Библиотечный каталог авторефератов Украины

Академія медичних наук України

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова

ДІДИК ВІТАЛІЙ СТЕПАНОВИЧ

УДК 615.015.2:[613.33+615.28]:57.083.1

МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ СУМІСНОГО ВИКОРИСТАННЯ АНТИБІОТИКІВ З АНТИСЕПТИКАМИ ГРУПИ ЧЕТВЕРТИННОГО АМОНІЮ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук

Харків - 2003

       Дисертацією є рукопис.

       Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова МОЗ України і в лабораторії протимікробних засобів Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України.

Науковий керівник:   доктор медичних наук Палій Ірина Гордіївна, Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова МОЗ України, доцент кафедри поліклінічної терапії і сімейної медицини

Офіційні опоненти:   доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри імунології, алергології і ендокринології

Провідна установа:      Інститут епідеміології та інфекційних захворювань

ім. Л.В.Громашевського АМН України

       Захист відбудеться 06.11.2003 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології
ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14.

       З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14.

Автореферат розісланий 26.05.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

к.мед.н.                                                                        С.В.Бруснік

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На тлі екологічних та економічних негараздів в країні існує ціла низка проблем, пов’язаних з здоров’ям населення. Одна з найважливіших з них – інфекційні та гнійно-запальні захворювання, які за останнє десятиріччя не мають тенденції до зниження, а деякі з них (дифтерит, холера, туберкульоз, СНІД) проявляють себе ще більш агресивно (Москаленко В.Ф., 2002; Mins S., Hartmann H., 2001). З року в рік підвищується рівень захворюваності на гнійно-запальні хвороби, обумовлені умовно патогенними мікроорганізмами (Смірнов В.В., 2001). Впровадження в медичну практику антибіотиків і сульфамідів в другій половині ХХ сторіччя на початку було дуже обнадійливим, та в подальшому навіть інтенсивне розширення їх арсеналу і поява препаратів самих нових поколінь не призвели до бажаних результатів і вирішення проблеми остаточно.

Одним з основних факторів, що обумовлюють зниження ефективності хіміопрепаратів є постійно прогресуюча резистентність збудників до них
(Возіанова Ж.І., 1999; Палій І.Г., 2001; Brunton C., 2002). Формування та інтенсивне розповсюдження в умовах лікувально-профілактичних закладів антибіотикостійких мікроорганізмів пов’язано також з підвищенням їх  адаптаційних властивостей, адгезивності і вірулентності, конкурентноздатності, що підсумково надає їм селективну перевагу в мікробіоценозах (Бабич Є.М., 2000). Суттєвим негативним наслідком нераціональної хіміотерапії є відмічене вченими і практиками різке підвищення темпів еволюції патогенних і умовно-патогенних для людини мікробів, відчутна зміна етіологічної структури збудників гнійно-запальних захворювань, перш за все в сторону зниження долі облігатних патогенів і неуклінного розширення спектру та підвищення питомої ваги умовно-патогенних мікробів (Дикий І.Л., 2000; Сидорчук І.Й., 2001; Blank H., 1999). Звертають на себе увагу не тільки зміни в останнє десятиріччя етіологічної структури захворювань мікробного генезу, а й неуклінний каскадний процес заміни бактеріальних збудників гнійно-запальних процесів в напрямку “гноєтворні коки → ентеробактерії і псевдомонади → аспорогенні анаероби”. Вказане ставить нові перепони для хіміотерапевтів, поскільки збудники вищого щабелю еволюції генетично більш стійкі до протимікробних препаратів, та й арсенал факторів протидії антибіотикам, антисептикам і дезінфектантам в них значно ширший (Кучма І.Ю., Волянський А.Ю., 1999).

В умовах сучасної клініки суттєво знижуються можливості монопольного використання антибіотиків і нагально підвищується актуальність пошуку нових методологічних підступів, засобів та методів хіміотерапії. Вельми перспективним в останні десятиріччя виявився напрям в розробці антисептиків і дезінфектантів на основі катіонних детергентів – четвертинних амонієвих сполук.

Вченими Буковинської медичної академії і Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова синтезовано, досліджено і впроваджено в медичну практику цілий арсенал таких засобів – септефріл, горостен, декасан, антифунгін, палісепт, амосепт, офтадек та ін. В ряду четвертинних амонієвих сполук унікальними політропними властивостями відзначається базова хімічна структура – декаметоксин (декаметилен  - 1,10-біс / N - диметилкарбоментоксіметіламонію / дихлорид), синтезований А.І. Лопушанським і співавт. (1963), досліджений Г.К. Палієм (1967, 1973), Ю.Л. Волянським (1980), І.Г. Палій (1996), В.П. Ковальчуком (1999). Декаметоксин проявляє виражену протимікробну дію, володіє десенсибілізуючими та імуномоделюючими властивостями. Наша увага акцентована на розширені всебічного вивчення четвертинних амонієвих сполук і означення можливості їх використання сумісно з антибіотиками з метою зниження негативних наслідків хіміотерапії та попередження формування стійкості збудників інфекційних і гнійно-запальних захворювань до протимікробних засобів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відповідності з планом досліджень НДР “Дослідження ефективності антисептичних розчинів декаметоксину для профілактики та лікування інфекційних хірургічних захворювань та розробка нормативної документації для промислового виробництва антисептика” (№ державної реєстрації 0194U024652), “Розробка нових оригінальних антисептиків на основі гуанідинових сполук і декаметоксину”
(№ державної реєстрації 0194U039260), “Вивчення чутливості до сучасних антибіотиків та інших біологічних властивостей госпітальних штамів збудників гнійно-запальних захворювань” (№ державної реєстрації 0199U003170), проведених у відповідність з програмою Державного комітету науки і техніки України по науковому напрямку “Здоров’я людини”.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження є мікробіологічне обґрунтування можливості сумісного використання антибіотиків і четвертинних амонієвих сполук для попередження і лікування гнійно-запальних захворювань.

Для досягнення мети вирішені слідуючі задачі:

1. Означити ступінь впливу похідних четвертинного амонію на штами мікроорганізмів з генетичною та набутою стійкістю до антибіотиків;
2. Вивчити вплив четвертинних амонієвих сполук на процес елімінації плазмід резистентності до антибіотиків у стафілококів і кишкової палички;
3. Дослідити сумісну дію антибіотиків і похідних четвертинного амонію щодо протиімуноглобулінової, протилізоцимної і фібринолітичної активності клінічно значущих збудників гнійно-запальних захворювань;
4. В умовах експерименту оцінити ефективність сумісного використання антибіотиків і четвертинних амонієвих сполук на моделях генералізованої інфекції, обумовленої стафілококами і синьогнійною паличкою.

Об’єкт дослідження – інфекційні та гнійно-запальні захворювання.

Предмет дослідження – мікроби, антибіотики, четвертинні амонієві сполуки.

Методи дослідження: мікробіологічні (визначення щільності бактеріальних угруповань і популяцій, виділення чистих культур мікроорганізмів), біохімічні (ідентифікація бактерій), генетичні (елімінація і передача плазмід), математико-статистичні (статистична обробка результатів дослідження).

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено ступінь сумісного впливу похідних четвертинного амонію і антибіотиків на штами мікроорганізмів з генетичною і набутою стійкістю до хіміопрепаратів. Доведено, що антисептики групи четвертинного амонію в низьких концентраціях інгібують процес елімінації R-, Ent- i Hly-плазмід і суттєво перешкоджають їх передачу при генетичних рекомбінаціях в мікробній популяції. Означені параметри впливу антисептиків в комбінаціях з антибіотиками на імуносупресивні властивості (протиімуноглобулінова, антилізоцимна і фібринолітична дія) деяких збудників гнійно-запальних захворювань.

Доведено синергідну дію суббактеристатичних доз похідних четвертинного амонію і антибіотиків при генералізованій інфекції тварин, обумовлених St.aureus і Ps.aeruginosa.

Практичне значення одержаних результатів. Результати експерименту дозволяють рекомендувати подальше вивчення і використання сумісно антисептики групи четвертинного амонію з антибіотиками основних груп, які широко застосовуються в сучасній клінічній практиці. Вказане дозволяє значно понизити терапевтичну дозу антибіотиків, що корисно з позицій суттєвого пониження негативного їх впливу по параметрам токсичності, кумуляції і гіперсенсибілізації організму. Похідні четвертинного амонію в низьких концентраціях значно знижують інтенсивність формування резистентності мікроорганізмів до антибіотиків та суттєво обмежують передачу детермінант стійкості до хіміотерапевтичних засобів в мікробній популяції. Синергідна дія похідних четвертинного амонію і антибіотиків не залежить від типу резистентності. Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів в вищих медичних учбових закладах і в системі післядипломної освіти (Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова, Харківський державний медичний університет, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Габричевського, Харківська державна медична академія післядипломної освіти). Розроблені та затверджені МОЗ України методичні рекомендації “Мікробіологічна діагностика рахнельозів (захворювань, спричинених Rahnella aguafilis)”, Харків, 1997; “Лабораторна діагностика гнійно-запальних захворювань, обумовлених аспорогенними анаеробними мікроорганізмами”, Харків, 2000; “Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій”, Харків, 2000.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто визначено спектр та рівні протимікробної дії антибіотиків і антисептиків групи четвертинного амонію щодо збудників гнійно-запальних захворювань бронхо-легеневої системи, вилучених від хворих на ХОЗЛ в лікувально-профілактичних закладах м. Житомира. Самостійно виконані дослідження впливу суббактеріостатичних доз антисептиків на процес елімінації плазмід антибіотикорезистентності тест-штамів E.coli та можливість їх передачі шляхом кон’югації. Особисто проведено експерименти щодо визначення швидкості формування антибіотикорезистентності в умовах in vitro у стафілококів і псевдомонад при попередній їх обробці похідними четвертинного амонію в різних дозах. Сумісно з В.В.Казмірчуком (лабораторія протимікробних засобів Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України) визначено вплив декаметоксину, хлоргексидину, фогуциду, етонію, тіонію і мірамістину на протиімуноглобулінову, антилізоцимну і фібринолітичну активність S.aureus і Ps.aeruginosa. Самостійно проведено експериментальне вивчення сумісної дії антибіотиків і антисептиків на моделях генералізованої стафілококової і синьогнійної інфекції білих мишей.

Апробація результатів проведених досліджень. Результати досліджень оприлюднено на симпозіумі “Синтез, експериментальне вивчення та клінічне застосування четвертинних амонієвих сполук” (Чернівці, 1995), на міжнародних конференціях “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 2001), “Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антисептиків, антибіотиків” (Вінниця, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Комп’ютерна медицина - 2003” (Харків, 2003) та засіданнях Житомирського обласного товариства мікробіологів, епідеміологів і паразитологів (Житомир, 2001, 2002).

Публікації. Результати дисертації відображено в 6 статтях у наукових журналах, рекомендованих ВАК України щодо публікацій результатів досліджень пошукувачами наукового ступеню.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 134 сторінках машинопису, вміщує в собі вступ, огляд літератури, чотири розділи власних досліджень, аналіз одержаних результатів і їх обговорення, висновки. Список літератури нараховує 78 вітчизняних та 112 зарубіжних джерел. Робота ілюстрована 32 таблицями та 6 малюнками.

Основний зміст роботи

У вступі проаналізовано стан проблеми боротьби з інфекційними та гнійно-запальними захворюваннями мікробного генезу, означено неухильне зниження потенціалу хіміотерапевтичних препаратів на тлі інтенсивного формування стійкості патогенів до них. Підкреслено відсутність системи мікробіологічного моніторингу та ефективної служби інфекційного контролю в лікувально-профілактичних закладах, що призводить до порушення основних принципів раціонального використання антибіотиків, сульфамідів, антисептиків тощо. Викладено сутність мети та наукових завдань, які розв’язувались при виконанні дисертаційної роботи, обґрунтовано актуальність її теми, визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведено дані щодо апробації результатів дослідження, вказано обсяг і структуру дисертації.

У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено проблему гнійно-запальних захворювань в сучасній клініці та можливі підступи до її вирішення. Акцентовано увагу на раціональність сумісного використання в медичній практиці антибіотиків і антисептиків, вказано на шляхи подолання стійкості збудників гнійно-запальних хвороб щодо протимікробних засобів. Окрім того, висвітлено деякі питання механізму протимікробної дії антисептиків групи четвертинного амонію, які взято в якості предмету дослідження.

Матеріали, методи і обсяг досліджень наведено у другому розділі. В роботі використано антисептики групи четвертинного амонію (хлоргексидин, фогуцид, декаметоксин, етоній, тіоній, мірамістин) та антибіотики різних груп і різних поколінь. В якості мікробних тест-культур досліджено референтні штами, депоновані в Харківській філії Національного музею патогенних мікроорганізмів (Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України), а також клінічні штами, вилучені в лікувально-профілактичних закладах м. Житомира від хворих на хронічні обструктивні захворювання легень (ХОЗЛ). Всього в роботі використано 64 музейних штамів тест-мікробів, вилучено і охарактеризовано 479 різних щодо групової, родинної і родової приналежності клінічних штамів збудників гнійно-запальних процесів. Штами мікроорганізмів з означеними детермінантами антибіотикорезистентності одержано з Інституту антибіотиків РАМН (Росія). Референтні штами використаних тест-мікробів характеризувались генетичною стабільністю за основними ознаками, в тому числі і за рівнями чутливості до протимікробних засобів.

Живильні середовища для вилучення, ідентифікації і характеристики мікроорганізмів використовували в більшості випадків відповідно методичним рекомендаціям та згідно особливостей культивування того чи іншого мікробу. Вилучення аспорогенних анаеробних мікробів та їх дослідження виконано у відповідності розробленим за нашою участю методичних рекомендацій “Лабораторна діагностика гнійно-запальних захворювань, обумовлених аспорогенними анаеробними мікроорганізмами” (Харків, 2002), рахнел – “Мікробіологічна діагностика рахнельозів (захворювань, спричинених Rahnella aquatilis)”, Харків, 1997, ентеробактерій – “Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій” (Харків, 2000).

Протимікробну активність досліджених антибіотиків і антисептиків щодо мікроорганізмів 4, 6, 17, 18, 19, 20 і 30 груп (згідно Означника Берджі, ІХ видання, 1997), двох родин і 38 родів, а також дріжджеподібних грибів роду Candida вивчено відповідно методології і методів, які відповідають вимогам Державного Науково-експертного центру лікарських засобів МОЗ України (Київ, 1995) при експериментальному вивченні протимікробних препаратів. Визначення чутливості мікроорганізмів до антисептиків здійснено за методикою Красильникова О.П. (1995), до антибіотиків – згідно наказу МЗ СРСР №150 “Про уніфікацію методів визначення чутливості мікроорганізмів до хіміотерапевтичних препаратів” (1985). Вивчення поєднувальної дії антибіотиків і  антисептиків кількісним методом проводили з використанням мікробної нагрузки lg9 КУО/мл відповідно рекомендаціям В.С.Зуєвої (1971). Дослідження елімінуючого впливу антисептиків на R, Hly- і Ent- плазміди проведено шляхом культивування мікроорганізмів на селективних і звичайних щільних живильних середовищах з використанням суббактеріостатичних доз препаратів. Вплив антисептиків на трансмісивність плазмід в кон’югації та процес їх передачі від донора реципієнту вивчали при різних варіантах оброблення антисептиком в суббактеріостатичній дозі субстратів кон’югації (оброблений донор-інтактний реципієнт, інтактний донор – оброблений реципієнт, оброблені донор і реципієнт, додавання антисептика в кон’югаційну суміш). Вплив протимікробних препаратів на показники фагоцитарної активності (фагоцитарне число, фагоцитарний індекс) визначено візуальним методом за Нестеровою І.В. (1989). Оцінка ступеню бактерицидності нейтрофілів проведена шляхом відновлення нітросинього тетразолія (НСТ-тест) (ParK, 1992) та визначення активності мієлопероксидази (Sato, 1997). Дослідження активності лізоциму сироватки та бронхіального секрету проводили за загальноприйнятою методикою Бухаріна О.В. (1993), антилізоцимну активність мікроорганізмів визначали згідно рекомендацій Білозерського В.І. (2000) з використанням гельбактерійного середовища. Дослідження ступеня нейтралізації протиімуноглобулінової активності мікробів антисептиками проводили за методикою Даценко М.Ф. та співавт. (2001), модифікованої нами. Генералізовану інфекцію відтворювали шляхом внутрішньочеревного зараження білих мишей добовою агаровою культурою стафілококів і псевдомонад в суміші з “голодним агаром”.

В роботі використано 684 білих мишей, 85 щурів, 60 морських свинок. В процесі роботи з лабораторними тваринами керувались “Європейською конвенцією про захист хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою” (Страсбург, 1980) та Міжнародними рекомендаціями щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням тварин (Хроніка ВООЗ, 1985).

Для об’єктивного судження про ступінь вірогідності отриманих результатів дослідження використано варіаційно-статистичний метод аналізу за допомогою персонального комп’ютера IBM 586 та прикладних програм з електронними таблицями Microsoft Excel. Статистичну обробку матеріалу здійснювали методами варіаційної статистики, а також використовуючи метод відмінності за допомогою t-критерію Ст’юдента, кореляційного та дисперсного аналізу згідно пакету “Statistica”.

В третьому розділі охарактеризовано мікробіоценотичні варіації біотопу бронхо-легеневої системи у хворих на хронічні обструктивні захворювання легень (ХОЗЛ). Означено питому вагу бактерій, вегетуючих в верхніх дихальних шляхах хворих на ХОЗЛ, перебуваючих на стаціонарному або амбулаторному лікуванні в медичних закладах Житомирської області за період 1996-2002 рр. (табл. 1). Найбільш часто вилучались бактерії роду Staphylococcus (13,9 %), Streptococcus (9,39 %), Pseudomonas (8,77 %), Klebsiella (7,1 %), Haemophilus (6,47 %). Питома вага неспорових анаеробів (бактероїди, пептококи, пептострептококи, фузобактерії і превотели) в сумі складала 11,49 % від загальної кількості збудників гнійно-запальних процесів. Слід акцентувати, що в стадії хронізації гнійно-запального процесу у хворих на ХОЗЛ нерідко вилучаються бактерії родів Listeria i Nеisseria (по 2,3 %), Rahnella (1,67 %), Pragia (0,42 %), Mycoplasma (3,55 %). В загальному масиві ізольованих клінічних штамів мікроорганізмів лише 11,6 % складали монокультури, значна більшість патогенів проявилась в асоціаціях.

Охарактеризовано біологічні властивості та прояв факторів патогенності найбільш клінічно значущих представників мікробіоценозу системи дихання, означено окремо їх чутливість до широко використовуємих в сучасній клініці антибіотиків і антисептиків групи четвертинного амонію. В дослідах in vitro доведено, що в поєднанні з антисептиками групи четвертинного амонію (в суббактеріостатичній дозі) активність антибіотиків щодо клінічних штамів стафілококу, кишкової палички, псевдомонад і кандід підвищувалась в 2 – 7 разів.

Визначено вплив антисептиків групи четвертинного амонію на процес

Таблиця 1

Питома вага бактерій, вилучених з бронхо-легеневої системи хворих на ХОЗЛ в лікувально-профілактичних закладах Житомирської області за період 1996-2002рр.

       Продовження табл. 1

формування in vitro стійкості до антибіотиків у стафілококів і синьогнійних  паличок при багатократних пасажах на живильних середовищах з помірно зростаючою концентрацією антибіотику. Доведено, що декаметоксин, фогуцид і мірамістин при їх наявності в щільному поживному середовищі в дозах 0,05-0,2 мкг/мл (для стафілококів) і 1,0-5,0 мкг/мл (для псевдомонад) уповільнюють в 2-3 рази процес формування резистентності щодо беталактамів, аміноглікозидів, тетрацикліну і цефалоспоринів.

В четвертому розділі проведено мікробіологічне обґрунтування сумісного використання антибіотиків і антисептиків групи четвертинного амонію. Означено вплив похідних четвертинного амонію на процес елімінації плазмід антибіотикорезистентності. Вірогідно в дозах 20,5-50,0 мкг/мл елімінують Hly-плазміди E.coli KS-112-Hly (Km) фогуцид, декаметоксин і етоній. В аналогічних умовах досліду не відмічено елімінуючої Hly-плазмід дії у хлоргексидина, тіонія і мірамістина. Ступінь впливу похідних четвертинного амонію на передавання Hly-плазміди в популяції мікроорганізмів досліджено шляхом кон’югації в різних варіантах експерименту. Вихід рекомбінантів при обробленні антисептиками в суббактеріостатичній концентрації мікроба-донора вірогідно знижений при дії декаметоксину, етонію і тіонію в дозі 10,0-20,0 мкг/мл; в умовах оброблення антисептиком реципіента - E.coli 200 PS всі досліджувані антисептики в дозі 20,0 мкг/мл вірогідно інгібували процес передавання Hly-плазмід в процесі кон’югації. При умові оброблення антисептиком кон’югаційної суміші фогуцид, декаметоксин , етоній і тіоній в дозі 20,0 мкг/мл суттєво знижували вихід рекомбінантів з наявністю Hly-плазміди. Одержані результати дослідів доповнені при вивченні впливу похідних четвертинного амонію на елімінацію Ent-плазмід, що обумовлюють ентеротоксичність патогенів родини Enterobacteriaceae. При використанні референтного штаму E.coli pAP 10-2:: Tng, міченого транспозоном Tng (детермінація стійкості до левоміцетину), доведена виражена елімінуюча Ent-плазміди  дія фогуцида, декаметоксина, етонія (табл. 2). Хлоргексидин, тіоній і мірамістин аналогічною дією не володіють. Процес передавання Ent-плазмід при кон’югації з високим ступенем вірогідності інгібує декаметоксин (доза 10,0-20,0 мкг/мл) в різних варіантах досліду (при обробленні як донора і реципієнта окремо, так і кон’югаційної суміші). Етоній і тіоній діють аналогічно в концентрації 20,0 мкг/мл. Хлоргексидин, фогуцид і мірамістин в такій же дозі суттєво знижують вихід рекомбінантів при обробленні мікроба-реципієнта і кон’югаційної суміші. Слід акцентувати увагу, що похідні четвертинного амонію пригнічували процес кон’югації та передачі Hly- та Ent- плазмід, перш за все, при попередньому обробленні мікроба-реципієнта. Мікроб-донор проявляє значно меншу чутливість до антисептиків групи четвертинного амонію, за виключенням декаметоксину.

По аналогії проведені експерименти для визначення ступеню впливу похідних четвертинного амонію на елімінацію R-плазмід та їх передавання в процесі кон’югації. В якості мікробів-донорів використано E.coli 5-3 Rdrd (з детермінантами Str, Chl, Amp) та E.coli 1-5-3-R1-16 (з детермінантою Km ). Декаметоксин і фогуцид вірогідно інгібували процес елімінації R-плазмід, дія хлорексидину, етонію, тіонію та мірамістину призводила до появи поодиноких Km- чутливих колоній кишкової палички, що на наш погляд, обумовлено спонтанною втратою нею R-плазмід. З використанням в якості реципієнта E.coli С 600 (Str) в процесі кон’югації визначено суттєвий інгібуючий вплив на процес передавання R-плазмід усіх досліджуваних антисептиків при умові одночасного оброблення тест-мікробів донорів і реципієнтів, а також кон’югаційної суміші. При обробці тільки мікроба-донора знижували вихід рекомбінантів лише декаметоксин і мірамістин.

Одержані результати свідчать про досить виражений вплив антисептиків групи четвертинного амонію на процес елімінації і передавання плазмід антибіотикорезистентності. До речі, в літературі не представлені дані щодо аналогічної дії антибіотиків.

В різних варіантах досліду вивчено ступінь нейтралізації протиімуноглобулінової активності деяких збудників гнійно-запальних захворювань досліджуваними антисептиками в суббактеріостатичних дозах. В попередніх експериментах показано, що в динаміці клінічного перебігу ХОЗЛ суттєво змінювалися рівні імуноглобулінів сироватки крові і бронхіального секрету в напрямку вірогідного зниження Ig A, Ig G, Slg A та деякого підвищення рівнів Ig M i IgE. Одержані дані вельми цікаві з позиції можливого зв’язку між змінами рівнів імуноглобулінів сироватки крові і бронхіального секрету та припустимого етіологічного фактору – мікроорганізмів, які частіше за других викликають і/або
Таблиця 2

Ступінь впливу похідних четвертинного амонію на процес елімінації Ent-плазмід

тест-мікробу E.colі pAP 10-2 :: Tng

Примітка: Р1 – показує, чи є розходження в результуючих значеннях між конкретним антисептиком і контролем, статистично значимими; Р – визначено при порівнянні визначення М±m для одного антисептика.

підтримують патологічний процес в бронхо-легеневій системі. Серед широкого кола таких патогенів нами означені, перш за все, стафілококи і синьогнійна паличка, згідно даних літератури, які здатні проявляли виражену протиімуноглобулінову активність (Вороніна Л.Г., 1997; Benedi V. et al., 1998). В дослідах підтверджена суттєва інактивація Ig A, Ig G та Slg A клінічно значущими штамами стафілококів і псевдомонад, суттєво не впливаючих при цьому на рівні Ig М. В послідуючих експериментах показано, що фогуцид, декаметоксин і мірамістин в суббактеріостатичних дозах нейтралізують протиімуноглобулінову активність стафілококів і синьогнійної палички в сироватці крові і бронхіальному секреті. Етоній інактивує протиімуноглобулінову дію патогенів лише в сироватці крові, тіоній і хлоргексидин в аналогічних умовах досліду такими властивостями не володіють.

Вивчено ступінь знешкодження протилізоцимної дії збудників гнійно-запальних захворювань похідними четвертинного амонію. В дозах 0,1-0,5 мкг/мл і експозиції 10 хвилин всі досліджені препарати фактично в повному об’ємі нейтралізували протилізоцимну активність грампозитивних мікроорганізмів (стафілококи, стрептококи, лістерії, пептококи і пептострептококи), в дозах 0,2-10,0 мкг/мл при такій же експозиції – суттєво інгібували протилізоцимну дію і грамнегативних бактерій (псевдомонади, бактероїди, клебсієли, протеї, рахнели).

Взаємозв’язок фібринолітичної активності і вірулентності збудників класичних інфекційних хвороб (чума, туляремія, черевний тиф, дифтерит тощо) доведено давно. Та щодо кореляції цих ознак у бактерій з умовною патогенністю, які превалюють в сучасній клініці в якості збудників гнійно-запальних захворювань, дані відривчасті і з протиріччями. Здатність розчинювати фібрин крові мікроорганізмами використовується бактеріологами в більшості випадків лише з метою їх диференціації. Нами означено ступінь фібринолізису клінічно значущими стафілококами, стрептококами, клебсієлами, лістеріями, синьогнійною паличкою, неспоровими анаеробами і дріжджеподібними грибами роду Candida. Фактично всі вони володіли вказаною властивістю, хоча в різній мірі. Найбільш виражена фібринолітична активність виявлена у стрептококів пневмонії, клебсієл, лістерій і псевдомонад, а також у пептострептококів. Всі досліджені похідні четвертинного амонію в суббактеріостатичних дозах вірогідно інгібували фібринолітичну дію взятих в дослід тест-мікробів (на 29-42 % в порівнянні з вихідними даними).

       В п’ятому розділі подано результати профілактичної і лікувальної ефективності антибіотиків і похідних четвертинного амонію (в суббактеріостатичній концентрації) при генералізованій стафілококовій і синьогнійній інфекції білих мишей. Враховуючи показники виживаємості і сумарної довготривалості життя тварин в дослідних і контрольних групах відмічено достатньо високий синергідний ефект протимікробних засобів різної спрямованості по характеру та механізму дії. Сумісне використання антибіотиків і антисептиків (в суббактеріостатичній дозі) в різних варіантах досліду порівняно з контролем (лише антибіотики) дозволило при одному й тому ж терапевтичному і профілактичному ефектах значно (майже в 2 рази) понизити дозу антибіотиків беталактамного ряду, тетрацикліну (при стафілококовій інфекції), аміноглікозидів і цефалоспоринів (при псевдомонозі).

       У розділі аналізу і узагальнення результатів дослідження в стислій формі наведено підсумки проведених експериментів, результати реалізації поставленої мети і задач дисертаційної роботи.

Висновки

1. В мікробіоценозах бронхо-легеневої системи хворих на хронічні обструктивні захворювання легень вельми широко представлені аеробні, факультативно і облігатно анаеробні бактерії, а також дріжджеподібні гриби. Найбільш часто серед аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів зустрічались збудники родів Staphylococcus (13,9 %), Streptococcus (9,39 %), Pseudomonas (8,77 %), Klebsiella (7,1 %), Haemophilus (6,47 %), серед облігатних анаеробів – бактерії родів Bacteroides (3,76 %), Peptostreptococcus (2,92 %), Fusobacterium (2,3 %), Peptococcus (1,8 %). Дріжджеподібні гриби роду Candida вилучені в 11,2 % випадків. Видовий склад  умовно-патогенних бактерій змінювався залежно від стадії клінічного перебігу ХОЗЛ, обумовлених в 87,4 % випадків мікробними асоціаціями.
2. Значна кількість умовно-патогенних збудників гнійно-запальних захворювань органів дихання виявилась резистентною до антибіотиків, які нині широко використовуються в пульмонологічній практиці. Аеробні і факультативно анаеробні бактерії виявились вельми стійкими щодо тетрацикліну, ерітроміцину, канаміцину, беталактамів, лінкоміцину і олеандоміцину; облігатні анаероби – щодо аміноглікозидів і лінкоміцину. Протимікробна дія антисептиків групи четвертинного амонію нерівнозначна, в аналогічних умовах дослідів більш активними виявились декаметоксин, фогуцид і етоній.
3. Більшість досліджених антибіотиків в поєднанні з антисептиками групи четвертинного амонію (суббактеріостатичні дози) в дослідах in vitro проявила більш виражену (в 2-7 разів) протимікробну активність щодо клінічних штамів стафілококу, кишкової палички, псевдомонад і кандід.
4. При багаторазових пасажах стафілококу і синьогнійної палички на щільних живильних середовищах з зростаючою концентрацією антибіотику та вміщуючих декаметоксин, фогуцид або мірамістин в дозах 0,05-0,2 мкг/мл (для стафілококів) і 1,0-5,0 мкг/мл (для псевдомонад) процес формування резистентності щодо беталактамів, аміноглікозидів, тетрацикліну і цефалоспоринів уповільнюється в 2-3 рази.
5. Антисептики групи четвертинного амонію в суббактеріостатичних дозах суттєво інгібують процес елімінації R-, Ent- і Hly-плазмід резистентності та їх передачі шляхом кон’югації. Вказане реалізує один з механізмів пригнічення селекції патогенних та стійких до хіміотерапевтичних засобів мікроорганізмів і подальшого розширення їх ареалу.
6. Значна кількість видів умовно-патогенних збудників гнійно-запальних процесів спроможна проявляти фібринолітичну, протиімуноглобулінову і антилізоцимну активність. Антисептики групи четвертинного амонію в концентрації 0,05 – 10,0 мкг/мл (в залежності від виду мікроба) вірогідно інгібують процеси прояву фібринолізису, протиімуноглобулінової і антилізоцимної дії мікроорганізмів.
7. На моделях генералізованої стафілококової і синьогнійної інфекції доведено достатньо високу профілактичну і терапевтичну активність антибіотиків сумісно з антисептиками групи четвертинного амонію, використаних в суббактеріостатичній концентрації. Вказане дозволило суттєво (майже на половину) понизити дозу антибіотиків при збереженні в повній мірі його ефективності. Комплексне використання антибіотиків і антисептиків групи четвертинного амонію, володіючих різнонаправленими механізмами протимікробної дії, вельми перспективно для медичної практики, дозволяэ успішно протидіяти процесу інтенсивного формування антибіотикорезис-тентності у клінічно значущих патогенів, а також в значній мірі попереджувати негативний вплив хіміотерапевтичних засобів на організм людини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мальцев В.И., Дидык В.С., Шатило В.И., Головко В.А, Распространенность некоторых заболеваний внутренних органов среди населения Житомирской области // Врачебное дело. – 1991. - №6. – С.109-110.
2. Дідик В.С.Біологічні властивості та чутливість до протимікробних препаратів збудників гнійно-септичних інфекційних захворювань // Вісник Сумського державного університету. – 2001. - № 11(32). – С.185 – 188.
3. Деркач С.А., Носатенко А.І., Дідик В.С., Копча В.С., Стольникова О.В., Драч М.І.. Фактори патогенності ентеробактерій, виділених від хворих на змішані кишкові інфекції // Інфекційні хвороби. – 2002. - №2. – С. 41 – 43.
4. Дідик В.С., Липовська В.В., Журавльова І.В., Савінова О.М., Чернявський В.І.. Біологічні властивості патогенних ентеробактерій, циркулюючих у північно-східному регіоні України (1996 – 2000рр.) // Вісник Вінницького Державного медичного університету. – 2002. - № 6(2). – С.305 – 308.
5. Деркач С.А., Копча В.С., Дідик В.С., Носатенко А.І., Волянська Л.А., Крилова І.А., Пасічник Т.О., Стольникова О.В., Драч М.І., Марченко В.Ф., Габишева Л.С., Вовк Т.Г., Строгая О.І.. Антибіотикорезистентність збудників гострих кишкових інфекцій, виділених у східному й західному регіонах України // Інфекційні хвороби. – 2002. - № 3. – С. 22 – 26.
6. Бабіч Є.М., Дідик В.С., Елісєєва І.В., Кучма І.Ю., Пасічник Т.О., Драч М.І., Толстанов О.К., Скляр Н.І., Клімов О.І., Білозерський В.І.. Генетичні основи формування поліаглютинабільних штамів менінгококу // Вісник Буковинської медичної академії. – 2002. - №3. – С. 151 - 155

АНОТАЦІЯ

Дідик В.С. Мікробіологічне обґрунтування сумісного використання антибіотиків з антисептиками групи четвертинного амонію – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова, 2003.

Дисертацію присвячено мікробіологічному обґрунтуванню сумісного застосування антибіотиків і антисептиків при гнійно-запальних захворюваннях бронхо-легеневої системи. Означено питому вагу умовно-патогенних бактерій в мікробіоценозах хворих на хронічні обструктивні захворювання легень, досліджено їх біологічні властивості, фактори патогенності та чутливість щодо протимікробних засобів. Доведено інгібуючий вплив похідних четвертинного амонію на процес елімінації R, Ent- і Hly-плазмід мікроорганізмів та їх фібринолітичну, протиімуноглобулінову і антилізоцимну активність. В дослідах in vitro встановлено значне заповільнення процесу формування антибіотикорезистентності грампозитивних і грамнегативних бактерій при наявності похідних четвертинного амонію в суббактеріостатичних дозах.

На моделях генералізованої стафілококової і псевдомонозної інфекції в експериментах на тваринах доведено високу профілактичну і терапевтичну ефективність сумісного використання антибіотиків і антисептиків.

Ключові слова: хронічні обструктивні захворювання легень, мікроорганізми, антибіотики, антисептики, тести ідентифікації, живильні середовища.

АННОТАЦИЯ

Дидык В.С. Микробиологическое обоснование совместного использования антибиотиков с антисептиками группы четвертичного аммония – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук за специальностью 03.00.07 – микробиология. – Винницкий национальный медицинский университет им. М.И.Пирогова, 2003.

Диссертация посвящена микробиологическому обоснованию совместного применения антибиотиков и антисептиков при гнойно-воспалительных заболеваниях бронхо-легочной системы. Обозначен удельный вес условно-патогенных бактерий в микробиоценозах больных хроническими обструктивными заболеваниями легких, исследованы их биологические свойства, факторы патогенности и чувствительность к противомикробным средствам.

В опытах in vitro доказано, что антибиотики основных групп, которые широко используются в современной пульмонологии, в присутствии суббактериостатических доз антисептиков группы четвертичного аммония существенно повышают свою активность. При многократных пассажах на питательных средах, с повышением концентрации антибиотиков и в присутствии суббактериостатических доз производных четвертичного аммония происходит значительное замедление процесса формирования антибиотикоустойчивости стафилококков, кишечных палочек, псевдомонад и кандид. Доказано ингибирующее действие исследуемых антисептиков на элиминацию R, Ent- и Hly-плазмид микроорганизмов, а также скорость их передачи при конъюгации. Антисептики группы четвертичного аммония в значительной мере нейтрализовали фибринолитическую, противоимму­ноглобулиновую и антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов. На моделях генерализованной стафилококковой и синегнойной инфекции белых мышей показана достаточно высокая профилактическая и лечебная эффективность антибиотиков, используемых совместно с производными четвертичного аммония в низких концентрациях. Указанное позволило использовать половинные дозы антибиотиков при сохранении достаточного терапевтического эффекта. Комплексное применение антибиотиков и антисептиков группы четвертичного аммония, обладающих разнонаправленными механизмами антимикробного действия, весьма перспективно для практики химиотерапии, поскольку позволяет успешно препятствовать процессу формирования антибиотикорезистентности клинически значимых патогенов и интенсивного расширения их ареала, а также существенно снижать негативное воздействие антибиотиков на организм человека.

Ключевые слова: хронические обструктивные заболевания легких, микроорганизмы, антибиотики, антисептики, тесты идентификации, питательные среды.

THE SUMMARY

Didyk V.S. A microbiological substantiation of sharing antibiotics with antiseptics of 4-ed ammonium group . - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences behind a specialty 03.00.07 - microbiology. - Vinnitsa national medical university named after M.I. Pirogov, 2003.

The dissertation is devoted to a microbiological substantiation of joint application of antibiotics and antiseptics at purulent - inflammatory diseases of respiratory system. The densities conditionally – of pathogenic bacteriae in microbiocenosis of the patients with chronic lung disease is designated, their biological properties, pathogenesis factors and sensitivity for antimicrobial of means are investigated.

Is proved inhibited influence derivative 4-ed ammonium derivates on process of elimination R, Ent- and H-plasmides of microorganisms and them fibrinolytical, antiimmunoglobulin and antilizocym activity. In experiences in vitro the significant delay of process of formation antibioticoresistance grampositive and gramnegative bacteriae is established at presence ammonium derivates in subbacteriostatic dozes.

On models generalization of staphylococcus and pseudomonas infection in experiments on animals is proved high preventive and therapeutic efficiency of sharing of antibiotics and antiseptics.

Key words: chronic obstructive lung disease, microorganisms, antibiotics, antiseptic, tests of identification.