивність мембран нейтрофільних гранулоцитів, що сприяло підвищенню їх поглинаючої здатності за різкого пригнічення бактерицидності та приводило до саморуйнування клітин. Ендотоксемія одночасно викликала не тільки різке зменшення відносного і абсолютного вмісту природних кілерів, а й альтерацію їх ультраструктурних компонентів, зокрема, азурофільних гранул, як основного чинника кіленгу. Ендотоксемія спричиняла лімфоцитопенію, особливо значно зменшувалась кількість лімфоцитів І і ІІ типів, як основних клітин імунної реактивності.
Таким чином, різке пригнічення функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів, природних кілерів та зменшення лімфоцитів І-ІІ типів обумовлюють ризик виникнення інфекційних ускладнень у хворих з тяжкою термічною травмою.
Патогенетичні ланки впливу ендотоксемії на імунну реактивність організму хворих з тяжкою термічною травмою
Ендотоксемія
нейтрофільні гранулоцити червоний кістковий лімфоцитопенія
мозок
поява мієлоцитів у периферійній крові різке зменшення різке зменшення
відносного і абсолютного лімфоцитів І і ІІ
вмісту природних кілерів типу
підвищення кількості гіперактивність мембран формування агрегатів емболів та альтерація їх
нейтрофільних ультраструктури
гранулоцитів у 1 л підвищення ініціація поліорганних уражень
периферійної крові саморуйнування (легені, серце, печінка та інші органи) зменшення кількості
і площі азурофільних
підвищення гранул
поглинаючої здатності
різке
різке пригнічення різке пригнічення пригнічення
бактерицидності функціональної активності імунореак-
тивності
ризик виникнення
інфекційних ускладнень
| 
