|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. О.О. Богомольця
ВОДЯНИК Максим Олексійович
УДК: 616–006–002.4:616–097+542.948
КООПЕРАЦІЙНІ МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА ПРОТИ ФАКТОРА НЕКРОЗУ ПУХЛИН ЛЮДИНИ
14.03.08 – Імунологія та алергологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Чернишов Віктор Павлович,
Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН
України, керівник лабораторії імунології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Співак Микола Якович,
Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону та
імуномодуляторів
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,
Бичкова Ніна Григорівна,
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця,
головний науковий співробітник Науково-дослідного
лабораторного центру
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
Захист дисертації відбудеться 20.09.2001 року о 16 годині на засіданні Спеціалізованої Вченої Ради Д 26.003.02 Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (Київ-23, вул. Мечникова, 1, Міська клінічна лікарня № 14, корпус № 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (Київ-57, вул. Зоологічна, 3).
Автореферат розісланий 18.08.2001 року
Вчений секретар Спеціалізованої Вченої Ради
доктор медичних наук Свирид С.Г.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Важливою перевагою поліклональних антитіл (пкАт) над моноклональними (мкАт) є поліепітопна специфічність та кооперативність, тобто адаптація антитіл різної епітопної специфічності до взаємопідсилюючого зв'язування молекул антигену. Саме тому пкАт залишаються незамінними в методах по кількісному визначенню й нейтралізації цитокінів, де потрібно їх найбільш повне зв'язування незалежно від присутності цитокінзв'язуючих факторів.
Для підвищення ефективності мкАт в методах по кількісному визначенню й нейтралізації цитокінів і більш повного використання переваг гібридомної технології виявляється актуальним отримання мкАт, які здатні подібно до пкАт зв'язувати молекули цитокінів з ефектом коопераційного підсилення. Оскільки коопераційні мкАт адаптовані до високоефективного зв'язування цитокінів в умовах in vivo, їх використання в імуноферментному аналізі (ІФА) і функціональній нейтралізації цитокінів може значно підвищити ефективність даних методів і бути перспективним підходом в стандартизації ІФА-систем для визначення цитокінів. Отримання і характеристика коопераційних мкАт також дозволить вивчити механізми коопераційного зв'язування цитокінів, епітопну специфічність і нейтралізуючу активність коопераційних мкАт, що важливо для розуміння їх функціонального значення в регуляції активності цитокінів in vivo.
Як об'єкт дослідження по отриманню і характеристиці коопераційних мкАт значний інтерес являє фактор некрозу пухлин (ФНП), оскільки: (1) ФНП відіграє провідну роль у розвитку запальних процесів різної етіології, і його визначення являє значний клінічний інтерес; (2) ФНП в умовах in vivo знаходиться у складі комплексів з розчинними формами ФНП-рецепторів (рФНП-Р), і його коректне визначення можливе лише за допомогою ІФА, який виявляє рецепторзв'язаний ФНП; (3) дослідження комерційних ІФА-наборів експертною групою ВООЗ продемонструвало значну варіабельність визначення ФНП у контрольних зразках і поставило першочерговою задачею відпрацювання стандартних критеріїв, які визначають придатність мкАт для використання в ІФА; (4) нейтралізація ФНП при деяких системних аутоімунних захворюваннях має терапевтичний ефект і визначає актуальність вивчення механізмів нейтралізації ФНП препаратами мкАт.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилось в межах науководослідних робіт Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України по темах: “Виявити динаміку основних клінічних синдромів, показники імунного статусу дітей з ДЗСТ при використанні в комплексній терапії ентеросорбції, розробити вказівки і методики їх використання і оцінити ефективність” (1994-1997; № держ. реєстрації – 01.94.И034463); “Розробка методів ранньої діагностики фетоплацентарної недостатності у вагітних групи високого ризику” (1996-1998; № держ. реєстрації – ВК 20.00.03.96); “Розробити критерії імунологічного скринінгу, показання для призначення і технології використання препаратів імуномодулюючої дії рослинного і метаболічного походження для корекції порушень імунітету у дітей 2 групи здоров'я” (1997-1999; № держ. реєстрації – 01.97.И015356); “Прогноз перебігу і ускладнень ювенільного ревматоїдного артриту” (1998-2000; № держ. реєстрації – 01.98.И000722).
Meта і завдання дослідження. Отримати коопераційні мкАт до ФНП, вивчити їх імунохімічні і функціональні властивості та оцінити практичне значення коопераційних мкАт для вдосконалення методів нейтралізації і кількісного визначення ФНП.
Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні завдання:
1. Отримати панель анти-ФНП мкАт у кількості не менше 20-ти, включаючи не менше 5-ти нейтралізуючих мкАт;
2. Дати імунохімічну характеристику анти-ФНП мкАт по ізотипах Ig, епітопній специфічності та афінності;
3. Визначити нейтралізуючу активність мкАт кількісним методом і оцінити ступінь впливу епітопної специфічності та афінності мкАт на ефективність нейтралізації ФНП;
4. Провести епітопне картування рецепторзв'язуючої ділянки ФНП і вивчити механізми його нейтралізації мкАт різної епітопної специфічності;
5. Виявити пари коопераційних анти-ФНП мкАт і оцінити умови їх отримання і функціональне значення;
6. Розробити на основі коопераційних мкАт тест-систему типу ІФА для визначення ФНП в крові та інших тканинних рідинах з повним описом аналітичних характеристик і визначенням нормальних показників вмісту ФНП в крові та амніотичній рідині;
7. Провести апробацію розробленої тест-системи у клінічних дослідженнях по визначенню ФНП в крові при різних нозологічних формах дифузної хвороби сполучної тканини у дітей і в амніотичній рідині при аномаліях розвитку плаценти і плоду.
Наукова новизна одержаних результатів. Згідно імунохімічної характеристики 23 анти-ФНП мкАт вперше представлені дані про наявність трьох епітопних регіонів (ЕР) молекули ФНП (ЕР-А, -В, -С), кожен з яких містить 1 домінуючий епітоп (А1, В1, С1), представлений максимальним числом високоафінних мкАт, і 1-2 суміжних епітопи (А2, А3; В2, В3; С2), представлених окремими мкАт середньої або низької афінності.
Вперше встановлені закономірності прояви нейтралізуючої активності анти-ФНП мкАт в залежності від епітопної специфічності та афінності. Показано, що всі три епітопні регіони ФНП генерують нейтралізуючі мкАт. Активність нейтралізуючих мкАт якісно визначається епітопною специфічністю (нейтралізуючий потенціал; ЕР-А > ЕР-В > ЕР-С) і кількісно – величиною афінності мкАт (ступінь реалізації нейтралізуючого потенціалу). Для кожного ЕР визначені значення порогової афінності мкАт для мінімального прояву нейтралізуючої активності і значення достатньої афінності для прояву максимальної нейтралізації. Показано, що відсутність нейтралізуючої активності анти-ФНП мкАт може означати їх недостатню афінність для прояву ефекту нейтралізації.
За допомогою рФНП-Р вперше проведено картування рецепторзв'язуючої ділянки (РЗД) ФНП відносно ЕР нейтралізуючих мкАт і обгрунтовано існування двох механізмів нейтралізації ФНП: конкурентного і алостеричного. Конкурентний механізм опосередкований мкАт до ЕР-С1 епітопу, який міститься у межах РЗД, і полягає в прямому його екрануванні. Алостеричний механізм опосередкований мкАт, які розпізнають незалежний від РЗД ЕР-А1 епітоп, і полягає в зміні біологічноактивної конформації ФНП. Встановлено, що тільки алостеричні мкАт забезпечують еквімолярний рівень нейтралізації ФНП, причому їх ефективність не залежить від рівня чутливості клітин до ФНП. Навпаки, активність конкурентних мкАт знижується пропорційно підвищенню чутливості клітин до ФНП. На цій підставі вперше вказується на важливу перевагу алостеричного типу нейтралізації над конкурентним і пропонується за необхідне введення додаткової характеристики нейтралізуючих мкАт по механізму дії.
За допомогою скрінінг-теста на коопераційне зв'язування ФНП вперше отримані і охарактеризовані коопераційні анти-ФНП мкАт. Встановлено, що основну коопераційну пару складають нейтралізуючі мкАт алостеричного і конкурентного типу. Їх спільне використання забезпечує синергічну нейтралізацію ФНП і зв'язування ФНП, який входить до складу комплексів з рФНО-Р. На цій підставі вперше стверджується, що генерація коопераційних мкАт має спрямований характер для найбільш ефективної нейтралізації ФНП в умовах іn vivo.
Вперше документується використання коопераційних мкАт в ІФА для визначення ФНП. Розроблений варіант коопераційного ІФА позитивно відрізняє: (1) висока чутливість; (2) виявлення як вільного, так і рецепторзв'язаного ФНП; (3) мінімальна вірогідність виявлення протеолітичних фрагментів ФНП; (4) одноетапність постановки аналізу; (5) відсутність перехресної реактивності зі структурноблизькими цитокінами. На цій підставі побудова тест-систем на основі домінуючої пари коопераційних мкАт вперше пропонується як стандартний підхід у розробці уніфікованих тест-систем для виявлення цитокінів.
При вимірі вмісту ФНП в амніотичній рідині II триместру вагітності вперше показано значне його зниження при внутрішньоутробних вадах розвитку (ВВР) плода з анатомічними аномаліями (незарощення нервової трубки, аненцефалія, гідроцефалія, гастрошизис, множинні ВВР). Навпаки, при ВВР без грубих анатомічних аномалій (гідронефроз, синдром Дауна) показники ФНП були вище або не відрізнялись від норми.
Практичне значення одержаних результатів. Дана робота представляє завершений технологічний цикл отримання, характеристики і використання коопераційних мкАт. Їх значення для вдосконалення методів нейтралізації та ІФА продемонстровано на прикладі ФНП і може бути використано в аналогічних розробках по відношенню до інших білкових антигенів, зокрема цитокінів.
Встановлена синергічна нейтралізація ФНП коопераційними мкАт алостеричного і конкурентного типу має практичне значення в розробці і клінічному використанні більш ефективних препаратів нейтралізуючих мкАт проти ФНП та інших медіаторів запалення. Властивість коопераційних мкАт ефективно зв'язувати ФНП у присутності рФНО-Р може сприяти розробці стандартних ІФА діагностичного рівня для визначення ФНП та інших цитокінів.
Отримані дані відносно вмісту ФНП в сироватці крові дітей з системними аутоімунними захворюваннями представляють практичний інтерес для лікарів-педіатрів. Встановлене зниження ФНП в амніотичній рідині при анатомічних аномаліях розвитку плода представляє цінність для пренатальної діагностики.
Основні положення, що виносяться на захист:
1. Коопераційні антитіла є важливим компонентом нормальної імунної відповіді і складають механізм, за допомогою якого досягається найбільш ефективне зв'язування і функціональна нейтралізація білкових антигенів в умовах in vivo;
2. Максимальна нейтралізація ФНП, і, можливо, інших цитокінів, забезпечується коопераційними антитілами, які викликають зміну біологічноактивної конформації ФНП і екранування його рецепторзв'язуючої ділянки;
3. Використання домінуючої пари коопераційних мкАт в методах по нейтралізації і детекції одночасно з високою ефективністю також забезпечує однотипність зв'язування цитокінів і може пропонуватися як простий засіб стандартизації даних методів.
Особистий внесок автора. Обсяг робіт по отриманню, характеристиці і використанню анти-ФНП мкАт в ІФА був виконаний автором самостійно. Дослідження проводились в лабораторії імунології Інституту педіатрії, акушерства та гінекології (ІПАГ) АМН України (зав. лабораторією – докт. мед. наук, професор Чернишов В.П.). Набір клінічного матеріалу проводився у відділенні захворювань сполучної тканини (зав. відділенням – докт. мед. наук, професор Омельченко Л.І.) і відділенні пренатальної медицини ІПАГ АМН України (зав. відділенням – докт. мед. наук., професор Гордієнко І.Ю.).
Апробація роботи. Основні положення дисертації були докладені на 5-му міжнародному симпозіумі по клінічній імунології (Вашингтон, США, 1999), конференції “Сучасні імунологічні методи на службі здоров'я матері і дитини” (Київ, 1999), 1-й Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2000), 8-му міжнародному конгресі по імунології репродукції (Опатія, Хорватія, 2001).
Публікації. По темі дисертації опубліковано 10 наукових робіт (в тому числі 5 наукових статтей у виданнях, рекомендованих ВАК України).
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках комп'ютерного друку. Складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, заключення, висновків, вказівника літератури, що вміщує 223 джерела (20 вітчизняних та 203 іноземних). Ілюстрована 21 таблицею та 10 рисунками.
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Рекомбінантний ФНП людини (чистота >95%, питома активність 4 Ч 107 од/мг) отриманий від Fermentas MBI (Вільнюс, Литва) і НВО “Вектор” (Бердськ, Росія). Біологічний стандарт ФНП людини (№ 87/650) отримано з NIBCS (National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, Еngland). Високоочищені препарати р55 і р75 рФНО-Р, мкАт проти р55 (mAb №20) і р75 (mAb №13), а також анти-р55 і анти-р75 пкАт люб'язно надані проф. Wallach D. (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Всі біохімічні реагенти отримані від Sigma Chemical Co., США.
Клітинні лінії мишиної мієломи Sp2/0 і фібросаркоми L929 отримані з інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Росія). Лінії епітеліальної карциноми людини НЕр-2 і гістіоцитарної мієломи U937 отримані з інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. Клітини Sp2/0 та гібридоми культивувалися на повному середовищі IMDM з 10% ембріональної телячої сироватки (ЕСТ; Bio-Mark Inc., Львів). Клітини L929, НЕр-2 і U937 культивувалися на повному середовищі RPMI-1640 з 5% ЕСТ.
Імуноферментний аналіз виконували на спеціалізованому обладнанні фірм Wallac (Фінляндія) і Labsystems (Фінляндія). Включення 3Н-тимідину вимірювали на приладі Betaplate (Wallac). Вимірювання флуоресценції хелатів європію проводили на флуориметрі з часовим розподіленням ARCUS 1230 (Wallac). Проточну цитофлуориметрію виконували на приладі FACScan (Becton-Dickinson, США).
Миші BALB/c були імунізовані ФНП за типовою для розчинних антигенів схемою (Campbell, 1991) у варіантах підшкірної або внутрішньочеревної ін'єкції ФНП на повному ад'юванті Фрейнда. Титри анти-ФНП Ат у сироватці визначали непрямим ІФА. Спленоцити мишей з титром >1/32000 зливали 50%-м розчином поліетиленгліколю з мієломою Sp2/0. Отримання гібридом проводили за методом Kцhler і Milstein (1975) з урахуванням деяких модифікацій (Fazekas de St. Groth, Scheidegger D, 1980; Goding, 1980). Гібридоми нарощували в асцитній формі у сенсибілізованих пристаном BALB/c мишей. Препарати мкАт отримували з асцитної рідини методом послідовної преципітації каприловою кислотою та сульфатом амонію (McKinney, Parkinson, 1987) з наступною афінною очисткою на протеїн А-сефарозі (Pharmacia, Швеція). Біотинілювання мкАт проводили в реакції з сульфо-NHS-біотином (Pierce, США) в умовах, які забезпечують зв'язування 2-5 молекул біотину на молекулу IgG. Антисироватку до ФНП з титром вище 1/106 отримували від імунізованих ФНП кролів. Афінноочищені кролячі анти-ФНП пкАт отримували хроматографією IgG-фракції антисироватки на ФНП-сефарозі, яка була одержана кон'югацією ФНП з CNBr-сефарозою (Pharmacia).
Біологічну активність ФНП оцінювали за цитотоксичною дією на клітини L929 і HEp-2 у тесті з кристалічним фіолетовим (Aggarwal et al, 1985) і по апоптозному ефекту на клітини U937 у тесті з 3Н-тимідином (Higuchi et al, 1995). Нейтралізуючу активність мкАт визначали кількісно в значеннях молярного надлишку мкАт до ФНП для 100% нейтралізації або в нейтралізуючих одиницях на 1 мг мкАт. Ізотипи Ig і IgG субкласи мкАт визначали непрямим ІФА. Афінність мкАт визначали неконкурентним ІФА (Beatty et al, 1987). Картування епітопів, рецепторзв'язуючої ділянки (РЗД) ФНП і виявлення коопераційних мкАт виконували методом зворотнього конкурентного аналізу за допомогою кон'югату ФНП-європій по загальній схемі, яку запропонували Ehrlich і Moyle (1986). Для мічення ФНП використовували комерційний набір реагентів “Europium-labelling kit” (Wallac). Крім конкурентного аналізу з рФНО-Р, здатність мкАт розпізнавати рецепторзв'язаний ФНП визначали методом проточної цитофлуориметрії на клітинах U937, попередньо оброблених ФНП.
Визначення ФНП за допомогою коопераційних мкАт виконувалось в “сендвіч”-варіанті неконкурентного ІФА. Включення ФНП до складу “сендвіча” проходило в одній інкубації з парою коопераційних мкАт, які складали “нижній” і “верхній” компоненти “сендвіча”. Аналітичні характеристики розробленого ІФА визначались згідно загальноприйнятих вимог (Tijssen, 1985). Розчинні р55 та р75 ФНО-Р визначали неконкурентним ІФА (Aderka et al, 1991).
Для статистичного аналізу використовувались наступні методи: (1) тест Колмогорова-Смирнова для нормального розподілу; (2) t-тест Стьюдента і U-тест Mann-Whitney для порівняння середніх величин в непарних вибірках; (3) тест Wilcoxon для порівняння середніх величин в парних вибірках; (4) кореляційний і регресійний аналіз. Відмінності вважались достовірними при p<0.05.
Результати досліджень та їх обговорення. Для підвищення ймовірності отримання різноепітопних мкАт використовувались два типи імунізації мишей BALB/c препаратом ФНП: внутрішньочеревна і підшкірна. Відповідно до титрів анти-ФНП Ат в сироватці, ефективність підшкірної імунізації була в середньому в 2.3 рази вищою, ніж при внутрішньочеревній імунізації, що відповідало кількості отриманих гібридом від цих імунізацій – 16 і 7 відповідно.
Епітопний аналіз 23-х отриманих анти-ФНП мкАт показав, що їх специфічність розподілена в межах 3-х епітопних регіонів (ЕР) ФНП, позначених як А, В, і С. Кожен ЕР включає 2-3 епітопи, один із яких є найбільш імуногенним або домінуючим (А1, В1 і С1) згідно з більшим числом мкАт, які його представляють. Решта епітопів (А2, А3; В2, В3; С2) менш імуногенні і представлені окремими мкАт. Всі мкАт, які були отримані за допомогою внутрішньочеревної імунізації, відрізнялись моноспецифічністю до С1 епітопу, тоді як мкАт від підшкірної імунізації мали специфічність проти всіх епітопів, але з більшістю мкАт IgG ізотипу до А1 і В1 епітопів (табл. 1).
Таблиця 1. Імунохімічні та функціональні характеристики анти-ФНП мкАт
№ Клон Імуні-зація 1 Ізотип Ig Епітоп Коопера-ційні мкАт 2 Константа афінності (ґ108 М-1) Нейтралізуючі одиниці (Ч104) /мг
Епітопний регіон А
5N 3 - G2a A1 C1 (ґ 5.9) 144.2 262.3
1 1A6 4 п/ш A А1 C1 (ґ 2.5) 102.1 303.1
2 5A5 п/ш G2b А1 C1 (ґ 5.5) 35.3 7.6
3 5E12 п/ш G1 А2 B1 (ґ 2.5) 2.6 -
4 3B1 п/ш G1 А1 C1 (ґ 1.8) 2.3 -
5 2H5 п/ш G1 А1 C1 (ґ 2.3) 2.1 -
6 2B3 п/ш G1 А3 - 2.0 -
Епітопний регіон В
7 1G10 п/ш G1 В1 A2 (ґ 1.6) 131.2 54.9
8 5A12 п/ш A В2 - 20.4 33.1
9 3E9 п/ш G1 В1 A2 (ґ 2.3) 5.2 -
10 7H9 п/ш G2b В1 A2 (ґ 2.5) 3.0 -
11 3A8 п/ш G1 В3 - 0.6 -
Епітопний регіон С
12 E64 в/ч G2a С1 A1 (ґ 2.5) 13.1 54.2
13 F74 4 в/ч G1 С1 A1 (ґ 3.1) 8.9 42.8
14 С83 в/ч G2a С1 A1 (ґ 4.4) 3.7 16.7
15 F35 в/ч G2b С1 A1 (ґ 4.5) 2.4 13.2
16 D12 в/ч G2a С1 A1 (ґ 4.7) 1.9 7.7
17 3A10 п/ш A С2 - 1.5 -
18 8B1 п/ш G2b С1 A1 (ґ 4.8) 0.7 -
19 E18 в/ч G1 С1 A1 (ґ 5.0) 0.5 -
20 G77 в/ч G1 С1 A1 (ґ 5.1) 0.4 -
21 1C1 п/ш G1 С2 А1 (ґ 5.5) 0.4 -
22 1C2 п/ш M С1 - -
23 4A3 п/ш M С1 - -
Примітка: (1) – підшкірна (п/ш), внутрішньочеревна (в/ч); (2) – позначена епітопна специфіч-ність коопераційних мкАт і максимальне підсилення зв'язування ФНП у варіанті кооперації; (3) – 5N нейтралізуючі мкАт люб'язно надані Панютичем А.В. (НДІ гематології і переливання кро-ві, Мінськ, Білорусія) для порівняльного аналізу; (4) – 1А6 і F74 мкАт складають обрану пару коопераційних мкАт для розробки ІФА та оцінки нейтралізації ФНП.
Ідентифікація 3-х головних ЕР ФНП, які містять домінуючий епітоп високої імуногенності і суміжні епітопи більш низької імуногенності, дозволяє передбачати спрямований характер генерації мкАт до цих ЕР з різним ступенем реалізації. Для цього може бути дві причини. По-перше, з приводу структурних обмежень, ФНП має тільки три конформаційностійких ділянки, до яких можлива генерація високоафінних мкАт, і, по-друге, з приводу функціональних обмежень, молекула ФНП містить три ділянки, при зв'язуванні яких досягається його нейтралізація, тобто саме ефект нейтралізації ФНП виступає фактором селекції епітопного репертуару анти-ФНП антитіл. При вивченні залежності нейтралізуючої активності мкАт від їх афінності та епітопної специфічності було встановлено, що високоафінні мкАт (із Kа>109M-1) кожного ЕР є нейтралізуючими, причому у межах кожного ЕР нейтралізуюча активність окремих мкАт знижується при зниженні їх афінності саме до повної втрати ефекту нейтралізації при афінності нижче від певного рівня (табл. 1). На цій підставі правомірно стверджувати, що генерація анти-ФНП мкАт проти окремих ЕР визначається їх потенційною здатністю нейтралізувати біологічну активність ФНП, але внаслідок недостатньої афінності деяких мкАт цей ефект проявляється не завжди.
Наявність нейтралізуючих анти-ФНП мкАт різної епітопної специфічності вказує на можливість існування різних механізмів нейтралізації ФНП. Типовим є конкурентний механізм, коли мкАт розпізнають епітопи, розташовані в межах РЗД і його екрануванням блокують зв'язування ФНП з ФНП-Р. Можливим є також алостеричний механізм, коли мкАт, зв'язуючи РЗД-незалежні епітопи, провокують конформаційні зміни у РЗД і, таким чином, відміняють взаємодію ФНП з ФНП-Р. Для визначення цих механізмів проводилося картування РЗД відносно епітопів нейтралізуючих мкАт з використанням препаратів р55 і р75 розчинних ФНП-Р (рФНП-Р). Всі нейтралізуючі мкАт незалежно від епітопної специфічності повністю блокували зв'язування ФНП з рФНП-Р. Однак комплекси ФНП з рФНП-Р зв'язувались ЕР-А і ЕР-В, але не ЕР-С мкАт (рис. 1). Аналогічні результати були отримані на клітинних ФНП-Р, де ФНП, зв'язаний ФНО-Р клітин U937, розпізнавався ЕР-А і ЕР-В, але не ЕР-С мкАт. Крім того, в умовах селективної сорбції ФНП на р55 або р75 ФНП-Р було встановлено, що ЕР-А мкАт в однаковій мірі розпізнають ФНП зв'язаний як з р55, так і з р75 ФНО-Р, а ЕР-В мкАт виявляють тільки ФНП, асоційований з р75 ФНП-Р.
Рис.1. Зв'язування ФНП нейтралізуючими мкАт різної епітопної специфічності в присутності рФНП-Р. Примітка: дані для кожної епітопної групи мкАт представлені у вигляді залишкового % зв'язування ФНП в присутності рФНП-Р відносно значень контрольного зв'язування (100%) без рФНП-Р.
На цій підставі можна стверджувати, що ЕР-С розташований в межах РЗД, і нейтралізуючі ЕР-С мкАт блокують ФНП за допомогою конкурентного механізму, тоді як ЕР-А мкАт, в зв'язку з РЗД-незалежною локалізацією ЕР-А, нейтралізують ФНП алостерично. Різний характер нейтралізації ФНП у ЕР-С і ЕР-А мкАт також підтверджується наступними спостереженнями: (1) нейтралізуюча активність ЕР-С мкАт з'являється при афінності близько 108 моль-1, тоді як для нейтралізуючих ЕР-А мкАт необхідна афінність не менше, ніж 109 моль-1 (табл. 1); (2) при збільшенні афінності ЕР-С мкАт, їх нейтралізуюча активність зростає прямо пропорційно (r = 0.99; p<0.001), тоді як для ЕР-А мкАт ця залежність має непропорційний характер; (3) незважаючи на підвищені вимоги до афінності, тільки ЕР-А мкАт досягають максимального рівня нейтралізації ФНП; (4) активність нейтралізуючих ЕР-А мкАт не залежить від чутливості клітин до ФНП, тоді як активність ЕР-С мкАт, подібно рФНП-Р, знижується пропорційно підвищенню чутливості клітин (рис. 2).
Рис.2. Нейтралізуюча активність анти-ФНП мкАт і рФНП-Р на клітинах з різною чутливістю до ФНП. Примітка: представлена активність найбільш високоафінних мкАт кожного ЕР і р55 рФНП-Р в нейтралізуючих одиницях (н.о.); чутливість клітин оцінювалась як концентрація ФНП, яка викликала 50% апоптозного (U937) або цитолітичного (НЕр-2) ефекту (ЦД50); (*) – р<0.01 (по t-тесту Стьюдента) між показниками нейтралізації ФНП на клітинах U937 і НЕр-2 в кожній із епітопних груп.
Виявлення коопераційних мкАт проводилось на етапі епітопного картування. Критерієм кооперативності мкАт було підвищення зв'язування ФНП першими мкАт при наявності других більш, ніж в 1.5 рази (>150% контрольного зв'язування). Було встановлено, що мкАт, спрямовані до А1 і С1 епітопів, мають взаємопідсилююче зв'язування ФНП і складають головну коопераційну пару. При аналізі коопераційних пар, які складались із окремих А1 і С1 мкАт, відмічалось їх розділення на первинні та вторинні залежно від здатності індукувати або проявляти підсилене зв'язування ФНП відповідно. У такому варіанті кооперації найбільш вірогідним є конформаційний механізм адаптації мкАт, коли зв'язування первинних мкАт індукує конформаційні зміни молекули ФНП, що призводять до більш вигідної експозиції епітопів вторинних мкАт (Sabat et al, 1996). Оскільки А1 і С1 мкАт представлені як первинними, так і вторинними мкАт, а також враховуючи максимальну імуногенність А1 і С1 епітопів, правомірно стверджувати, що, по-перше, А1 і С1 епітопи є конформаційнозалежними, тобто зв'язування одного епітопа викликає конформаційні зміни у ділянці локалізації іншого, і, по-друге, переважна генерація Ат до цих епітопів відображає процес приоритетної селекції коопераційних Ат, які забезпечують конформаційну деформацію ФНП. Виходячи із функціональних характеристик коопераційних мкАт, можна пояснити значення цього феномену. За належностю до ЕР-А і ЕР-С, коопераційні А1 і С1 мкАт представляють два типи нейтралізуючих мкАт: алостеричні і конкурентні. Тому їх кооперативність може мати значення для більш ефективної нейтралізації ФНП в умовах in vivo, де потенційно активний ФНП знаходиться в зв'язаному з рФНП-Р стані (Aderka et al, 1992). Підтвердженням цьому є наступні ефекти коопераційних А1 і С1 мкАт, що спостерігаються при їх змішуванні: (1) синергічна нейтралізація ФНП (рис. 3); (2) в 50-100 разів більша ефективність зв'язування ФНП в присутності рФНП-Р (рис. 4).
Рис.3. Синергічна нейтралізація ФНП коопераційними А1 і С1 мкАт. Примітка: ефект суміші мкАт в експерименті порівнювався з розрахованим рівнем аддитивної нейтралізації (на клітинах L929), де (*) – р<0.01 (по t-тесту Стьюдента).
Коопераційні А1 (1А6) і С1 (F74) мкАт були використані в ІФА для визначення ФНП, кий згідно складаючих мкАт, був названий коопераційним. Розроблений ІФА позитивно характеризує висока чутливість (2 пг/мл), одноетапність постановки аналізу і висока резистентність до інгибуючого ефекту рФНП-Р (рис. 4). Аналітичні тести виявили допустимі значення варіабельності у межах однієї постановки (intra-CV=4.2±2.0%) і між постановками (inter-CV= 5.4±2.4%), лінійний динамічний діапазон до 200 пг/мл (рис. 5), відсутність перехресної реактивності зі структурно та функціонально близькими цитокінами (ЛТa, ІЛ-1a/b, ІЛ-2, ІЛ-8, ІФНa/b/g, ТФРb, ФНП миші) і високу ефективність виявлення ФНП в плазмі крові (86.2±9.1%) та амніотичній рідині (98.5±4.8%).
Рис.4. Ефективне виявлення рФНП-Р-зв'язаного ФНП в умовах коопераційної взаємодії А1 і С1 мкАт. Примітка: Виявлення ФНП (50 пг/мл) в зразках, що містять рФНП-Р, проводилось в варіантах одноетапної і послідовної постановок ІФА, де припускалась (К+) і виключалась (К-) коопераційна взаємодія мкАт відповідно. Для сорбції ФНП використовувались F74 мкАт, для детекції – 1А6 мкАт. Виявляємі концентрації ФНП розраховувались за калібровочною кривою стандарту ФНП і представлялись як процент від його первинного вмісту (% зв'язаного ФНП).
Коопераційним ІФА визначались нормальні показники ФНП в ЕДТА-плазмі крові і амніотичній рідині. Рівень ФНП в амніотичній рідині (15-22 тиж.) складав 25.2±9.9 пг/мл (медіана: 22.5 пг/мл), в плазмі дітей (вік: 7-17 років) – 7.9±7.7 пг/мл (медіана: 4.9 пг/мл), в плазмі дорослих (вік: 20-38 років) – 16.0±8.0 пг/мл (медіана: 14.6 пг/мл). Верхня межа нормального діапазону в плазмі (по 95% довірчому інтервалу) склала 25 пг/мл у дітей і 35 пг/мл у дорослих. Значення верхньої межі нормального діапазону у дорослих відповідає данним інших варіантів ІФА, які описані в літературі: 35 пг/мл (Michie et al, 1988); 39 пг/мл (Turpeinen et al, 1994); 34 пг/мл (Lamb et al, 1992); 40 пг/мл (Teppo et al, 1987).
Для апробації коопераційного ІФА проводилось визначення ФНП у дітей з дифузними захворюваннями сполучної тканини (ДЗСТ): дерматоміозит, системний червоний вовчак, ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА), недиференційована форма ДЗСТ. Згідно відомих даних про патогенетичну роль ФНП при системних аутоімунних захворюваннях (Cope et al, 1995; Moore, 1999) розробленим ІФА виявлялись підвищені концентрації ФНП в крові при всіх нозологічних формах ДЗСТ, причому абсолютні показники ФНП корелювали зі ступенем системної маніфестації запального процесу. На прикладі динаміки лікування хворих ЮРА по-казано, що визначення ФНП має прогностичне значення для оцінки ефективності протизапальної терапії. На відміну від рФНП-Р, які суттєво не змінювались за період лікування, показники ФНП як більш динамічні знижувались до нормальних значень протягом 2-х тижневого курсу лікування цитостатичними препаратами і/або кортикостероїдами. Таким чином, визначення ФНП в динаміці імуносупресивної терапії дозволяє в мінімальний строк оцінити її ефективність.
Рис.5. Стандартна крива і показники варіабельності коопераційного ІФА. Примітка: по осі Y1 – оптична щільність при 450 нм (ОЩ); по осі Y2 – коефіцієнт варіації в % (СV).
Визначення ФНП в амніотичній рідині проводилось в групах жінок з фетоплацентарною недостатністю (ФПН) і внутрішньоутробними вадами розвитку (ВВР) плода. Згідно літературних даних про підвищення рівнів ФНП при загрозі розвитку прееклампсії (Kupferminc et al, 1994), нашим ІФА виявлялось підвищення рівня ФНП при ФПН. Навпаки, при ВВР плода спостерігалось значне зниження ФНП, яке вибірково виявлялось в групі летальних і/або умовнолетальних ВВР з грубими анатомічними аномаліями, тоді як при ВВР без дефектів анатомічної будови показники ФНП були в межах норми або навіть підвищеними (табл. 2). Прямих аналогій цьому феномену в літературі не виявлено. Однак ці дані відповідають ряду експериментальних робіт, що вказують на важливу роль ФНП в процесах нормального ембріогенезу (Wride, Sanders, 1995).
Таблиця 2. Показники ФНП, р55 і р75 рФНП-Р в амніотичній рідині другого триместру вагітності при внутрішньоутробних вадах розвитку (ВВР) плода
Група (n) ФНП (пг/мг) р55 рФНП-Р (нг/мг) р75 рФНП-Р (нг/мг)
Контроль (27) 4.4 ± 0.4 4.5 ± 0.4 1.4 ± 0.1
Летальні ВВР
ВВР ЦНС (10) 1.6 ± 0.3 4.1 ± 0.7 1.4 ± 0.3
Множинні ВВР (5) 0.9 ± 0.2 2.5 ± 0.5 1.0 ± 0.1
Гастрошизис (3) 1.2 ± 0.4 3.8 ± 0.5 1.3 ± 0.3
М ± m (18) 1.3 ± 0.2*** 3.7 ± 0.4* 1.3 ± 0.2
М ± m (8; без ВВР ЦНС) 1.0 ± 0.2*** 3.2 ± 0.4* 1.1 ± 0.1*
Нелетальні ВВР
Гідронефроз (4) 5.2 ± 0.5 5.5 ± 0.6 2.2 ± 0.3
Синдром Дауна (3) 4.6 ± 1.7 4.7 ± 1.0 1.8 ± 0.1
М ± m (7) 4.9 ± 0.7 5.2 ± 0.4 2.0 ± 0.2**
Примітка: дані представлені як відносні концентрації на 1 мг загального білку; *р<0.05, **р<0.01, ***р<0.001 (по U-тесту Mann-Whitney) відносно контрольних значень в групі здорових вагітних (контроль).
ВИСНОВКИ
1. Епітопна структура молекули ФНП містить три головних епітопних регіони (ЕР): А, В і С. ЕР-С розташований в межах рецепторзв'язуючої ділянки (РЗД) ФНП. ЕР-В частково перекриває РЗД, а ЕР-А має РЗД-незалежну локалізацію. Структура кожного ЕР включає домінуючий епітоп (А1, В1, С1), який представлений найбільшою кількістю високоафінних мкАт, і 1-2 суміжних епітопи (А2, А3; В2, В3; С2), які представлені мкАт з середньою або низькою афінністю.
2. Епітопна специфічність анти-ФНП мкАт залежить від типу імунізації. Внутрішньочеревна імунізація призводить до моноспецифічності мкАт проти ЕР-С. Підшкірна імунізація надає повне різноманіття мкАт проти всіх ЕР, але без високоафінних мкАт до ЕР-С.
3. Всі ЕР ФНП представлені нейтралізуючими мкАт, які чітко відповідають найбільш високоафінним мкАт в кожному із ЕР. Згідно локалізації ЕР, нейтралізуючі мкАт розподіляються на два типа по механізму нейтралізації ФНП. ЕР-С представляє нейтралізуючі мкАт конкурентного типу, ефект яких проявляється внаслідок екранування РЗД. ЕР-А містить мкАт алостеричного типу, які викликають нейтралізацію ФНП зміною його біологічноактивної конформації.
4. Нейтралізуюча активність анти-ФНП мкАт може попередньо оцінюватись по їх епітопній специфічності і афінності. Епітопна специфічність визначає потенціальну активність, тоді як ступінь її реалізації визначається величиною афінності мкАт. Максимальну активність мають алостеричні А1 мкАт. Їх активність проявляється при афінності біля 109М-1 і досягає еквімолярного рівня нейтралізації ФНП (мкАт:ФНП = 1 : 1) при афінності більш 1010М-1. Середню нейтралізуючу активність мають В1 мкАт. При аналогічних вимогах до афінності їх рівень нейтралізації не перевищує співвідношення 10:1. Мінімально активними є С1 мкАт конкурентного типу. Їх активність проявляється при афінності біля 108 М-1 і досягає молярного співвідношення 30:1 при афінності біля 109 М-1.
5. Алостеричні мкАт мають принципову перевагу над конкурентними по ефективності нейтралізації ФНП в клітинних системах з різною чутливістю до дії ФНП. З підвищенням чутливості клітин ефективність нейтралізації ФНП алостеричними А1 мкАт залишається постійною, тоді як ефективність конкурентних С1 мкАт пропорційно знижується.
6. Основна пара коопераційних анти-ФНП мкАт складається з А1 і С1 мкАт і у відповідності до їх епітопної специфічності представляє нейтралізуючі мкАт конкурентного і алостеричного типу. Механізм коопераційної взаємодії мкАт полягає в їх конформаційній адаптації. Згідно внеску в кооперацію як А1, так і С1 мкАт поділяються на первинні та вторинні. Первинні мкАт індукують, а вторинні проявляють підсилене зв'язування ФНП. Функціональне значення зв'язування ФНП коопераційними А1 і С1 мкАт полягає в комплементарному поєднанні алостеричної і конкурентної нейтралізації, що має значення для найбільш ефективної нейтралізації ФНП в умовах in vivo, де ФНП знаходиться в зв'язаній з рФНП-Р формі. Цьому сприяє зв'язування ФНП коопераційними мкАт із складу комплексів з рФНП-Р.
7. Розроблений на основі коопераційних мкАт неконкурентний варіант ІФА для визначення ФНП вигідно відрізняє одностадійність постановки аналізу, висока чутливість і здатність ефективно виявляти рФНП-Р-асоційований ФНП. Решта аналітичних характеристик відповідають загальноприйнятим вимогам до ІФА неконкурентного типу. Результати проведених досліджень свідчать про придатність розробленого ІФА для визначення ФНП у клінічних дослідженнях.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Flow cytometric detection of two types of tumor necrosis factor alpha (TNF) receptors by biotinamidocaproyl-TNF in human tumor cells // Experimental Oncology. – 1995. – V.17. – Р.11-17 (coauth. Gumenyuk М.Е., Slukvin I.I., Chernyshov V.P.).
2. Клініко-імунологічні паралелі у дітей, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит // Педіатрія, акушерство та гінекологія. – 1998. – №6. – С.31-35 (співавт. Дудка І.В., Омельченко Т.А., Вихованець Е.В.).
3. Вивчення вмісту фактора некрозу пухлин в крові дітей, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит // Педіатрія, акушерство та гінекологія. – 1999. – №2. – С.20-23 (співавт. Омельченко Л.І., Чернишов В.П., Дудка І.В., Омельченко Т.А.).
4. Time-resolved fluorometry-based immunoassay for whole blood TNF production in antibody-coated incubation plates // Clinical Immunology. – 1999. – V.90. – P.478 (coauth. Chernyshov V.P., Grekova S.P.).
5. Значение абсолютных и относительных показателей циркулирующих фактора некроза опухолей (ФНО) и растворимых ФНО-рецепторов (рФНО-Р) для дифференциальной диагностики нозологических форм коллагенозов у детей // Матеріали I Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 31.03 – 01.04.2000 року). – К.: Ін-т геронтології АМНУ. – 2000. – С. 21-22 (співавт. Людвик Т.А.).
6. Фактор некроза опухолей (ФНО) и растворимые ФНО-рецепторы в амниотической жидкости II триместра беременности при внутриутробных пороках развития плода // Матеріали I Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'ті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 31.03 – 01.04. 2000 ро-ку). –К.: Ін-т геронтології АМНУ. – 2000. – С. 30-31 (співавт. Грекова С.П.).
7. Фактор некрозу пухлин та розчинні рецептори до нього в амніотичній рідині вагітних жінок при вроджених вадах розвитку плода і плаценти // Перинатологія та педіатрія. – 2000. – №3. – С.11-13 (співавт. Сопко Н.І., Гайдай Г.Л., Чернишов В.П., Грекова С.П.).
8. Функціональні властивості коопераційних моноклональних антитіл проти фактора некрозу пухлин людини // Фізіологічний журнал. – 2001. – 47. – № 3. – С.73-79 (співавт. Чернишов В.П., Гуменюк М.Є.).
9. Decreased levels of amniotic fluid tumor necrosis factor in embryos with lethal congenital malformations // American Journal of Reproductive Immunology. – 2001. – V.46. – №1. – Р.95 (сoauth. Chernyshov V.P., Grekova S.P., Sopko N.I., Gordienko I.Yu.).
10. Cooperative neutralizing monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor // Scandinavian Journal of Immunology. – 2001. – V.54 (Suppl.1). – P.95 (сoauth. Chernyshov V.P., Gumenyuk M.E.).
АНОТАЦІЯ
Водяник М.О. “Коопераційні моноклональні антитіла проти фактора некрозу пухлин людини”. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.08 – Імунологія та алергологія. – Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2001.
Дисертація присвячена вивченню функціональних і імунохімічних властивостей моноклональних антитіл (мкАт), які мають взаємопідсилююче або коопераційне зв'язування молекул антигену. На прикладі отриманих 23 мкАт проти фактора некрозу пухлин (ФНП) встановлено, що генерація коопераційних мкАт має селективну перевагу, і більшість із анти-ФНП мкАт належать за специфічністю до двох коопераційних епітопів А1 і С1. За функціональними властивостями коопераційні анти-ФНП мкАт складають два типи нейтралізуючих мкАт. С1 мкАт є нейтралізуючими антитілами конкурентного типу, ефект яких проявляється внаслідок екранування рецепторзв'язуючої ділянки ФНП, а А1 складають мкАт алостеричного типу, які викликають нейтралізацію ФНП зміною його біологічноактивної конформації. Спільне використання А1 і С1 мкАт забезпечує синергічну нейтралізацію ФНП і його ефективне зв'язування зі складу комплексів з розчинними ФНП рецепторами. Ці властивості дозволили розробити на основі А1 і С1 мкАт максимально ефективні методи детекції і нейтралізації ФНП. Використання антитіл зі складу головної коопераційної пари забезпечує однотипність зв'язування антигенів, що може бути використано в вирішенні актуального питання стандартизації тест-систем для визначення цитокінів.
Ключові слова: Моноклональні антитіла, коопераційні антитіла, фактор некрозу пухлин, нейтралізуючі антитіла, імуноферментний аналіз.
АННОТАЦИЯ
Водяник М.А. “Кооперативные моноклональные антитела против фактора некроза опухолей человека”. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.08 – Иммунология и аллергология. – Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца МЗ Украины, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению функциональных и иммунохимических свойств моноклональных антител (мкАт), обладающих взаимоусиливающим или кооперативным связыванием молекул антигена. В исследованиях использованы полученные методом гибридомной технологии 23 мкАт против фактора некроза опухолей человека (ФНО). На основании их иммунохимической характеристики представлены данные о наличии трех эпитопных регионов (ЭР) молекулы ФНО (ЭР-А, -В, -С), каждый из которых включает 1 доминирующий эпитоп (А1, В1, С1), представленный максимальным числом высокоаффинных мкАт, и 1-2 прилегающих эпитопа (А2, А3; В2, В3; С2) представленных единичными мкАт средней или низкой аффинности.
Установлены закономерности проявления нейтрализующей активности анти-ФНО мкАт в зависимости от эпитопной специфичности и аффинности. Показано, что все три ЭР ФНО представлены нейтрализующими мкАт, которые строго соответствуют наиболее высоко-аффинным мкАт в каждом из ЭР. Активность нейтрализующих мкАт качественно определяется эпитопной специфичностью (ЭР-А > ЭР-В > ЭР-С) и количественно величиной аффинности мкАт. Для каждого ЭР определены значения пороговой аффинности мкАт для минимального проявления нейтрализующей активности и значения достаточной аффинности для проявления максимальной нейтрализации. Показано, что отсутствие нейтрализующей активности анти-ФНО мкАт может означать их недостаточную аффинность для проявления эффекта нейтрализации.
С помощью растворимых форм ФНО-рецепторов (рФНО-Р) проведено картирование рецептор-связывающего участка (РСУ) ФНО относительно ЭР нейтрализующих мкАт и обосновано существование двух механизмов нейтрализации ФНО: конкурентного и аллостерического. Конкурентный механизм опосредован мкАт, направленными к расположенному в пределах РСУ С1 эпитопу, и состоит в его прямом экранировании. Аллостерический механизм опосредован мкАт, распознающими независимый от РСУ А1 эпитоп, и заключается в индукции конформационных изменений ФНО. Установлено, что только аллостерические А1 мкАт обеспечивают эквимолярный уровень нейтрализации ФНО, причем их эффективность не зависит от уровня чувствительности клеток к ФНО. Напротив, активность конкурентных С1 мкАт снижается пропорционально повышению чувствительности клеток к ФНО. На этом основании указывается на важное преимущество аллостерического типа нейтрализации над конкурентным и предлагается необходимым введение дополнительной характеристики нейтрализующих мкАт по механизму действия.
Путем применения скрининг-теста на кооперативное связывание ФНО впервые получены и охарактеризованы кооперативные анти-ФНО мкАт. Обнаружено, что основную пару кооперативных мкАт составляют нейтрализующие мкАт аллостерического и конкурентного типа. Их совместное применение обеспечивает синергичную нейтрализацию ФНО и полное связывание ФНО из состава комплексов с рФНО-Р. На этом основании утверждается, что генерация кооперативных Ат имеет направленный характер для наиболее эффективной нейтрализации ФНО в условиях in vivo.
Впервые документируется использование кооперативных мкАт в иммуноферментном анализе (ИФА) для определения ФНО. Разработанный вариант кооперативного ИФА положительно характеризует: (1) высокая чувствительность (2 пг/мл); (2) выявление как свободной, так и рФНО-Р-связанной формы ФНО; (3) минимальная вероятность выявления протеолитических фрагментов ФНО; (4) одноэтапность постановки анализа; (5) отсутствие перекрестной реактивности со структурно-близкими цитокинами. Построение ИФА на основе наиболее высоко-аффинных мкАт из состава доминирующей кооперативной пары, наряду с высокой эффективностью, также обеспечивает однотипность связывания антигенов и может выступать методическим подходом для разработки стандартных ИФА-систем для определения цитокинов.
Ключевые слова: Моноклональные антитела, кооперативные антитела, фактор некроза опухолей, нейтрализующие антитела, иммуноферментный анализ.
| 
