Библиотечный каталог авторефератов Украины

Міністерство охорони здоров’я України

Національний медичний університет імені О. О. Богомольця

КОВАЛЮК Олена Володимирівна

удк 616.988:578.828.6-053.31.085.37:577.245

ІНТЕРФЕРОНОГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ РОТАВІРУСІВ
ТА СТАН СИСТЕМИ ІНТЕРФЕРОНУ
У НОВОНАРОДЖЕНИХ ДІТЕЙ
ПРИ РОТАВІРУСНІЙ ІНФЕКЦІЇ

03.00.06 — вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київській медичній академії післядипломної освіти

ім. П. Л. Шупика МОЗ України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Київ­ська медична академія післядипломної освіти ім. П. Л. Шупика МОЗ України, завідуюча кафедри вірусології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Рибалко Світлана Леонтіївна, Інститут епідеміо­ло­гії та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України, завідуюча лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів

доктор медичних наук, доцент Криворутченко Юрій Леонідович, Кримський державний медичний університет ім. С. І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Провідна установа

Вінницький національний медичний університет ім. М. І. Пирогова, кафедра мікробіології, вірусології та імунології, МОЗ України,
м. Вінниця

Захист відбудеться “  1 ” квітня 2004 р. о 15-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 при Національному медичному­ університеті імені О. О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, проспект Перемоги,­ 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №2

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О. О. Богомольця за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоо­ло­­гічна,­ 1

Автореферат розісланий “ 1 7 ” лютого 2004 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради                                                                     Є. М. Анісімов

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ротавірусна інфекція (РВІ) і в ХХІ столітті залиша­ється складною медико-соціальною проблемою. Це зумовлено, в першу чергу, її значною поширеністю, досить високими показниками захворюваності та смертності, а також, суттєвими економічними втратами внаслідок цього захворювання. За даними ВООЗ щорічно в світі реєструється до 125 млн випадків РВІ, з яких 600–900 тис. завершуються летально, що становить практично одну чверть від усіх смертельних випадків серед хворих на діарею. У США у дітей віком від 1 до 4 років реєструється понад 1 млн випад­ків тяжких ротавірусних діарей, з яких 125–150 випадків на рік закінчуються летально. За даними російських вчених, в РФ щорічно реєструється близько 2 млн випадків ГКІ, серед яких майже 15% — ротавірусні гастроентерити (Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В., 2000; Боковой А.Г., 2001).

В Україні питома вага ротавірусного гастроентериту в структурі ГКІ у дітей рік від року зростає. Різке підвищення захворюваності на ротавірусний гастроентерит реєструється у зимовий період і особливо тривало утримується на високому рівні у віковій групі 1–3 роки (Синяк К.М., Ги­рін В.М., 1998). Зареєстровані у 1995–1996, 2003 рр. у Києві спалахи внут­рішньо­лікарняної РВІ та спалах водного походження в Одесі у 2000–2001 рр. із залученням до епідемічного процесу великої кількості людей різних вікових груп, зумовлюють існування загрози виникнення нових спалахів та підкреслюють актуальність цієї інфекції (Шунько Є.Є. і співавт., 1998; Бондаренко В.І., Задорожна В.І., Дзюблик І.В., 2002).

Широкі клініко-лабораторні та епідеміологічні дослідження, проведені за останні роки у світі, суттєво поглибили знання щодо природи та властиво­стей збудника, особливості репродукції, клінічні прояви інфекції та її основні епідеміологічні характеристики (Estes M.E., Kapikian A.Z., 1996; Гирін В.М., Дзюблик І.В., Шунько Є.Є., 2001). Разом з тим, інтерфероногенні властивості ротавірусів залишаються ще не дослідженими.

Аналіз штамів ротавірусів, виділених в різних регіонах світу, свідчить про широку циркуляцію трьох із семи серологічних груп РВ — А, В і С, що відрізняються за своїми біологічними властивостями та здатністю викликати­ важкі форми захворювання у людей різних вікових груп. Особливо вразливим контингеном є новонароджені діти, які з перших днів свого існування вже зустрічаються із ротаві­русами, що зумовлюють розвиток нозокомеальної інфекції в акушерських відділеннях та відділеннях інтенсивної терапії (Glass R., Lang D., Compans R., 1996; Шунько Є.Є., Дзюблик І.В., 1999).

Сьогодні значна кількість дітей вже з перших днів знаходяться на штуч­ному годуванні, що лишає їх змоги отримання від матері пасивного імунітету і, тим самим, захисту від ротавірусів. Аналіз факторів ризику розвитку РВІ у новонароджених дітей свідчить про наявність сильного корелятивного зв’язку між штучним вигодовуванням дитини та розвитком захворювання.

Між імунною системою та системою інтерферону (ІФН) існують тісні прямі та зворотні зв’язки. Саме системі ІФН належить провідна роль у збереженні гомео­стазу організму людини. Зважаючи на противірусні та численні імуномодуляторні ефекти, згідно сучасних уявлень, ІФН розглядають як інтегральну частину захисної системи організму проти вірусних інфекцій (Ершов Ф.И., 1998; Park E., Levis W.R. et. al., 2000; Рибалко С.Л., 2001; Співак М.Я., 2002).

Незважаючи на велику кількість наукових праць, присвячених вивченню стану системи ІФН при різних вірусних інфекціях, робіт, в яких були визначені особливості ІФН статусу, як об’єктивного показника ролі системи ІФН у новонароджених дітей при РВІ практично немає. Відсутність наукової інформації про кількісні параметри системи ІФН при РВІ не дозволяє надійно прогнозувати пере­біг захворювання та дати обгрунтовані рекомендації щодо клінічного застосування лікарських форм ІФН в комплексній терапії при РВІ, хоча перший досвід клініч­ного використання рекомбінантних препаратів ІФН при ротавірусних діареях є обна­дій­ливим (Феклісова Л.В. та співавт., 1996).

Незважаючи на досягнення у вирішенні проблеми РВІ, існує широке коло невирішених питань, які стосуються інтерфероногенних властивостей збудника, визначення показників ІФН статусу при РВІ та ефективності застосування вітчизняних препаратів рекомбінантного α2-ІФН при РВІ, що обумовлює актуальність і новизну даного дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація вико­нана у рамках науково-дослідних робіт кафедри вірусології КМАПО ім. П.Л.Шу­пика МОЗ України: № держреєстрації — 0199UО00213 “Вивчення імуномодулюючих властивостей МКП і природних сорбційних препаратів як специфічних так і неспецифічних засобів профілактики і лікування вірусних інфекцій” (термін виконання 1999–2003 рр.); № держреєстрації 0100U0 00618 “Розробка і вдосконалення методів клінічної діагностики, інтенсивної терапії і виходжування новонароджених, профілактика пери- і неонатальної патології” (2000–2004 рр.) та в рамках завдання Міжгалузевої комплексної програми “Здоров’я нації” № держреєстрації — 0102U001133 “Ротавірусна інфекція: особливості етіології, патоімуногенезу та епідеміології у дітей на сучасному етапі, розробка експериментально-теоретичних основ створення нових профілактичних і лікувальних препаратів, визначення принципів їх практичного застосування” (2002–2006 рр.). Пошукачем у даних комплексних темах виконані окремі фрагменти досліджень.

Мета і задачі дослідження. Мета даної роботи полягала в оцінці інтерфероногенних властивостей ротавірусів та стану системи ІФН у новонароджених з ротаві­русною інфекцією для наукового обгрунтування застосування вітчизняних препаратів рекомбінантного α2-ІФН в комплексній терапії ротавірусної інфекції у ново­- народ­жених дітей.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі.

1. Вивчити інтерфероногенні властивості ротавірусів в умовах експерименту на мишах in vivo.

2. Дослідити в динаміці ІФН статус у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією за рівнем циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатністю лейкоцитів крові до продукції альфа-ІФН (α-ІФН) та гама-ІФН (γ-ІФН) в умовах in vitro.

3. Визначити рівень циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатність лейкоцитів крові in vitro до продукції α-ІФН та γ-ІФН у ново­народжених дітей з ротавірусною інфекцією при комплексному лікуван­ні з використанням вітчизняних препаратів рекомбінантного α2-ІФН .

4. Проаналізувати вплив інтерферонотерапії із застосуванням вітчизняних препаратів рекомбінантного α2-ІФН на клінічний перебіг і функціональний стан системи ІФН у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією.

5. Розробити оптимальні підходи до лабораторної діагностики ротавірусної ін­фекції у новонароджених дітей.

Об’єкт дослідження: доношені та недоноше­ні новонароджені діти, хворі на РВІ; лабораторні тварини (нелінійні миші).

Предмет дослідження: ротавіруси людини та тварин; ІФН статус новонароджених дітей, хворих на РВІ; клітинні культури; матеріал від лабораторних тварин (сироватка крові).

Методи дослідження: експериментальні, вірусологічні, серологічні, клі­ніч­ні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено стан системи ІФН через комплекс оціночних тестів “ІФН статус” у новонароджених дітей з клінічно вираженою та безсимптомною РВІ за рівнем циркулюючого ендогенного ІФН в крові, здатністю лейкоцитів крові до продукції α-ІФН та γ-ІФН та їх прогнозуючу здатність по відношенню до перебігу інфекції. Обгрунтовано ректальне застосування препаратів рекомбінантного α2-ІФН в комплексній терапії РВІ у новонароджених, яке повинно здійснюватися під контролем оціночних тестів ІФН статусу та вірусологічним контролем за елімінацією збудника.

Отримані новітні данні про інтерфероногенні властивості ротавірусів людини і тварин в експерименті на мишах in vivo. Вивчена динаміка та дозазалежний ефект індукції ІФН 5 штамів ротавірусів (HRV-134, SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К). Доведено дозазалежний ефект індукції ІФН. Для індукції ІФН in vivo визначена опти­мальна доза ротавірусу — 5–6 lg ID50. Встановлена наявність слабких інтерфероно­генних властивостей у інфекцій­но активних ротавірусів штамів (HRV-134, SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К), які були значно нижчими, ніж у інактивованого ротавірусу SA-11 та у відомих індукторів ІФН, зокрема вірусу хвороби Н’юкасла, полігуацилу, пірогеналу. Розроблена методика інактивації ротавірусу SA-11  за допомогою сполуки цис-дихлородіамінплатини з ДНК (МКП). Показано, що інактивація ротавірусу МКП, що супроводжується утворенням мультимерного комплекса, сприяє підвищенню його інтерфероногенних властивостей у 100 разів. В порівняльних дослідженнях інактивованого штаму ротавірусу SA-11–МКП з інфекційно активним штамом ротавірусу SA-11 в динаміці визначена індукція ІФН, яка найбільш активно здійснюється через 8 годин. Найбільш активним індуктором ІФН є ротавірус, інактивований МКП.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено новий метод інактивації ротавірусів за допомогою МКП, що може знайти впровадження у біотехнології отримання високоактивних лейкоцитарних ІФН. Запропоновано алгоритм лабораторної діагностики РВІ у новонароджених дітей. Враховуючи особливості забору крові у немовлят, модифіковано і впроваджено мікрометод визначення ІФН статусу у пробах цільної крові. Запропоновано та впроваджено у практику проведення моніторингу РВІ у новонароджених з перинатальною патологією.

За матеріалами дисертації у співавторстві надруковані та впроваджені у роботу багатьох вірусологічних лабораторій СЕС 5 методичних рекомендацій: “Лабора­торна діагностика ротавірусної інфекції” (Київ, 2002 р.), “Ін­тер­фероновий статус людини при вірусних інфекціях” (Київ, 2002 р.), “Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної віру­со­ло­гічної лабораторії” (Київ, 2003 р.), “Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції” (Київ, 2003 р.), “Ротавірусна інфекція: клініка, діагностика і комплексна терапія” (Київ, 2003 р.). За матеріалами дисертації видані 2 ін­формаційні листи: “Моніторинг ротавірусної інфекції у новонароджених з перинатальною патологією” (№71–2002) та “Викорис­тання лаферону в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених” (№13–2004).

Результати досліджень впроваджені у педагогічний процес кафедр вірусології та неонатології КМАПО ім. П.Л.Шупика, у роботу лікувально-профілактичних та санітарно-епідеміологічних закладів України.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Власноруч проведено вірусологічне та серологічне обстеження в динаміці 168 новонароджених дітей, визначені показники ІФН статусу в динаміці у 153 новонароджених, які знаходились у фізіологічному відділенні новонароджених акушерського стаціонару та у спеціалізованих відділеннях патології ново­народжених і недоношених дітей УКСДЛ “ОХМАТДИТ” м. Києва у період з 2000 по 2002 роки.

Розроблено алгоритм лабораторної діагностики РВІ у новонароджених.

Автором визначені показники ІФН статусу у новонароджених дітей з РВІ. Особисто проведенні експериментальні дослідження при визначенні інтерфероно­генних властивостей ротавірусів на лабораторних тваринах.

Здобувачем самостійно проведено систематизацію і узагальнення отриманих даних, їх статистичну обробку та спільно з науковим керівником сформульовано висновки.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на науково-практичній конференції “Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці” (Київ, 2001 р.); ІІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2001 р.); ІІІ науково-практичній медичній конференції “Сучасні проблеми клінічної фармакології, імунопрофілактики та імунотерапії”, присвяченій 160-річчю Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (Київ, 2001 р.); нараді-семінарі лікарів-вірусологів “Сучасні методи діагностики поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій” (Київ, 2002 р.); нараді-семінарі з актуальних питань роботи епідеміологічних відділів і вірусологічних лабораторій установ державної санепідслужби МОЗ України (Дніп­ро­­петровськ, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002 р.); науково-практичній конференції “Актуальні аспекти ротавірусної інфекції на сучасному етапі” (Київ, 2003 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 11 науко­вих працях, в тому числі 7 статтях у наукових фахових виданнях, що входять до пе­реліку, затвердженого ВАК України і тезах 4 вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, виснов­ків, списку використаних джерел із 277 найменувань (185 вітчизняних і країн СНД та 92 іноземних) та додатків (15). Робота викладена на 174 сторінках (основний текст на 112 сторінках), ілюстрована 23 таблицями, 23 рисунками, 2 фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об’єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, розкрите теоретичне та практичне значення роботи, визначено особистий внесок автора, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури представлені новітні погляди на ротавіруси, їх властивості, патогенез та роль системи ІФН при РВІ. Наведені сучасні концепції клініки і лікування РВІ. Критичний огляд літератури висвітлив відсутність науково­ обгрунтованої інформації, щодо функціонального стану­ системи ІФН при РВІ у новонароджених дітей та ефективності застосування рекомбінантного α2-ІФН при РВІ у немовлят, що зумовлює необхідність проведення наукових досліджень з даної проблеми.

Матеріали та методи досліджень. Під час виконання роботи використано 460 білих нелінійних мишей масою тіла 18±2 г, клінічний матеріал (кров та фекалії) від 168 новонароджених дітей віком від 1 до 30-ї доби життя, 1 первинно-трипсинізована культура клітин (ФЕК) та 4 перещеплювані лінії клітинних культур (НЕр-2, Vero, СНЕВ, L-929).

У роботі було використано мавпячий ротавірус штам SA-11 (ІА-105 ТЦД50/мл), отриманий з лабораторії етіології, епідеміології і профілактики ентеровірусних інфекцій Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова РАМН; ротавіруси великої рогатої худоби – штами Лінкольн (ІА-104 ТЦД50/мл), Тіверваль (ІА-105 ТЦД50/мл), свиней – штам К (ІА-106 ТЦД50/мл), отримані з Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук та ротавірус людини штам HRV-134 (ІА-103 ТЦД50/мл), який одержано з музею віру­сів лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфек­цій інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України.

ВВС штам Індіана та ВХН штам Канзас були люб’язно надані к.б.н. Криво­хатською Л.Д. (Інститут отоларингології ім. О.С.Коломійченко АМН України). ВХН (ІА-109 ТЦД50/0,1мл) використовували для індукції α-ІФН в дозі 100 ТЦД50/0,1мл. ВВС (ІА-106 ТЦД50/0,1мл) використовували для визначення антивірусної дії ІФН у робочій дозі 100 ТЦД50/0,1мл.

При визначенні інтерфероногенних властивостей ротавірусів для порівняння використані: пірогенал (From Pseudomonas aeruginosa Serotype 10 L-9143), полі­гуацил (Polycytidylic-Polyguanilic acid (Poly[C]·Poly[G]) P 4038, виробництва “Sigma” (USA), вірус поліомієліту ІІ типу в дозі 108 ТЦД50/мл, ВХН в дозі
106 ТЦД50/мл.

В якості референс-ІФН використовували rHuIFN-α2b Recombinant Human Interferon – alpha 2b LOT# :502 PIFO1 content: 100 мg protein Sourse: E. Coli.

Для інтерферонотерапії новонароджених з РВІ застосовували вітчизняний реком­бінантний α-2bІФН – “Лаферон” (реєстраційний №192/00–300200000) виробництва ПНІК “Біотехнолог” (м. Київ), ЗАТ “Біолек” (м. Харків, Україна).

Інтерфероногенні властивості інактивованого ротавірусу вивчали за умови розробки спеціальної методики інактивації. Продовжуючі дослідження професора Гирі­на В.М., нами для інактивації ротавірусу з координаційних сполук металів вико­ристано комплексну похідну платини з поліаніоном дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДДП-ДНК), номенклатурна назва: {полі/гексакіс [хлороаміноакваплатина /П/]} – дезоксирибонуклеат: хімічна формула {[PtCl (NH3)]6 (H2O)6}n-DNA-m, де DNA-m=(С39Н49О32N15P4)n; n=2100±100; m=6. (Производные платины (П) с поли­анио­ном дезоксирибонуклеиновой кислоты, способ их получения и лекарствен­ный пре­парат противоопухолевого действия на их основе /Международная Заявка РСТ WO 89/11861, от 14.12.89. Европейский Патент ЕР 0374267 А1/. Вакцина ротавирус­ная инактивированная для иммунизации животных /Патент 2095083, Россия, Бюлл. ИСМ, 1997.- №31, ч.2.- С. 271/. Вакцина ротавірусна інактивована для імунізації тварин /Патент № 24024, Україна, МПК6, А61К 39/15–Бюл. Промислова влас­ність України.-1998.- №4.-31.08.98).

Розчин ДДП-ДНК містив 1,53 мг/мл активної речовини у фармацевтичному розріджувачі, включаючи 0,015 М натрію хлориду і 0,0015 М натрію цитрату у воді, а також  ДДП — цис-дихлородіамінплатину /П/ в аналогічному фармацевтичному розріджувачі. ДДП одержували з лабораторії координаційної хімії Інституту фізичної хімії ім. Л.В.Пісаржевського НАН України. Надалі ця сполука отримала назву макромолекулярний комплекс платини (МКП).

Інтерфероногенні властивості ротавірусів вивчали в умовах експерименту in vivo на 460 білих нелінійних мишах. Дослідження виконані в три етапи у відповідності до методичних рекомендацій “Вивчення антивірусної дії потенційних лікар­ських засобів” (Щербінська А.М., Дяченко Н.С., Рибалко С.Л. та співавт., 2000 р.). Використані 5 актуальних штамів ротавірусів людини (HRV-134) і тварин (SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К).

Інтерфероногенну активність оцінювали за двома показниками: індукуюча інтерферон доза мінімальна (ІІДмін) та показник активності індуктора (ПАІ). Інтерфероногенну дію визначали в динаміці через 2, 4, 8, 12 і 24 год після введення. Після попереднього ефірного наркозу проводили розтин тварин та відбирали кров. ІФН сироватки крові титрували в культурі клітин L-929 мікрометодом. Антиві­русну активність ІФН визначали за пригніченням ЦПД 100 ТЦД50/0,1мл тест-віруса ВВС (Од/мл).

На маркери РВІ обстежено 168 новонароджених дітей. Обстеження проведені за розробленим та затвердженим МОЗ України діагностичним алгоритмом. Крат­ність обстеження становила від 1 до 8 разів. Проведення та облік результатів в ІФА здійснювали на апаратурі фірми “Labsystems” (Фінляндія).

Функціональний стан системи ІФН у новонароджених з РВІ визначено в динаміці, за умов комплексного використання трьох показників, об’єднаних в групу оціночних тестів під назвою “ІФН статус”. ІФН статус в динаміці проаналізовано у 153 новонароджених (26 здорових новонароджених дітей та 127 новонароджених з клінічно вираженою та безсимптомною РВІ). Визначення показників ІФН статусу (рівень циркулюючого ІФН в сироватці крові, здатність лейкоцитів периферійної крові до продукції α-ІФН та γ-ІФН) в умовах in vitro проводили за модифікованим нами мікрометодом.

Визначення антивірусної активності ІФН в досліджуваному матеріалі здійснювали в культурі клітин HEp-2. Активність ІФН оцінювали за пригніченням ЦПД 100 ТЦД50/0,1мл ВВС. За титр ІФН вважали розведення проби, при якому спостерігався захист 50% моношарів клітин від ЦПД 100 ТЦД50/0,1мл ВВС. Активність ІФН виражали в МО/мл або в зворотніх log2 розведень (титр).

Клінічні обстеження новонароджених були здійснені спільно із співробітниками кафедри неонатології КМАПО ім. П.Л.Шупика (зав. кафедри д.м.н., проф. Шунько Є.Є.) і включали оцінку гестаційного віку, стану дітей при народженні за шкалою Апгар та показників фізичного розвитку з подальшою реєстрацією симптомів перебігу РВІ.

При статистичній обробці отриманих результатів використовували загальновідомі методи варіаційної статистики. Оскільки отримані дані були розподілені гаусово,­ ми застосовували параметричний метод оцінки відмінностей середніх двох ви­бірок за критерієм Ст’юдента (t), використовуючи програмно-математичний комп­лекс для ПК МS Excel 97 та пакет прикладних програм “Statistica” (USA). Розраховували середнє арифметичне (або середньологарифмічне) (М), стандартну похибку (m) та вірогідність відмінностей між окремими показниками у групах (р).

Результати досліджень та їх обговорення

В роботі представлені дослідження, проведені по трьом напрямкам, які враховували особливості вивчення системи ІФН при РВІ в залежності від трьох ключових компонентів: вірусу та його здатності індукувати ІФН в організмі, відповіді клітини-хазяїна, що оцінювалась за допомогою оціночних тестів під назвою “ІФН статус”, та вивчення впливу екзогенного ІФН на клінічний перебіг, функціональний стан системи ІФН, репродукцію та елімінацію збудника з організму.

Визначення інтерфероногенних властивостей ротавірусів в експерименті
in vivo. На першому етапі досліджень було з’ясовано, що всі інфекційно активні штами ротавірусів людини і тварин здатні індукувати в умовах in vivo утворення ендогенного ІФН. Найбільш високу інтерфероногенну активність виявляв через 8 годин ротаві­рус штаму SA-11 – 640 Од/мл, при цьому його ІІДмін становила 105ТЦД50/мл (рис. 1). Показник активності індуктора, розрахований для цього штаму ротавірусу, складав 156,25.

Рис. 1. Динаміка інтерфероноутворення ротавірусу штаму
SA-11 в умовах експерименту in vivo.

Вивчення інтерфероногенної активності інактивованого ротавірусу штаму SA-11, за допомогою МКП, проведено за розробленою нами методикою, проведення якої призводило до повної інактивації ротавірусу. Методика включала в себе: солюбілізацію неочищеної вірусвмістної культуральної рідини неіонним детергентом Тритоном Х-100 в діапазоні рН 7,4–7,6 впродовж 15 хв при 37°С; внесення сполуки цис-дихлороді­амінплатини із ДНК (МКП) у вигляді цитратно-сольового розчину; інкубацію впродовж 90 хв при температурі 37°С; освітлювання культуральної рідини центрифугуванням при 3000 об/хв впродовж 10 хв; визначення залишкової інфекційної активності ротавірусів.

Інтерфероногенна активність інактивованого вірусу була у 100 разів вищою у порівнянні з інфекційно активним вірусом (рис. 2). Розрахунок ПАІ показав високу активність інактивованого ротавірусу, як індуктора інтерфероноутворення (ПАІ = 5800 мкг/кг : 64 000 Од/мл = 0,091).

64000 ┤

                     │

Рис. 2. Рівень ендогенного ІФН в сироватці крові мишей.

Проведення порівняльного аналізу інтерфероногенних властивостей інфек­ційно активного та інактивованого ротавірусів з аналогічними властивостями відомих індукторів ІФН дало змогу встановити, що інфекційно активні ротавіруси мають слабкі інтерфероногенні властивості в організмі, що характеризує їх як слабкі інтерфероногени. Інактивація ротавірусу SA-11 МКП за запропонованою нами методикою призводила до підвищення інтерфероногенних властивостей ротавірусів у 100 разів (табл. 1).

Таблиця 1

Показники інтерфероніндукуючої дії
інфекційно активного та інактивованого ротавірусів

Ротавірусна інфекція у новонароджених дітей. Лабораторна діагностика РВІ за запропонованим нами та затвердженим МОЗ України алгоритмом дала змогу виявити у 20,9% немовлят ротавірусний антиген (у діагностичних титрах 1:16 – 1:128) в першу добу з моменту госпіталізації, що свідчило про те, що вони були інфікованні в пологових будинках та поступили з проявами РВІ. Протягом лікування і виходжування немовлят з РВІ в стаціонарі ми реєстрували госпітальне поширення ротавірусів, на що вказувало підвищення в 3,1 разів частоти визначення збудника у дітей. Тобто, протягом знаходження в стаціонарі, ротавіруси знайдено у 65,1% немовлят, що розцінено нами як нозокомеальне інфікування. У 34,9% немовлят наявність ротавірусного антигену в пробах фекалій не виявили.

Згідно власних досліджень частота інфікування ротавірусами новонароджених з перинатальною патологією в умовах спеціалізованих неонатологічних відділень може сягати 80%, що вимагає удосконалення існуючої системи моніторингу за внутрішньолікарняними інфекціями.

Тому, для своєчасної діагностики, цілеспрямованого лікування та запобігання нозокомеального поширення ротавірусів, нами запропоновано проведення моніторингу РВІ у новонароджених з перинатальною патологією. Визначені адекватні методи дослідження, діагностичні тест-системи, матеріал для дослідженння, умови його відбору, терміни проведення обстеження та контингент обстежених (інформаційний лист “Моніторинг ротавірусної інфекції у новонароджених з перинатальною патологією” №71–2002 р.).

Частота визначення ротавірусів у фекаліях обстежених немовлят була пов’язана з терміном перебування їх в стаціонарі, при цьому пік інфікування новонароджених ротавірусами припадав на другий тиждень знаходження у стаціонарі. Ротавірусні антигени у фекаліях хворих дітей визначались у титрах 1:32 – 1:128, з підвищенням титру у кількох дітей до 1:1024.

Клінічний перебіг РВІ у новонароджених характеризувався гострим початком, проявами загальної інтоксикації, наявністю катаральних явищ з боку слизових оболонок ВДШ. На другу добу з’являлись гастроінтестинальні розлади: зригування молоком, здуття живота, часті випороження водянистої консистенції з до­мішками слизу. Ці клінічні прояви супроводжувались виявленням ротавірусного антигену у фекаліях в динаміці в 100% випадків.

Аналіз клінічних показників постнатальної адаптації новонароджених встановив достовірну (р<0,05) різницю між показниками фізичного розвитку немовлят, максимальної втрати маси тіла, терміну прикладання до грудей матері, середнім рівнем білірубіну і тривалістю жовтяниці у дітей, хворих на РВІ, та у немовлят, не інфікованих ротавірусами.

Визначення інтерферонового статусу у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією. Згідно отриманих даних у здорових новонароджених дітей в сироватці крові рівень ендогенного ІФН складав 1,95±0,18 log2МО/мл. Здатність лейкоцитів крові здорової новонародженої дитини до продукції α- та γ-ІФН в умовах in vitro становила відповідно 3,72±0,18 log2МО/мл та 2,25±0,16 log2МО/мл.

Дослідження показників ІФН статусу, проведені в динаміці впродовж перебування в стаціонарі новонароджених з безсимптомним клінічним перебігом інфекції показало, що вони достовірно не відрізнялися (р>0,05) від аналогічних показників, визначених у здорових немовлят (табл. 2).

Таблиця 2

Показники ІФН статусу у здорових новонароджених
і новонароджених з безсимптомним клінічним перебігом РВІ

Дослідження динаміки інтерфероноутворення у новонароджених з клінічними проявами РВІ показало, що в гострому періоді інфекції в сироватці крові новонароджених дітей спостерігалося достовірне підвищення (р<0,01) рівня сироваткого ІФН (3,47±0,16 log2МО/мл), що характеризувало всі випадки клінічновираженої РВІ в гострому періоді. Аналіз динаміки утворення α- та γ-ІФН лейкоцитами периферійної крові засвідчив достовірний спад (р<0,01) рівнів α-ІФН до 2,14±0,14 log2МО/мл та γ-ІФН до 1,36±0,10 log2МО/мл, який ми реєстрували у 100% випадків в гострому періоді РВІ (табл. 3).

Таблиця 3

Показники ІФН статусу у здорових і хворих на РВІ новонароджених дітей

Отже, порівняльна оцінка показників ІФН статусу у здорових новонароджених та у немовлят з РВІ засвідчила достовірне (р<0,01) підвищення кількості сироваткового ІФН та пригнічення здатності лейкоцитів периферійної крові до продукції α- та γ-ІФН при відповідній їх індукції в умовах in vitro у новонароджених дітей в гострому періоді РВІ (рис. 3).

Рис. 3. Показники ІФН статусу у здорових та хворих на РВІ
новонароджених дітей.

В періоді реконвалесценції після проведенної патогенетичної терапії, інтерферон­продукуюча здатність лейкоцитів крові новонароджених дітей з РВІ не досягала рівнів, визначених для здорових немовлят, і складала 2,52±0,26 log2МО/мл для α-ІФН та 1,43±0,01 log2МО/мл для γ-ІФН.

Особливості ІФН статусу у новонароджених дітей з ротавірусною інфекцією при застосуванні в комплексному лікуванні препаратів рекомбінантних α2-ІФН. Для з’ясування ефективності лікувального комплексу із застосуванням препаратів рекомбі­нантних α2-ІФН хворі новонароджені за допомогою методу рандомізації були роз­поділені на 2 групи: основну та контрольну. Діти контрольної групи отримували базисну патогенетичну терапію. Діти основної групи на фоні цього отримували вітчизняний препарат рекомбінантного α-2bІФН – “Лаферон”, який вводили ректально на фізіологічному розчині за допомогою мікроклізм. Добова доза становила 50 000–100 000 МО/кг маси тіла, курс лікування тривав 3–5 днів. Паралельно призначали вітаміни С і Е. Ускладнень при лікуванні “Лафероном” не спостерігалось (інформаційний лист “Використання лаферону в комплексній терапії ротавірусної інфекції у новонароджених” №13–2004 р.).

Аналіз динаміки зворотнього розвитку основних клінічних синдромів показав, що їх вираженість наприкінці лікування “Лафероном” достовірно зменшилась, при цьому застосування “Лаферону” характеризувалось і достовірно більш швидшим зворотнім розвитком клінічних проявів захворювання (табл. 4).

Таблиця 4

Динаміка клінічних проявів захворювання у новонароджених дітей
залежно від комплексу застосованої терапії

Для з’ясування ефективності лікувального комплексу з ректальним застосуван­ням “Лаферону” нами були проаналізовані показники ІФН статусу. Аналіз показ­ників ІФН статусу у новонароджених обох груп в гострому періоді інфекції засвід­чив, що вони достовірно не відрізнялися (р>0,05) між собою. Після проведення відповідного лікування кількість ІФН в сироватці крові у немовлят основної та контрольної груп достовірно знижувалася (р<0,01). Проте, активація процесів інтерфероногенезу в імунокомпетентних клітинах in vitro та статистично достовірне підвищення рівнів α- та γ-ІФН спостерігалося лише у немовлят, в комплексній терапії яких був застосований “Лаферон”. Іх значення достовірно не відрізнялися (р>0,05) від аналогічних показників, визначених у здорових немовлят, і складали 3,12±0,25 log2МО/мл та 2,13±0,20 log2МО/мл відповідно (табл. 5).

Таблиця 5

Показники ІФН статусу у здорових новонароджених
та у новонароджених після застосування різних терапевтичних комплексів

Графічне зображення показників ІФН статусу у новонароджених дітей після лікування різними терапевтичними комплексами подано на рис. 4.

Рис. 4. Порівняння показників ІФН статусу у новонароджених
після лікування різними терапевтичними комплексами.

Спираючись на результати власних досліджень, зроблено висновок про те, що “Лаферон” сприяє швидшій інволюції клінічних проявів захворювання та чинить модулювальну дію на процеси інтерфероногенезу у новонароджених.

Застосування препаратів рекомбінантного α2-ІФН в комплексній терапії РВІ у новонароджених дітей необхідно здійснювати під контролем за показниками ІФН ста­тусу та вірусологічним контролем за елімінацією збудника, що дасть змогу об’єктивно прогнозувати перебіг захворювання та ефективність проведеного лікування.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове розв’язання наукового завдання, що виявляється у визначенні функ­­ціонального стану системи ІФН через комплекс оціночних тестів, об’єднаних поняттям “інтерфероновий статус” у новонароджених з гострою ротавірусною інфекцією та оцінці інтерфероногенних властивостей збудника для наукового обгрунтування застосування вітчизняних препаратів рекомбінантного α2-ІФН в комплексній терапії ротавірусної інфекції у ново­народ­жених дітей.

1. Встановлено, що у новонароджених дітей віком від 5 до 30 доби життя з масою тіла при народжені 0,8–3,2 кг в гострому періоді ротавірусної інфекції спостерігається достовірне (р<0,01) підвищення рівня сироваткового ІФН (3,47±0,16 log2МО/мл), пригнічення здатності лейкоцитів крові до продукції α-(2,14±0,14 log2МО/мл) та γ-ІФН (1,36±0,10 log2МО/мл). В періоді реконвалесценції на 7–8 добу рівень ІФН в сироватці крові достовірно (р<0,01) знижувався до 2,43±0,26 log2МО/мл, при цьому інтерферонпродукуюча здатність лейкоцитів крові не досягала рівнів, визначених для здорових новонароджених дітей, і становила для α-ІФН2,52±0,26log2МО/мл, а для γ-ІФН — 1,43±0,01 log2МО/мл.

2. Доведено клінічну ефективність та позитивний вплив інтерферонотерапії препаратами рекомбінантного α2-ІФН в добовій дозі 50 000–100 000 МО/кг маси тіла упродовж 3–5 днів при ректальному введенні на перебіг ротавірусної інфекції у новонароджених та нормалізацію показників ІФН статусу. Встановлено, що тривалість інтоксикації зменшилася в 1,8 разів; гастроінтестинальні розлади — в 1,5 разів; діарея — в 1,4 разів; частота розвитку некротичного ентероколіту — в 1,7 разів; тривалість перебування в стаціонарі — в 1,6 разів. Встановлено достовірне (р<0,01) підвищення продукції α-ІФН (3,12±0,25 log2МО/мл) та γ-ІФН (2,13±0,20 log2МО/мл) і нормалізація цих показників до рівнів у здорових немовлят.

3. Показано, що комплексна терапія ротавірусної інфекції у новонароджених дітей повинна здійснюватись під контролем оціночних тестів ІФН статусу, вірусологічним контролем за виділенням ротавірусів для об’єктивної оцінки клінічної ефективності проведеного лікування.

4. Запропоновані діагностичний алгоритм із застосуванням експресних, специфічних та чутливих методів дослідження, вірусологічний моніторинг за ротавірусною інфекцією, модифікація мікрометоду визначення ІФН статусу у новонароджених дітей.

5. Отримані новітні данні в експерименті in vivo на мишах про інтерфероногенні властивості інфекційно активного та інактивованого ротавірусів людини (штам HRV-134) і тварин (штамів SA-11, Лінкольн, Тіверваль, К). Встановлено, що всі інфекційно активні ротавіруси мають слабкі інтерфероногенні властивості в організмі, що характеризує їх як слабкі інтерфероногени. Визначено, що інтер­фероногенні властивості інактивовано­го ­ротавірусу були достовірно (р<0,05) вищими, ніж у інфекційного вірусу.

6. Pозроблено новий метод інактивації ротавірусів макромолекулярним комп­лек­сом­ платини. Інактивація в такий спосіб призводила до підвищення інтерфероно­генних властивостей ротавірусів у 100 разів. Одержані результати відкривають перспективи направленого синтезу нової групи індукторів інтерферонів за участю макро­­молекулярного комплексу платини.