Библиотечный каталог авторефератов Украины

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н.КАРАЗІНА

ГОРДІЄНКО ОЛЬГА ІВАНІВНА

УДК: 577.35

МЕХАНІЗМИ ПАСИВНОЇ ПРОНИКНОСТІ ДО НЕЕЛЕКТРОЛІТІВ ТА ІНДЕКС СФЕРИЧНОСТІ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ

03.00.02-біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор

Курик Михайло Васильович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу (м. Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор

Покровський Валерій Олександрович, Інститут хімії поверхні НАН України, заступник директора з наукової роботи (м. Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор

Мартиненко Олександр Віталійович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри (м. Харків).

Провідна установа

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біофізики (м. Київ).

Захист відбудеться “18” березня 2005 року о 15-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “14” лютого 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проникність плазматичних мембран є важливим параметром, що визначає можливість життєдіяльності клітин. Проникання метаболітів крізь мембрану забезпечується, зазвичай, спеціальними системами активного транспорту. Пасивна ж проникність клітинної мембрани визначається її загальною структурою - властивостями окремих компонентів, що входять до її складу, а також системою взаємодій між ними. Таким чином, вивчення проникності мембран до різних речовин надає додаткову інформацію щодо її будови та властивостей в тих чи інших умовах.

Термодинамічний підхід до описання та визначення однієї з головних властивостей мембран, її проникності, розвивався незалежно від конкретних уявлень про структуру мембран. Ключовою роботою в цьому напрямку стала робота Kedem, Katchalsky (1958). Виходячи з фундаментальних принципів термодинаміки необоротних процесів у лінійному наближенні автори отримали узагальнені рівняння, які були зручними для подальшого їх використання в аналізі даних щодо проникності біологічних мембран. З цього часу всі дослідники, що звертались до проблеми вимірювання коефіцієнтів проникності, так чи інакше використовували результати цієї роботи (Paganelli C.V.,Solomon A.K., 1957; Sha'afi R.I. et al., 1970; Wessels J.M.C., Pals D.T.F., 1973; Solomon A.K. et al., 1986; Toon M.R., Solomon A.K., 1996). Однак, слід зазначити, що при цьому не завжди враховувались ті граничні умови та спрощення, які були використані для отримання даних термодинамічних рівнянь.

Кількісне визначення коефіцієнтів проникності біологічних мембран до різних речовин потребує адекватних методів. В роботі (Mazur P., Miller R.H., 1976) описуються три основні експериментальні підходи до визначення коефіцієнтів проникності: (1) визначення зміни клітинного об’єму; (2) вимірювання кількості проникаючої речовини в клітинах хімічним або ізотопним методом; (3) вимірювання часу, необхідного для гемолізу в гіпотонічному за непроникаючою речовиною середовищі. В першому методі експериментально визначають зміну об’єму клітин при їх вміщенні в розчин проникаючої речовини. Для клітин, що їх мають дослідники у великих кількостях (наприклад еритроцити), часто застосовують метод розсіювання світла суспензією клітин. Дослідження у випадку еритроцитів ускладнюються у зв’язку з високим значенням проникності еритроцитів для води. Solomon із співавторами застосував так звану систему “зупиненого потоку” і впродовж багатьох років успішно використовував її для вивчення параметрів проникності еритроцитів (Paganelli C.V.,Solomon A.K., 1957; Solomon A.K et al., 1986; Toon M.R., Solomon A.K., 1996). Розроблені цією групою вчених методи потребують застосування складної апаратури та апроксимації експериментальних кривих різними функціями, оскільки аналітичного рішення рівнянь Kedem, Katchalsky для випадків, що їх використовують автори, отримати не вдається. В роботі Macey R.I., Karan D.M. (1993) ці методи були піддані критиці. Автори показали, що результати аналізу залежать від виду апроксимуючої зміну об’єму функції, а також від довжини інтервалу, що використовується для апроксимації.

Вимірювання коефіцієнтів проникності другим методом, тобто за допомогою радіоактивно мічених речовин, є доволі складним (Garrick R.A, 1983). Проникність мембран визначається шляхом розділення дифузії крізь інтактні плазматичні мембрани спакованих клітин та інших компонентів. Дифузію крізь ці компоненти визначають окремо для позаклітинного (D1) і внутрішньоклітинного середовища (D2). Чисельну величину проникності D отримують з експериментально визначених D1 і D2. Описаний метод надає можливість вимірювати дифузійні коефіцієнти проникності. Але, він є дуже трудомістким, а розрахунок коефіцієнтів передбачає ряд наближень та спрощень, що може привести до систематичних помилок у їх визначенні.

При визначенні коефіцієнтів проникності третім способом (Mazur P., Miller R.H. (1976) визначається час 50%-го гемолізу у водному розчині проникаючої речовини, для якої визначається проникність. Коефіцієнти проникності визначають порівнянням експериментальних кривих гемолізу з теоретичним ходом зміни об’єму еритроцита у часі за рівняннями Kedem, Katchalsky при різних значеннях коефіцієнта проникності. Значення коефіцієнта проникності, при якому розрахований час досягнення клітинами критичного об’єму збігається з експериментально визначеним часом 50%-го гемолізу, вважається шуканою величиною. Основним недоліком цього методу є те, що він спирається на припущення, що гемоліз відбувається одразу ж, як тільки клітина досягає певного критичного об’єму. Було показано (Saari J.T., Beck J.S., 1974), що час гемолізу може значно перевищувати час набрякання еритроцитів до максимального об’єму. Це пов’язано з тим, що гемоліз відбувається внаслідок флуктуаційного утворення макроскопічної пори і має імовірнісну природу (Козлов М.М., Маркин В.С., 1984). Крім того, у світлі уявлень, висунутих в роботах (Козлов М.М., Маркин В.С., 1984; Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., 1986; Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994), припущення, що викид гемоглобіну з клітин назовні відбувається практично миттєво, є сумнівним. Навпаки, час, впродовж якого гемоглобін покидає еритроцити при гіпотонічному гемолізі, може бути такого ж порядку, як і час утворення макроскопічної пори в мембрані, або навіть перевищувати його.

Очевидно, що використання методу 50%-го гемолізу потребує вдосконалення фізико-математичної моделі процесу для адекватного визначення коефіцієнтів проникності. Ця модель повинна враховувати процес флуктуаційного утворення пори (або пор) в мембрані еритроцита і його внесок в загальний час гемолізу. Згідно з гіпотезою, запропонованою В.С.Маркіним зі співавт. (1984) і нами (Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., 1986), а також у світлі нових експериментальних даних, існуючі уявлення щодо процесу гіпотонічного гемолізу не відповідають дійсності. Таким чином, виникає проблема перегляду та удосконалення попередніх уявлень про причину, механізм та закономірності процесу гіпотонічного гемолізу та створення адекватної біофізичної теорії цього явища. Зокрема, маємо необхідність модифікувати метод вимірювання коефіцієнтів проникності еритроцитів до електрично нейтральних речовин.

Створення правильної фізико-математичної теорії гіпотонічного гемолізу зараз можливо з двох міркувань. Перш за все, геометричні та морфологічні характеристики еритроцитів людини, які необхідні для створення кількісної теорії цього явища, експериментально визначені. По-друге, розвинена термодинамічна теорія флуктуаційного утворення макроскопічної пори в ізотропно розтягнутій мембрані. Це дозволяє описати явище, виходячи з фундаментальних принципів термодинаміки необоротних процесів, теорії пружності тонких оболонок при кінцевих деформаціях, теорії випадкових процесів і гідродинаміки. За такою теорією можливо розрахувати вміст внутрішньоклітинного гемоглобіну й об’єм еритроцита упродовж гіпотонічного гемолізу в залежності від значення коефіцієнта проникності мембран для певної речовини. На протязі більшого часу гіпотонічного гемолізу еритроцити можуть розглядатись як гомогенні сфери. Цей факт дозволяє розрахувати інтенсивність розсіяного клітинами світла при гемолізі, спираючись на теорію Мі (теорія розсіяння світла сферичними частинками) в наближенні аномальної дифракції. Інтенсивність розсіяного світла в цьому випадку залежить від об’єму клітини та її коефіцієнта заломлення. З іншого боку, інтенсивність розсіяного еритроцитами світла упродовж їх гіпотонічного гемолізу може бути визначена експериментально. Таким чином, існують передумови для розробки простого і точного методу вимірювання коефіцієнтів проникності. Розробка відносно простого, але достатньо точного методу вимірювання коефіцієнтів проникності надасть нові можливості для широкого вивчення механізмів проникності та структурно-функціональних властивостей біологічних мембран за дії різних фізико-хімічних чинників.

Геометричні параметри клітин крові відіграють суттєву роль в життєдіяльності організму та змінюються при патологічних станах. Збереження нормального індексу сферичності є завданням системи іонного гомеостазу – однієї з найважливіших систем клітини. Багато пошкоджуючих чинників призводять до зміни індексу сферичності клітин і транспортних параметрів їх мембран, що одночасно відбивається на життєздатності еритроцитів і ефективності функціонування кровоносної системи організму в цілому. Визначення транспортних і геометричних параметрів еритроцитів може служити інформативним діагностичним тестом патологічних станів крові.

Ретельний розгляд процесу гіпотонічного гемолізу приводить до важливих висновків щодо розкиду параметрів в популяції еритроцитів, зокрема геометричних. Неоднорідність популяції еритроцитів не є випадковою, а характеризує стан системи крові в цілому (Леонова В.Г, 1987). Тобто сукупність еритроцитів є закономірно неоднорідною множиною, в якій суттєву інформацію містить саме неоднорідність розподілу клітин за їх властивостями. Вимірювання геометричних параметрів еритроцитів є само по собі дуже складною експериментальною задачею (Rand R.P., Burton A.C., 1963; Waugh R.E. et al., 1992). Раніше індекс сферичності в популяції еритроцитів вимірювали шляхом фотографування окремих клітин і розрахунку цього геометричного параметра за профілем їх збільшеного фотографічного зображення (Jay A.W., 1975). Головним недоліком цього методу є його надзвичайна трудомісткість та складність встановлення геометричної форми клітин за зображенням їх профілів. Відомий також метод лазерного цитомоніторінгу для визначення індексу сферичності (Шайтан К.В. и др., 2002). Головним недоліком цього методу є те, що для кількісного визначення розподілу клітин за індексом сферичності потрібна побудова калібрувальних функцій для кожної проби, що досліджується, окремо. Визначення загальної картини розподілу значно ускладнюється через необхідність виконання таких вимірювань на великій множині клітин. Тому, розробка нових підходів до вирішення задач такого ґатунку є надзвичайно актуальною і корисною для впровадження нових методів діагностики захворювань та вивчення їх впливу на стан популяції еритроцитів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних бюджетних робіт, виконаних на замовлення академії наук України у відділі низькотемпературного консервування біологічних об’єктів: “Вивчення ролі фізико-хімічних факторів в розвитку кріопошкоджень і кріозахисту біологічних об’єктів. Оптимізація етапів технологічного процесу кріоконсервування клітин і тканин” (1986-1990 рр.), № держреєстрації 01870065544; “Вивчення механізмів кріопошкодження і кріозахисту біооб’єктів на основі синтезу мембранної і фазової теорій побудови клітини” (1991-1995рр.), № держреєстрації 01944005303; “Розробка та виготовлення пересувного мікрооб’ємного гематологічного аналізатора для експрес-діагностики захворювань променевого генезу”, що виконувалась згідно договору з МОЗ України №172-91/11 від 1.06.1991 (1991-1994 рр.); науково-дослідної бюджетної теми, яка виконувалась за постановою Бюро ВМББЕіКФ Президії НАН України від 14.01.1996 р. “Побудова та експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біооб’єктів” (1996-2000), № держреєстрації 0100U004235; науково-дослідної теми, що виконується за постановою Бюро ВМББіКФ Президії НАН України від 30.01.2001 р. “Експериментальне вивчення та кількісне моделювання процесів, які відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних об’єктів” (2001-2005 рр.), № держреєстрації 0100U003479.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в розробці нових методів визначення коефіцієнтів пасивної проникності та розподілу за індексом сферичності еритроцитів людини і з’ясуванні механізмів проникності мембран еритроцитів для неелектролітів та розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях різних донорів.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі :

-        на підставі фундаментальних уявлень теорії необоротних процесів, з урахуванням рівнянь руху окремих компонентів отримати вираз для джерела ентропії та зв’язок коефіцієнтів тертя із загальновживаними параметрами трансмембранного масопереносу;

-        побудувати фізико-математичну модель гіпотонічного гемолізу у водних розчинах проникаючої або непроникаючої речовини з урахуванням сучасних уявлень про флуктуаційне утворення пори в ізотропно розтягнутій мембрані сфероцита;

-        виходячи з побудованої біофізичної моделі явища гіпотонічного гемолізу розробити алгоритм визначення коефіцієнтів проникності мембран еритроцитів до неелектролітів шляхом вимірювання часу 50%-го гемолізу у водних розчинах проникаючої речовини методом малокутового розсіювання світла.

-        розробленим методом дослідити вплив фізико-хімічних та геометричних параметрів молекул на їх проникність крізь мембрани нативних еритроцитів людини та інкубованих з блокатором білкових каналів (pCMBS);

-        теоретично розглянути вплив геометричних та фізико-хімічних параметрів молекул на особливості їх проникання крізь водні білкові пори сталого розміру;

-        дослідити вплив температури на пасивну проникність мембран еритроцитів для неелектролітів;

-        на підставі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу у розчинах непроникаючої речовини та експериментального визначення осмотичної крихкості еритроцитів методом малокутового розсіювання світла розробити метод визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності;

-        розробленим методом визначити особливості розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях здорових дорослих донорів, у хворих з ендокринною патологією та у пуповинній крові людини, дослідити вплив температури на розподіл еритроцитів за індексом сферичності.

Об’єктом дослідження є механізми трансмембранного масопереносу в еритроцитах людини, розкид біофізичних параметрів клітин в популяції, вплив температури на структурно-функціональний стан мембран еритроцитів.

Предметом дослідження є розробка методів визначення коефіцієнтів проникності мембран еритроцитів для електрично нейтральних речовин та щільності розподілу еритроцитів в популяції за індексом сферичності. Взаємозв’язок між параметрами молекул та їх здатністю до проникання крізь біологічні мембрани. Щільність розподілу еритроцитів за індексом сферичності в популяціях здорових донорів, при ендокринних патологіях та в пуповинній крові людини.

Методи дослідження включають фундаментальні принципи термодинаміки необоротних процесів, теорії пружності тонких оболонок при кінцевих деформаціях, теорії випадкових процесів і гідродинаміки (за малих чисел Рейнольдса), метод асимптотичного інтегрування системи сингулярних рівнянь з малим параметром, теорію Мі розсіювання світла сферичними однорідними частинками в наближенні аномальної дифракції. Коефіцієнти пасивної проникності мембран еритроцитів до електронейтральних речовин та щільність розподілу еритроцитів в популяції за індексом сферичності визначали за розробленими на підставі фізико-математичних моделей гемолізу в розчинах проникаючої та не проникаючої речовин алгоритмами.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше отримані співвідношення між загальноприйнятими транспортними характеристиками біомембран і коефіцієнтами тертя для випадку замкнутої рухомої вибірково проникної мембрани довільної форми. Визначено джерело ентропії для необоротних процесів в багатокомпонентних розчинах з явним урахуванням рівнянь руху окремих компонентів.
2. Створена удосконалена фізико-математична теорія гіпотонічного гемолізу в розчинах проникаючої речовини, яка враховує існуючі експериментальні характеристики цього процесу і спирається на уявлення про флуктуаційне утворення макроскопічної пори в ізотропно розтягнутій мембрані.
3. На підставі розробленої теорії створено новий удосконалений метод визначення коефіцієнтів пасивної проникності мембран еритроцитів для електронейтральних речовин, який спирається на аналітичні, а не на чисельні, рішення системи диференційних рівнянь, що описують процеси трансмембранного масопереносу.
4. Розробленим експериментальним методом та теоретично досліджено механізми проникання малих електронейтральних молекул крізь мембрани еритроцитів. Показано існування двох альтернативних шляхів проникання низки речовин (білкового і ліпідного), вперше отримано кількісні співвідношення проникностей цими шляхами і залежність цих кількісних характеристик від фізико-хімічних та геометричних параметрів молекул. Ретельно досліджені температурні залежності проникності еритроцитів для неелектролітів, які надали можливість встановити зв’язки між термоіндукованими процесами в мембранах та їх пасивною проникністю.
5. На підставі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу в розчині непроникаючої речовини розроблено оригінальний метод визначення щільності розподілу еритроцитів в популяції за індексом сферичності.
6. Розробленим методом вперше отримано розподіл клітин за цим параметром в популяціях еритроцитів здорових дорослих донорів та в пуповинній крові людини. Показано вплив ендокринних патологій на стан еритроцитарної популяції.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод визначення коефіцієнтів проникності до неелектролітів мембран еритроцитів людини є простим і доступним і може широко використовуватись в наукових дослідженнях при вивченні впливу зовнішніх та внутрішніх чинників на мембрани еритроцитів. Отримані в роботі значення коефіцієнтів проникності низки кріопротекторів, а також досліджені механізми їх проникання можуть бути використаними при розробці нових та для пошуку шляхів вдосконалення існуючих методів кріоконсервування. Температурні залежності коефіцієнтів проникності є дуже корисними для розробки протоколів низькотемпературного консервування. Розроблений оригінальний метод визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності може бути використаний для діагностики захворювань кровотворної системи та інших патологічних станів людини. Отримані цим методом кількісні характеристики стану популяції еритроцитів можуть відкрити нові шляхи для розуміння розвитку тієї чи іншої патології та методів її лікування. Ця характеристика є також дуже важливою при виборі зразків крові для подальшого кріоконсервування і дозволить завчасно вибраковувати непридатні для низькотемпературного консервування зразки, що може забезпечити суттєвий економічний ефект.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці методів, ініціюванні та здійсненні усієї представленої серії досліджень проникності мембран еритроцитів до низки електронейтральних речовин та розподілу еритроцитів за індексом сферичності.

В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

• у роботах [1,3,10-12,17,22,24,27,29,40] – у побудові фізико-математичних моделей процесів тепломасопереносу, аналізі теоретичних результатів, їх порівнянні з експериментальними даними, участі в експериментах;
• у роботах [2,4-6,8,13-16,20,33,34,37,41-44] – у ідеї та плануванні експериментів, участі в експериментальних вимірюваннях, аналізі результатів;
• у роботах [7,9,] – у ідеї та створенні установки для мікроскопічного визначення об’єму клітин, закріплених в полі зору мікроскопа на мікропіпетках, участь в експериментах та аналізі результатів;
• у роботах [18,21,25,28,45-48] – у ідеї, плануванні та виконанні експериментів, узагальненні експериментальних даних;
• у роботах [30,31] – в участі у теоретичній та практичній розробці методів визначення проникності та розподілу за індексом сферичності еритроцитів;
• у роботах [32,35,36,38] – у аналізі літератури та власних теоретичних моделей фізико-хімічних процесів, що протікають при кріоконсервуванні клітинних суспензій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на ІІ Всесоюзній конференції з теоретичних та прикладних питань кріобіології (Харків, 1984); І Міжнародній конференції молодих вчених країн СЕВ (Братіслава, 1985); Міжнародній конференції “Досягнення і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини (Харків, 1988); ІІ міжнародній конференції “Успіхи сучасної кріобіології” (Харків, 1992); І з’їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків 1995); ІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків,1998); 31,33 та 36 щорічних нарадах Міжнародного товариства кріобіології (Кіото, Японія, 1994; Індіанаполіс, США 1996; Марсель, Франція 1999); Всеукраїнській конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (Харків, 2001); ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); ХІУ конгресі Європейської асоціації дослідження червоних клітин (Роскофф, Франція, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 48 наукових робіт, з них 34 статті у фахових наукових виданнях, 2 деклараційні патенти України на винаходи, 12 тез доповідей на міжнародних та національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 277 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, 6 розділів, підсумку, висновків і списку використаної літератури, що включає 270 джерел. Робота містить 70 рисунків та 11 таблиць, з яких 2 таблиці та 20 рисунків на окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У ВСТУПІ обґрунтована актуальність обраної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, визначенні наукова новизна і практична цінність одержаних результатів.

У РОЗДІЛІ 1 подано літературний огляд, який охоплює аналіз теоретичних та експериментальних досліджень, що стосуються методів визначення проникності біологічних мембран, впливу складу штучних та біологічних мембран і температури на їх проникність для води та неелектролітів; геометричних параметрів еритроцитів, їх визначення та значення для функціональних властивостей цих клітин.

РОЗДІЛ 2 дисертації присвячений характеристиці об’єктів та методів дослідження. Дослідження проведені на еритроцитах крові дорослих здорових донорів і людей з ендокринною патологією (гіпо- та гіпертиреоз), яку отримували на Харківській обласній станції переливання крові і в клініці при Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМНУ, а також на еритроцитах пуповинної крові людини, яку одержували у пологових відділеннях Харківських клінік. Як консервант в усіх випадках використовували консервуючий розчин “Глюгіцир”.

Проникність мембран еритроцитів людини визначали для речовин низки діолів (1,2- та 1,3-пропандіол; 1,2-, 1,3-, 1,4- та 2,3-бутандіол), етиленгліколю, ді- та триетиленгліколю, диметилсульфоксиду (ДМСО), низки амідів (ацетамід, метилацетамід, диметилформамід та диметилацетамід), гліцерину та низки його моноалкілових ефірів: (1монометиловий ефір гліцерину (1-ММЕГ), 1-моноетиловий ефір гліцерину (1-МЕЕГ), 1-моноізопропіловий ефір гліцерину (1-МІПЕГ)). Моноалкілові ефіри гліцерину були синтезовані та очищені фракційною перегонкою у вакуумі у відділі кріопротекторів ІПКіК НАНУ (Кощий С.В., 1992). Всі інші речовини були марки “х.ч.” або “ч.д.а.”, додатково очищені у відділі кріопротекторів ІПКіК НАНУ. Проникність визначали для 1 М концентрацій речовин за температури 20оС (якщо не зазначено інше).

В якості блокатора водних білкових каналів використовували сульфгідрильний реагент p-Chloromercuribenzenesulfonic Acid Monosodium Salt фірми SIGMA (pCMBS). Обробку еритроцитів блокатором проводили за рекомендаціями, наданими в роботі Macey R.L., Farmer R.E.L. (1970), тобто інкубацією з 2 мМ pCMBS впродовж 1 години при 22оС. Після інкубації еритроцити відмивали фосфатним буфером рН 7,4.

В теоретичній частині роботи використовували фундаментальні принципи термодинаміки необоротних процесів (Дьярмати И., 1974; де Гроот С., Мазур П., 1964), теорії пружності тонких оболонок при кінцевих деформаціях (Ивенс И., Скейлак Р., 1982), теорії випадкових процесів (Ланда П.С., 1980) і гідродинаміки (за малих чисел Рейнольдса) (Хаппель Дж., Бреннер Г., 1976), метод асимптотичного інтегрування системи сингулярних рівнянь з малим параметром (Марри Дж., 1983), теорію Мі розсіювання світла сферичними однорідними частинками в наближенні аномальної дифракції (ван де Хюлст Г., 1961; Борен К., Хафман Д., 1986).

Статистичну обробку результатів досліджень проводили за методом Фішера-Стьюдента з використанням t-критерію та кореляційного аналізу (Дьяконов В.П., 1987).

Основні експериментальні результати були отримані методом малокутового розсіювання світла суспензією еритроцитів. З теоретичних міркувань випливає, що вимірювання за принципом розсіювання світла є найбільш ефективними в разі, коли розмір частинок має порядок довжини хвилі. В цьому випадку головний внесок в екстинцію надає розсіювання, а не поглинання. Індикатриса розсіювання складається з низки пелюсток, які є симетричними відносно оптичної осі і зменшуються за інтенсивністю при збільшенні кута дифракції. Індикатриса розсіювання світла суспензією еритроцитів має два максимуми при малих кутах (3о і 9о). Тому при розробці приладу був вибраний кут вимірювання 9о, оскільки вимірювання в першій пелюстці (під кутом 3о) має значні експериментальні труднощі в зв’язку зі складністю розділення падаючого та розсіяного світла.

В роботі показано, що інтенсивність світла, розсіяного еритроцитом під кутом 9о до напрямку падаючого пучка, є рівною:

Знаючи залежність зміни відносного об’єму сфероцита y і вмісту гемоглобіну в клітині α від часу при  y≥ys за допомогою поданої залежності легко отримати залежність інтенсивності розсіяного під кутом π/20 до напрямку падаючого пучка світла з довжиною хвилі λс=1 мкм від часу.

В експериментах по визначенню коефіцієнтів проникності мембран еритроцитів 3 мл водного розчину досліджуваної речовини вміщується в кювету. Після реєстрації нульової лінії в розчин вносяться еритроцити (від 0,003 до 0,01 мл в залежності від концентрації клітин у зразку) і записується кінетична крива гіпотонічного гемолізу в розчині проникаючої речовини. Коефіцієнти проникності автоматично розраховуються на ЕОМ за алгоритмом, отриманим на підставі розробленої нами фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу у водному розчині проникаючої речовини.

Для визначення щільності розподілу еритроцитів за індексом сферичності у вимірювальну кювету приладу, що містить 3 мл розчину хлориду натрію з концентрацією в діапазоні від 0,15 до 0,05 моль/л , додавали відповідну кількість (однакову в кожній серії) еритроцитів. За даними малокутового розсіювання та калібрувальною кривою визначали відсоток збережених клітин в гіпотонічних розчинах непроникаючої речовини (NaCl) і отримували криві осмотичної крихкості. Криві розподілу еритроцитів за індексом сферичності визначали з експериментальних кривих осмотичної крихкості на підставі розробленої нами фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу в розчині непроникаючої речовини.

У РОЗДІЛІ 3 подано теоретичний аналіз процесів пасивного трансмембранного переносу. Отримано вираз для питомого потоку ентропії

,

а також для джерела ентропії багатокомпонентного розчину з урахуванням рівнянь руху окремих його компонентів, що до цього часу не було зроблено.

де hk – парціальна питома ентальпія k-го компоненту, - кондуктивний потік імпульсу (тензор другого рангу), - так званий дифузійний потік k-ї речовини, ψk - скалярний потенціал зовнішнього поля, віднесений до одиниці маси k-го компоненту, μk - хімічний потенціал k-го компоненту.

Цей результат є принципово важливим для коректної побудови феноменологічної теорії нерівноважних процесів та усуває недолік попередніх підходів до виводу основних рівнянь термодинаміки необоротних процесів, на які вказувалось у роботі Дьярматі І. (1974). Наведена формула практично збігається з формулою, яку зазвичай отримують при традиційному підході до виводу основних співвідношень термодинаміки необоротних процесів, якщо припустити , де - в’язкий тензор тиску, який дорівнює сумі в’язких тензорів тиску окремих компонентів розчину. Але надзвичайно суттєвою є та обставина, що ми, на відміну від інших авторів, вивели цю формулу з урахуванням рівнянь руху окремих компонентів. Важливо відзначити, що формула є справедливою навіть у тих випадках, коли ми не нехтуємо прискоренням окремих компонентів, тоді як при традиційному підході опосередковано приймається припущення про відсутність прискорення окремих компонентів відносно центрів мас фізично елементарних об’ємів рідини.

У випадку ізотермічних процесів, які мають особливе значення при дослідженні біологічних систем, утворення ентропії, пов’язане з дифузією, визначається виразом

Оскільки утворення ентропії σsd внаслідок другого закону термодинаміки є ненегативно визначеною величиною і перетворюється в нуль за термодинамічної рівноваги, у лінійному наближенні потоки повинні бути лінійними функціями термодинамічних сил, тобто

де αki – феноменологічні коефіцієнти, які у загальному випадку залежать від змінних стану, і підлягають співвідношенню взаємності Онзагера

Рівності

       (і,k,j=1,2,…,n)

встановлюють зв’язок між феноменологічними коефіцієнтами масопереносу та коефіцієнтами тертя :

Для трьохкомпонентного розчину отримуємо

Для аналізу процесів масопереносу крізь клітинні мембрани зручно в якості компонентів 1,2,3 розглядати відповідно розчинник (воду), розчинену речовину, та мембрану. Позначимо коефіцієнт тертя між розчиненою речовиною та мембраною як , коефіцієнт тертя між розчинником та мембраною як і коефіцієнт тертя між розчиненою речовиною та розчинником як .

За визначенням коефіцієнт фільтрації клітинної мембрани, коефіцієнт проникності та коефіцієнт відбиття клітинної мембрани для s-ої речовини є

,        ,        

Отримуємо вирази для транспортних коефіцієнтів мембрани через коефіцієнти тертя, а саме

Для високо селективних мембран, якими є клітинні мембрани

Тому

       ,                        

для пори , оскільки ,                 і        Ks=1

Отримані вирази подібні до класичних виразів, отриманих в роботі Kedem, Katchalsky (1961). Але, наш результат одержано для більш загального випадку. На відміну від авторів цієї роботи, ми розглянули замкнуту рухому, а не нерухому безмежну плоску мембрану. Одержані нами вирази для транспортних характеристик мембран є більш адекватні для застосування до реальних клітин. Оскільки, співвідношення між коефіцієнтами тертя, які мають прозорий фізичний сенс, із загальновживаними феноменологічними коефіцієнтами широко використовуються для інтерпретації експериментальних даних щодо проникності біологічних мембран важливо було отримати ці вирази в за більш загальних припущень.

РОЗДІЛ 4 присвячений побудові фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу еритроцитів. Зміна об’єму клітини і внутрішньоклітинної концентрації проникаючої в клітину речовини описується системою звичайних диференційних рівнянь, яка при переході до безрозмірних величин має вигляд:

де        ,        ,        ,

π0 – осмотичний тиск не проникаючих крізь клітинну мембрану речовин в початковий момент часу, тобто фізіологічного розчину.

Відомо (Ивенс И., Скейлак Р., 1982), що розрив мембрани еритроцита виникає при невеликій відносній зміні площі поверхні його мембрани, відповідно, при невеликій зміні відносного об’єму. Тому, при описанні зміни об’єму клітини в межах ys<y<yp, де yp – значення відносного об’єму клітини, при якому в її ізотропно розтягнутій мембрані виникає макроскопічна пора, можна вважати, що

       (y-ys)/ys<<1         ΔP/π0=2C(y/ys-1)/3

Точне аналітичне рішення системи наведених нелінійних рівнянь, що описують процеси масопереносу в системі з одною проникаючою речовиною в позаклітинному середовищі, відсутні. Тому для визначення коефіцієнтів проникності клітинних мембран за експериментальним ходом зміни об’єму клітини ці рівняння, як правило, вирішують чисельно за допомогою ЕОМ. Це утруднює як аналіз результатів відповідних чисельних експериментів, так і зіставлення чисельних експериментів з експериментальними даними. Проте, можна отримати більш ефективне та зручне для аналізу рішення системи рівнянь за допомогою асимптотичних методів рішення сингулярно збурених систем (Марри Дж., 1983). Для цього подамо систему рівнянь у вигляді

де введено безрозмірний “повільний” час і нову змінну і , де - осмотичний тиск позаклітинного розчину, - осмотичний тиск не проникаючих крізь мембрану внутрішньоклітинних речовин. Очевидно, . Оскільки в якості співмножника при похідній фігурує малий параметр ε, можна отримати асимптотичне рішення системи рівнянь для часів τ0<<t≈10-2 c за допомогою згаданого вище методу сингулярних збурень. Час досягнення клітиною сферичного об’єму ys визначається як

Зміна відносного об’єму клітини за y>ys в несингулярній області описується рішенням

В несингулярній області, тобто за часів, що перевищують τ0, ці рішення з точністю до членів порядку 0(ε) апроксимують точне рішення вихідної системи рівнянь.

В роботі (Козлов М.М., Маркин В.С., 1984) і в нашій роботі (Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., 1986) побудована теорія осмотичного лізису ліпідних везикул, що виникає внаслідок флуктуаційного утворення макроскопічної пори в ізотропно розтягнутому мембранному бішарі. Середній час, за який утворюється макроскопічна пора в ізотропно розтягнутій мембрані еритроцита,

є тим більшим, чим менше розтяг мембрани і чим нижча температура, при якій утворюється пора. Крізь макроскопічну пору, що утворилась в ізотропно розтягнутій мембрані еритроцита, відбувається викид внутрішньоклітинного вмісту з клітини назовні під дією залишкового тиску. При цьому тиск всередині клітини швидко падає до критичного значення і відносний об’єм клітини зменшується до значення, що з точністю до малої поправки, якою можна знехтувати, збігається з ys. В цей момент пора закривається, оскільки її існування стає термодинамічно невигідним (вільна енергія деформації у відсутності пори набуває меншого значення, ніж вільна енергія мембрани з порою). Оскільки при цьому не зникає трансмембранний перепад концентрації проникаючої в еритроцит речовини, процес проникання цієї речовини в клітину продовжується і, відповідно, об’єм клітини знов збільшується внаслідок його проникання аж до утворення нової пори за описаним механізмом. Таким чином, гемоліз еритроцита є циклічним процесом. З урахуванням часу, за який в мембрані клітини, зануреної в гіпертонічний розчин проникаючої речовини, утворюється макроскопічна пора були отримані вирази, які повністю визначають зміну відносного об’єму еритроцита з часом на і-ому етапі гемолізу

Отримані співвідношення повністю описують кінетику гемолізу окремого еритроцита в гіпертонічному водному розчині проникаючої в клітину речовини. При цьому параметр α, очевидно, можна трактувати як об’ємний вміст гемоглобіну в еритроциті.

Як витікає з наведених в цьому розділі роботи теоретичних результатів, розвинені в них уявлення про фізичний механізм гіпотонічного гемолізу пояснюють основні закономірності цього явища, що відомі з літератури. Наша теорія не тільки пояснює наявність так званого сферичного періоду, існування якого обумовлено необхідністю розтягу мембрани до певного рівня і подолання енергетичного бар’єра між станами з нульовим і відмінним від нуля радіусом пори, але і дозволяє визначити його тривалість кількісно. У сукупності з рішенням для інтенсивності розсіяного суспензією сферичних часток світла отримані співвідношення є підставою для експериментального визначення коефіцієнтів проникності мембран еритроцитів для електрично нейтральних речовин методом 50%-го гемолізу з урахуванням часу гемолізу згідно з описаним механізмом.

У РОЗДІЛІ 5 розроблений метод застосовується для експериментального визначення коефіцієнтів проникності мембран еритроцитів людини. Вивчали проникність мембран еритроцитів людини до неелектролітів низок діолів та амідів, гліцерину і його ефірних похідних. Напрямок наших досліджень був обумовлений можливістю порівняння фізико-хімічних властивостей молекул в гомологічних рядах та серед структурних ізомерів і з'ясування впливу цих властивостей на їх проникність крізь біологічні мембрани. Коефіцієнти проникності (P) нативних еритроцитів та еритроцитів, проінкубованих з pCMBS, для речовин низки діолів в залежності від коефіцієнта розподілу між водою та гідрофобною фазою (Кр) представлені на рис.1. З рисунка видно, що проникання всіх представлених діолів пригнічується обробкою еритроцитів сульфгідрильним реагентом. Це свідчить про існування білкового шляху проникання цих речовин, який блокується pCMBS. В той же час, проникність для бутандіолів навіть для нативних еритроцитів має пряму залежність від коефіцієнтів розподілу між гідрофобною та гідрофільною фазою (коефіцієнт кореляції становить 0,927). Ці дані свідчать про те, що проникання бутандіолів здійснюється значною мірою крізь ліпідну фазу. Коефіцієнт кореляції між коефіцієнтами проникності до ізомерів бутандіолу для еритроцитів, проінкубованих з pCMBS, і коефіцієнтами розподілу є ще більшим і становить 0,996 (графік 2 на рис 1).

Аналіз даних для групи гідрофільних речовин (етиленгліколь, 1,2-пропандіол, 1,3-пропандіол) (ліва гілка кривої 1 на рис.1), показує, що проникність етиленгліколю та пропандіолів визначається не коефіцієнтами розподілу, а розмірами. Коефіцієнт кореляції між проникністю цих речовин та діаметром і об'ємом молекул становить 0,9 та 0,97 відповідно. Очевидно, що в зв'язку з високою гідрофільністю цих неелектролітів проходження їх крізь водні пори є більш прийнятним, і тому зрозумілим стає така сильна залежність від розмірів молекули. Незважаючи на невелику різницю в коефіцієнтах розподілу між гідрофільною та гідрофобною фазою ізомерів пропандіолу, коефіцієнт проникності для 1,2-пропандіолу більше ніж в два рази перевищує коефіцієнт проникності для 1,3- пропандіолу, а після інкубації з pCMBS вони відрізняються лише в 1,3 рази.