|
КОММЕДБІОПРОМ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ
На правах рукопису
Для службового користування
Прим. №______
АНТІПОВА Ольга Євгенівна
УДК 615.07:543.42.062
МЕТОД ЗОВНІШНЬОГО СТАНДАРТУ ПРИ ДОСЛІДЖЕННІ
І КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ЛІКАРСЬКИХ ПРЕПАРАТІВ
15.00.03 - Стандартизація та організація виробництва лікарських засобів
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії аналітичної хімії Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків). Коммедбіопром, Національна Академія наук України.
Науковий керівник - доктор фармацевтичних наук,
Підпружников Юрій Васильович
Державний науковий центр лікарських засобів,
завідувач лабораторії аналітичної хімії
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Гризодуб Олександр Іванович
Державний науковий центр лікарських засобів,
завідувач лабораторією хроматографії
Доктор фармацевтичних наук, професор,
Петюнін Генадій Павлович
Харківська медична академія післядипломної освіти,
завідувач кафедри клінічної біохімії та
судово-медичної токсикології
Провідна установа - Українська фармацевтична академія,
кафедра фармацевтичної хімії, м.Харків.
Захист відбудеться “28” жовтня 1999 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.817.01 при Державному науковому центрі лікарських засобів (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ДНЦЛЗ (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
Автореферат розісланий “28” вересня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор фармацевтичних наук, професор М. О. Казарінов
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Якість лікарських препаратів (ЛП) забезпечує безпеку і ефективність їх застосування. Ця специфіка пред'являє жорсткі вимоги до засобів контролю якості ЛП, при розробці яких використовується широкий спектр фізико-хімічних методів. Серед них спектрофотометричний метод, який давно вже є фармакопейним, відрізняється точністю, простотою і експресністю, тому широко використовується при аналізі синтетичних і фітохімічних ЛП.
Найбільше розповсюдження в наш час отримав спектрофотометричний аналіз в рамках методу зовнішнього стандарту (ЗС). В роботах співробітників ДНЦЛЗ освітлені найбільш важливі аспекти можливостей спектрофотометричного аналізу в рамках зовнішньої стан-дартизації. Однак деякі питання вимагають подальшого вивчення. Так, при роботі з фіто-хімічними ЛП зберігається проблема вибору і використання речовини в якості ЗС. Актуальною залишається проблема зниження похибки методик багатокомпонентного аналі-зу, а також обгрунтованого вибору варіанту аналізу у відповідності з вимогами до точності.
Візуальним варіантом методу ЗС можна вважати і метод визначення колірності рідких ЛП. Колір є одним з показників якості ЛП. Однак метод візуальної оцінки колірності не дає об'єктивних і надійних результатів, що робить перспективним і актуальним перехід до неза-лежного спектрофотометричного методу.
Цим і зумовлений вибір теми дисертації, формулювання її мети і задач.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Державного наукового центру лікарських засобів (№ державної реєстрації 01.934U44239 та 01.934U4212).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є розробка методик контролю якості ЛП на основі застосування методу ЗС в одно- та багатохвильовому спектрофотометричному аналізі; обгрунтування спектрофотометричного методу оцінки колірності і його практичне застосування при оцінці колірності деяких ЛП.
У відповідності з поставленою метою необхідно було вирішити наступні задачі:
- Вивчити можливості і переваги застосування методу ЗС в спектрофотометричному аналізі.
- Показати доцільність застосування методу ЗС в контролі якості ЛП.
- На підставі застосування однокомпонентного ЗС вибрати умови і розробити методики контролю якості ЛП в різних варіантах:
- при відсутністі стандарту визначаємої речовини;
- при використанні в якості стандарту речовини, яка переважає за кількісним вмістом і входить до складу речовин, що визначаються;
- при використанні в якості стандарту речовини, яка не входить до складу препарату, але утворює після відповідної обробки сполуку, ідентичну визначаємій;
- при використанні в якості стандарту визначаємої речовини
- На підставі застосування багатокомпонентного ЗС:
- показати можливості багатохвильової спектрофотометрії в тесті “Розчинення”;
- розробити методики контролю якості деяких комбінованих ЛП.
- Теоретично обгрунтувати можливість переходу від візуального до інструментального спектрофотометричному методу оцінки колірності.
- Розробити методику визначення колірності забарвлених ЛП при використанні інструментального методу.
- Провести порівняння результатів оцінки колірності інструментальним і візуальним методами.
Наукова новизна одержаних результатів.
- Запропанований перехід до інструментального методу оцінки колірності ЛП.
- Проведене теоретичне обгрунтування і показане практичне застосування еталонних розчинів колірності в якості ЗС при інструментальному методі визначення колірності.
- Розроблений і апробований на 14 ЛП новий підхід до інструментального методу визначення колірності. Вперше запропановано проводити визначення колірності об’єктів при використанні залежності: “величина колірної відмінності – номер ета-лону”.
- Проведене порівняння результатів оцінки колірності інструментальним і візуальним методами.
- В рамках використання однокомпонентного і багатокомпонентного методу ЗС ро-зроблені методики контролю якості ряду фітохімічних, однокомпонентних і бага-токомпонентних ЛП.
Практичне значення одержаних результатів.
- Розроблена методика інструментальної оцінки колірності рідких ЛП.
- На підставі проведених досліджень розроблені методики контролю якості, які введені в наступну нормативну документацію: ТФС 42У-7/37-763-98 “Трава десмодіуму канадського”; ТФС 42У-7/37-765-98 “Фладексан”; ТФС 42У-7/37-764-98 “Мазь “Фла-декс”; ТФС 42У-37-213-96 “Екстракт “Вігор”; ТФС 42У-37-214-96 “Бальзам “Вігор”; ТФС 42У-5/37-796-98 “Капсули “Вітафер”; ТФС 42У-4-204-96 “Таблетки “Фероплект”; ФС 42У-4-114-96 “Таблетки “Кофальгін”; ТФС 42У-4/37-880-98 “Гранули “Кратал”; проект ТФС “Таблетки “Ацетрин, вкриті оболонкою”.
Особистий внесок здобувача полягає в плануванні і проведенні експериментальних до-сліджень, одержанні, обробці і обговоренні їх результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації були викладені на Науково-практичній конференції “Наукові досягнення і проблеми виробництва лікарських засобів” (Харків, 1995), на Науково-практичній конференції “Досягнення сучасної фармації - в медичну практику” (Харків, 1996), на Всеукраїнській конференції з аналітичної хімії (Ужгород, 1998), на Міжнародній конференції “Фармация XXI века: инновации и традиции” (С.-Петербург, 1999).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, в тому числі 6 статтей та 4 тези доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, літературного огляду, 3 розділів власних експериментальних досліджень, загальних висновків, списку використаних джерел, викладена на 137 сторінках машинопису, містить 29 рисунків, 28 таблиць, список використаної літератури містить 147 джерел, у тому числі 14 зарубіжних авторів.
основний змIст роботи
Розробка методик контролю якості лікарських препаратів при використанні однокомпонентного зовнішнього стандарту
Використання однокомпонентного ЗС в варіанті однохвильової спектрофотометрії дозволяє нівелювати цілий ряд похибок, що виникають при проведенні аналізу. Особливість стандартизації фiтохiмiчних ЛП полягає в складнощах із вибором стандарту. Ілюстрацією використання однокомпонентного ЗС є кількісне визначення (КВ) сумарного вмiсту флавоноїдiв в травi десмодiума канадського, субстанції “Фладексан” і мазi “Фладекс”.
Трава десмодiума канадського – сировина для одержання “Фладексана”-субстанції – основного діючого компоненту мазi “Фладекс” (оригінального ЛП, розробленого в ДНЦЛЗ). Фармакологiчнi дослідження показали, що сума полiфенольних сполук, що містяться в траві десмодiума канадського, має яскраво вираженi противовiрусну, анальгезуючу і протизапальну дії. Встановлено, що основними речовинами, якi визначають біологічну активність, а також переважають за кількісним вмістом, є флавоноїднi C-глiкозиди: гомоорiєнтин (Г) і сапонаретин (С).
В зв’язку з труднощами в одержанні чистих стандартних зразків речовин, якi входять до складу препаратів, т.т. Г та С, нами був застосований прийом зовнішньої стандартизації. Вiн передбачає використання в якості стандарту речовини, яка не входить до складу сполук, що визначаються, але володіє близькими фізико-хімічними властивостями. Симбатнiсть спектрів поглинання в спектрофотометрії – це властивість, яка визначає можливість використання речовини в якості стандарту. Г та С в певних умовах здатні утворювати комплекси з алю-мінію хлоридом. Спектри поглинання комплексів зразків Г та С з алюмінію хлоридом представлені на рис. 1 (крива 3 та 4). Як вид-но з рисунку, спектри поглинання мають iзобестичну точку при довжині хвилі 384 нм. В цій точці питомі показники поглинання комплексів Г та С з алюмінію хлоридом рівні: Ег384= Ес384= 191,20;
В якості ЗС був обраний рутин, який не входить до складу препарату. Це О-глiкозид на відмiнку від Г та С. Але спектр комплексу рутину з алюмінію хлоридом близький до спектру поглинання аналогічного комплексу флавоноїдiв препарату в спектральній області, що використовується для аналізу (рис. 1, крива 1 та 2).
Важливим є той факт, що стандарт піддається тим самим хімічним перетворенням (ком-плексоутворення з алюмінію хлоридом), що і визначаємi речовини. Такий підхід дозволяє нівелювати не тільки спектрофотометричнi похибки, а й похибки, що виникають за рахунок пробопiдготовки.
Визначення сумарного вмiсту флавоноїдiв засноване на вимірюванні оптичної густини розчину препарату при довжині хвилі 384 нм. Це дозволяє одержувати стабільні результати, незважаючи на можливу зміну співвідношення Г та С в препараті. В цих же умовах виміряють оптичну густину стандартного зразка рутину.
Рис. 1. Спектри поглинання комплексів: 1 - рутину;
2 - флавоноїдів препарату;
3 - сапонаретину;
4 - гомоорієнтину з алюмінію хлоридом
Для одержання достовiрних результатів КВ були вибрані умови, якi забезпечують досягнення повноти комплексоутворення і стійкiстi комплексів. Експериментально встановлена необхідна кількість алюмінію хлориду. Досліджена залежність оптичної густини вiд величини рН. Визначена область рН, в якiй зміна оптичної густини не значна, т.т., методика буде ха-рактеризуватися стійкiстю до помилок, викликаних неточнiстю в приготуванні буферних розчинів.
Методики визначення суми флавоноїдiв в траві десмодiума канадського, субстанції “Фладексан” і мазi “Фладекс” характеризуються відносною помилкою, яка не перевищує 2,3; 1,4 та 2,5%, відповідно.
Аналогічний підхід, т.т. використання в якості ЗС речовини, яка не входить до складу досліджуваної сполуки, був використаний і для ідентифікації діючих речовин методом тонкошарової хроматографії (ТШХ). Величина Rf виступає критерієм в ТШХ, який визначає можливість використання тієї або іншої речовини як стандарту. Експериментально встановлено, що цим вимогам задовiльняють рутин та гiперозид.
В випадку, коли речовина, що визначається, доступна i відома, не викликає сумнівів доцільність вибору в якості ЗС самої визначаємої речовини, бо вона проходить через ті ж стадії пробопідготовки, що і досліджуваний препарат.
Такий підхід був застосований при спектрофотометричному КВ таурину (однієї з діючих речовин таблеток “Ацетрин”). До складу таблеток входять: кислота ацетилсаліцилова - 0,03 г; кислота аскорбінова - 0,05 г; таурин - 0,3 г; допоміжні речовини (до одержання ядра масою 0,5 г), з подальшим покриттям ядра кишковорозчинною оболонкою.
Кількісне визначення таурину (2-аміноетансульфонової кислоти) засновано на здатності амінокислот утворювати забарвлені сполуки з нінгідрином. Нами були вивчені умови про-тікання реакції взаємодії таурина з нінгідрином і встановлено, що максимум поглинання забарвленого продукту взаємодії знаходиться при довжині хвилі 568 нм. Експериментально встановлена кількість реагенту, яка необхідна для досягнення повноти забарвлення, вибрані температура і тривалість нагрівання реакційної суміші. Встановлена відсутність заважаючого впливу інших компонентів препарату в вибраних умовах.
Метрологічні характеристики методики КВ таурину в таблетках “Ацетрин” наведені в таблиці 1.
Таблиця 1. Метрологічні характеристики методики кількісного визначення таурину в
таблетках “Ацетрин”
Аналогічна методика використовується і для контролю кількості таурину, який перейшов в розчин після проведення тесту “Розчинення”.
Поряд з екстрактами глоду і кропиви собачої таурин входить до складу оригінального препарату – гранул “Кратал”. Вводити спектрофотометричне визначення таурина в ЛП по-дібного типу було б недоцільно. Більш просте рішення полягало в титриметричному визначенні таурину, що і було використано при розробці методики КВ.
Методики контролю якості залізовміщуючих препаратів “Фероплект” та “Вітафер” також розроблені на підставі застосування методу ЗС в однокомпонентному варіанті. При цьому речовина, яка не входить до складу препарату, але утворює після відповідної пробопідготовки сполуку, ідентичну тій, що визначається, використовується як стандарт. Тому була обрана стабільна сполука, що містить іон Fe (II)–заліза (II) амонію сульфат (сіль Мора).
Розробка методик контролю якості ЛП при використанні багатокомпонентного ЗС
Використання багатокомпонентного ЗС дозволяє знизити похибки вимірювання, а в комбінації з різними варіантами багатохвильової спектрофотометрії дозволяє проводити ви-бір оптимальних довжин хвиль, прогнозувати похибки визначення компоненту з метою їх мінімізації.
До складу препарату таблеток “Кофальгін” входять: діючі [анальгін (0,3 г) і кофеїн-бензоат натрію (0,05 г, суміш кофеїну та натрію бензоату в співвідношенні 2:3)] та допоміжні речовини. Нами застосовані експресні спектрофотометричні методики контролю якості препарату замість існуючих титриметричних.
Спектри поглинання 0,002% розчинів анальгіну (А), кофеїну (К) та натрію бензоату (Б) представлені на рис. 2. Через значне перекривання спектрів поглинання компонентів проводити визначення в рамках однохвильової спектрофотометрії неможливо.
В області 224-290 нм були виміряні питомі показники поглинання і розраховані інформаційні коефіцієнти А, К і Б. В результаті проведеної оптимізації були встановлені наступні аналітичні позиції для одночасного визначення вмісту: 230, 251 та 276 нм. На підставі отриманих прогнозованих коефіцієнтів посилення похибки встановлено, що відносні помилки визначення складають: 1,3; 2,1; 3,2% для А, Б та К, відповідно. Це відповідає вимогам до точності методик, які використовуваються в тесті “Розчинення”.
Тест “Розчинення” проводиться в стандартних умовах за найменш розчинним компонентом К. При цьому як стандарт використовується багатокомпонентний ЗС. Це штучна суміш, яка складається з А, Б та К в номінальному співвідношенні. Вимірювання оптичної густини розчину препарату та ЗС проводять на трьох обраних довжинах хвиль – 230, 251, 276 нм.
З метою збільшення точності аналізу при КВ нами був використаний підхід, заснований на обліку апріорної інформації.
Рис. 2. Спектри поглинання 0,002% розчинів: 1 - анальгіна;
2 - натрію бензоата;
3 - кофеіна в 0,1 М розчині кислоти;
хлористоводневої
Встановлено, що А вносить внесок в сумарне поглинання препарату при довжині хвилі 254 нм. Це складає більше 92%. К визначається після екстракції в хлороформ. При цьому екстрагується дуже мала кількість А і внесок К в сумарне світлопоглинання хлороформного здобування складає не менше 91% при довжині хвилі 273 нм. В якості стандарту, як і в тесті “Розчинення”, використовується суміш субстанцій номінального складу, що піддається тим же операціям, що і випробуваний розчин. Метрологічні характеристики методики КВ К наведені в табл. 2. Відносна помилка визначення А не перевищує 1%.
Таблиця 2. Метрологічні характеристики методики кількісного визначення кофеїну в
таблетках “Кофальгін”
Для контролю кількості діючих речовин, що перейшли в розчин з таблеток “Ацетрин”, нами був розроблений тест “Розчинення”. По аналогії з тестом “Розпадаємість” для кишковорозчиннних таблеток нами запропоновано проведення тесту “Розчинення” з використанням двох середовищ розчинення: штучного шлункового та кишкового соку.
Рис. 3. Спектри поглинання розчинів: 1 - кислота аскорбінова (1 × 10-3 %);
2 - кислота ацетилсаліцилова (2 × 10-3 %);
3 - кислота саліцилова (1 × 10-3 %)
Визначення ацетилсаліцилової кислоти (Асп), яка перейшла в розчин, в ізосбетичній точці не можливо через заважаючий вплив кислоти аскорбінової (Аск). Спектри поглинання Асп, Аск і саліцилової (Сал) кислот представлені на рис. 3. Для визначення Асп запропоновано використати метод багатохвильової спектрофотометрії. Методика враховує як кількість Асп, яка перейшла в середовище розчинення без розкладу, так і кіль кість Сал, що утворилася в процесі гідролізу.
Таблиця 3. Склади модельних сумішей і метрологічні характеристики визначення
кислоти ацетилсаліцилової в тесті “Розчинення”
В області 240-310 нм були виміряні питомі показники поглинання Асп, Аск та Сал. Так, як нам заздалегідь не відома кількість Сал, що утворилася, ми працювали в рамках методу найменших квадратів з використанням попередньо встановлених питомих показників поглинання, що виправдано вимогами до точності в тесті “Розчинення”.
В результаті проведеної оптимізації були обрані наступні довжини хвиль: 254, 280, 304 нм, на яких і проводилось вимірювання оптичної густини розчину.
Метрологічні характеристики запропонованої методики тесту “Розчинення” визначалися на штучних сумішах чистих субстанцій. Дані наведені в табл. 3.
Інструментальний метод оцінки колірності лікарських препаратів
Візуальна оцінка колірості широко застосовується в фармацевтичному аналізі. При цьому, в переважній більшості випадків, зміна кольору ЛП свідчить про зміну складу, що в кінцевому рахунку призводить до погіршення якості. Визначення колірості входить поряд з іншими показниками якості лікарських форм і субстанцій в діючу аналітичну нормативну документацію.
Згідно з Фармакопейним методом колір ЛП оцінюється шляхом візуального порівняння забарвлення досліджуваного розчину з серією стандартних розчинів певної кольорової шкали. Невідомий колір визначається за збігом з одним із еталонних кольорів або знаходженням проміжного стану кольору даного розчину між двома стандартними.
Всі методи візуальної оцінки якості ЛП відрізняються простотою виконання, невисокою вартістю і наочністю одержуваних результатів, але в той же час ці засоби надто суб'єктивні.
В задачу спостерігача входить визначення місця невідомого кольору на колірній шкалі. Оцінка кольорової рівності або кольорової відмінності базується на тому критерії відпо-відності, який використовується спостерігачем і залежить від його психологічного на-строю, причому в тому ступені, який надто важко визначити, а тим більш відтворити. Сприймання кольору тісно пов'язане з психологічними особливостями людини, з його особистими уявленнями, наприклад, про світле, червоне, воно не піддається контролю і не повторюється. Це призводить до того, що результати оцінки кольору розчинів можуть істотно відрізнятися один від одного внаслідок неоднаковості зору спостерігачів і відмінностей в умовах спостереження.
Більш достовірні результати можуть бути отримані при усередненні даних за оцінкою кольору безліччю спостерігачів, т.т. одержання результату, визначеного оком зі середнім або стандартним зором. Подібне усереднення не завжди можливе внаслідок трудомісткості і економічної недоцільності.
Можливим рішенням проблеми об'єктивного і надійного визначення колірності може стати перехід до запропонованого нами незалежного інструментального методу.
Визначення кольору досліджуваного розчину інструментальним методом полягає у вимірюванні спектральних характеристик цього розчину і еталонного розчину, який виступає як ЗС. В подальшому вони перетворюються в координати триколірного простору, що однозначно характеризує колір для стандартного (середнього) спостерігача. Таким чином, основна ідея запропонованого методу полягає в заміні індивідуального спостерігача з індивідуальними особливостями зору деяким середнім стандартним спостерігачем, характеристики колірного сприймання якого і є основою кольорознавства.
Колір об'єкту, який ми сприймаємо, визначається комбінацією трьох параметрів: спектральною енергією освітлення, спектральними характеристиками досліджуваного об'єкту і чутливістю ока дослідника. Всі ці параметри враховуються при переході від візуального спостереження до інструментального методу, який базується на законах кольорознавства. Основним положенням кольорознавства є поняття про тримірну природу нормального людського зору. Тоді, будь-який колір можна уявити у вигляді точки в тримірному колірному просторі і описати його положення набором колірних координат (наприклад, X,Y,Z).
Реальне сприймання кольору характеризується триколірними коефіцієнтами. Ці коефі-цієнти, що отримали назви питомих координат або функцій складання кольору, наведені на рис. 4.
Зв'язок між функцією додавання кольорів і координатами кольору має вигляд:
X = k∫λ β(λ) S(λ) x(λ)dλ
Y = k∫λ β(λ) S(λ) y(λ)dλ , (1)
Z = k∫λ β(λ) S(λ) z(λ)dλ
де: S(λ) – відносний спектральний розподіл джерела світла;
β(λ) – спектральний коефіцієнт пропускання;
k – нормувальний коефіцієнт:
| 
