|
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ
ЛЕБЕДЬ Галина Богданівна
УДК:616.15+616.411-089.87:616.411-097
ІМУНОФЕНОТИПОВИЙ ПРОФІЛЬ ЛІМФОЇДНИХ КЛІТИН СЕЛЕЗІНКИ І КРОВІ ГЕМАТОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ З РЕАКТИВНИМИ, АВТОІМУННИМИ ТА ЛІМФОПРОЛІФЕРАТИВНИМИ ПРОЦЕСАМИ
14.01.31. – Гематологія та трансфузіологія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України м.Львів
Науковий керівник - доктор медичних наук, професор
ЛОГІНСЬКИЙ Володимир Євстахович,
заступник директора з наукової роботи,
завідувач лабораторії імуноцитології та
генетики пухлин крові Інституту патології
крові та трансфузійної медицини АМН України
Офіційні опоненти -
Провідна установа -
Захист дисертації відбудеться 19.09.2001 р. о 14 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 Інституту гематології та трансфузіології АМН України (254060, м.Київ, вул. М.Берлінського,12).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (м.Київ).
Автореферат розісланий 03.08.2001 р.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення будови селезінки, її функцій та наслідків відсутності селезінки привели до усталеного погляду про її важливу роль в очищенні крові від дефектних клітин та корпускулярних антигенів за допомогою імунних чи неімунних механізмів [G.R.Lee, 1996, W.C.Chapman, 1999]. Поряд з фільтраційною функцією селезінка є великим органом імунної системи, де відбувається комітація та диференціація Т- і В-лімфоцитів, синтез антитіл.
Селезінка відіграє важливу, хоча і неоднозначну роль у виникненні та перебігу низки гематологічних хвороб. До них відносяться спадковий сфероцитоз (ССц), при якому посилене руйнування в селезінці дефектних еритроцитів приводить до реактивної гіперплазії органу, імунні цитопенії (автоімунна гемолітична анемія, АІГА; імунна тромбоцитопенічна пурпура, ІТП), де селезінка розглядається як місце синтезу антитіл та руйнування сенсибілізованих клітин крові [Г.Н.Дранник, 1999]. При лімфоїдних пухлинах дуже часто поражається селезінка, а деякі лімфоми (наприклад, лімфома маргінальної зони селезінки) первинно виникають у селезінці [J.V.Melo et al., 1987, V.O.Loginsky et al., 1993, X.Troussard et al., 1996, Д.Ф.Глузман і співавт., 1997]. Значення селезінки підтверджується ефективністю спленектомії, яка залишається важливим методом лікування цих захворювань [М.П.Павловський і співавт., 1994, K.A.Schwartz, 1998, A.Rovу, et al., 1998, П.Ф.Демидюк и соавт., 1999].
Зміни в імунній системі селезінки в згаданих гематологічних хворобах вивчені переважно на морфологічному рівні. Значно менше відомо про розлади популяцій та дозрівання лімфоїдних клітин, які можна визначити за порушенням їх імунофенотипового профілю. Сказане стосується як доброякісних процесів (дисфункції) селезінки, так і діагностики лімфоїдних пухлин, що уражають селезінку. Зокрема, не вивчені реактивні зміни при гіперплазії селезінки, зумовленій ССц, вплив розладів імунної системи на клінічні прояви та перебіг ІТП та АІГА, не розглядаються можливі зрушення в лімфоїдній системі селезінки при імунних цитопеніях під впливом лікування. Не з'ясовані субваріанти дозрілих лімфоїдних пухлин, при яких найчастіше виконується спленектомія, та не розроблена діагностична тактика оцінки фенотипу пухлинних лімфоцитів при ЗЛ.
Таким чином, оцінка змін в імунній системі селезінки порівняно з лімфоцитарним компартментом крові з доброякісними та злоякісними процесами, при яких спленектомія дає позитивний лікувальний результат, є актуальною науковою задачею з практичним значенням.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок дослідження безпосередньо пов'язаний з науково-дослідними роботами Інституту патології крові та трансфузійної медицини (№ Державної реєстрації UA 010126449P “Фенотипічні особливості лімфоїдних клітин і стан імунологічної реактивності при злоякісних лімфопроліферативних захворюваннях, ускладнених аутоімунними процесами, та розробка патогенетично обґрунтованих програм їх лікування"; № Державної реєстрації 0197U000988 “Значення цитокінового профілю у хворих злоякісними лімфопроліферативними захворюваннями для діагностики та прогнозування перебігу процесу з урахуванням імунофенотипічних, цитогенетичних особливостей і епідеміологічних аспектів, диференційованого лікування із застосуванням методів еферентної терапії”; № Державної реєстрації 01.98 U 001369 “Вдосконалити хірургічні методи лікування захворювань системи крові із визначенням імунологічних критеріїв їх ефективності”).
Мета роботи. На основі імунофенотипових досліджень визначити характер змін лімфоїдної системи селезінки та крові при реактивній гіперплазії, автоімунних і пухлинних процесах та з'ясувати їх патогенетичне, діагностичне і клінічне значення.
Основні задачі дослідження.
1. Вивчити особливості імунофенотипового профілю лімфоїдних клітин селезінки та крові хворих з реактивною гіперплазією селезінки при ССц, провести аналіз їх корелятивного зв'язку з гематологічними показниками (ступенем гіперплазії селезінки, інтенсивністю гемолізу та еритропоезу).
2. Дати імунофенотипову характеристику лімфоцитів селезінки і крові при автоімунних цитопеніях (ІТП, АІГА), вияснити залежність змін в імунній системі селезінки від тривалості хвороби, лікування, клініко-гематологічних показників до і після спленектомії.
3. Провести дослідження імунофенотипу пухлинного клону лімфоцитів селезінки та крові у хворих на хронічні лімфопроліферативні захворювання, яким була виконана спленектомія; вияснити імунофенотипові критерії оцінки результату операції.
4. Опрацювати систему аналізу результатів імунофенотипового дослідження пухлинних клітин селезінки та крові для діагностики окремих субваріантів ХЛПЗ відповідно до REAL-класифікації.
Об'єкт дослідження – селезінка і периферична кров хворих на спадковий сфероцитоз, автоімунну гемолітичну анемію, імунну тромбоцитопенічну пурпуру, хронічну лімфоїдну лейкемію, волосковоклітинну лейкемію та злоякісні лімфоми, яким за терапевтичними показами проведена спленектомія.
Предмет дослідження - імунофенотиповий профіль лімфоїдних клітин суспензії селезінки та периферичної крові.
Методи дослідження. Гематологічні, цитологічні, цитохімічні та гістологічні дослідження крові, кісткового мозку, лімфатичних вузлів, селезінки. Визначення імунофенотипових маркерів лімфоїдних клітин селезінки і периферичної крові за допомогою МКАТ до лінійних та диференційних антигенів (В-, Т-, мієло-моноцитарної ліній, NK- та активаційних антигенів) методом непрямої флюоресценції.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові наукові знання про клінічно важливі відмінності складу популяцій лімфоїдних клітин селезінки та крові у гематологічних хворих з реактивною гіперплазією (ССц), автоімунними захворюваннями (ІТП, АІГА) та лімфоїдними пухлинами селезінки, яким з лікувальною метою була виконана спленектомія. При ССц, на противагу до існуючих поглядів, встановлено, що в процес функціональної гіперплазії селезінки втягнена її імунна система, причому основні клініко-лабораторні ознаки, які визначають перебіг хвороби, пов'язані зі змінами популяцій лімфоїдних клітин селезінки. Вперше вдалося з'ясувати у хворих на ІТП особливості впливу тривалості хвороби та імуносупресивної дії кортикостероїдів на імунофенотиповий склад лімфоїдних клітин селезінки та клінічне значення виявлених розладів в постспленектомічному періоді. Встановлена імунофенотипова характеристика пухлинних лімфоцитів селезінки та крові у хворих на ХЛПЗ, у яких були клінічні покази для спленектомії. Сформульовано принципи аналізу фенотипового профілю неопластичних лімфоцитів для категоризації дозрілих лімфоїдних пухлин селезінки за REAL-класифікацією. Обґрунтовано провідне місце імунофенотипових досліджень серед інших діагностичних критеріїв ХЛПЗ та для моніторингу ефективності спленектомії у цих хворих.
Практичне значення одержаних результатів. Доведено, що дослідження імунофенотипу лімфоїдних клітин оперативно видаленої селезінки у гематологічних хворих мають особливу діагностичну цінність для диференціації реактивних і автоімунних процесів від лімфоїдних пухлин селезінки. Рекомендовано використовувати імунофенотиповий профіль пухлинних лімфоцитів селезінки для об'єктивної діагностики ХЛПЗ, їх типу та субваріанту. Запропоновано схему аналізу фенотипу неопластичних лімфоцитів для категоризації ХЛПЗ, в якій враховано як можливості і обмеження цього дослідження, так і його місце серед інших діагностичних критеріїв (цитологічних, гістологічних, клінічних). Ця схема може застосовуватися в гематологічних та онкологічних закладах для встановлення субваріанту дозрілої лімфоїдної пухлини за REAL-класифікацією, незалежно від місця її локалізації. Рекомендовано для оцінки ефективності спленектомії при лейкемізованих В-клітинних лімфопроліфераціях орієнтуватися на зміни співвідношення к+ і л+ клітин крові (клональний ексцес).
Результати досліджень впроваджено в практику консультативної поліклініки Інституту патології крові та трансфузійної медицини, 5-ої міської клінічної лікарні м.Львова, Львівської обласної дитячої спеціалізованої лікарні, Львівської обласної клінічної лікарні.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто відібрала і проаналізувала літературні джерела на тему дослідження, розробила план і методи вирішення поставлених задач. При виконанні лабораторної частини роботи самостійно провела цитологічне вивчення крові, кісткового мозку, пунктатів лімфатичних вузлів, а також імунофенотипові дослідження клітин суспензії селезінки та крові хворих. Автор статистично проаналізувала матеріал, теоретично узагальнила отримані результати, сформулювала висновки роботи.
Діагностика захворювання, визначення стану хворого та показів до спленектомії і сама операція проводилися у відділенні гематології (зав. – д.мед.н., проф. Я.І.Виговська) та відділенні хірургії та клінічної трансфузіології (зав. – к.мед.н., ст.наук.співр. І.Й.Євстахевич), співробітники яких стали співавторами наукових публікацій здобувача.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на 40-му щорічному з'їзді Міжнародного товариства з тромбозів та гемостазу (ISTH; Interlaken, Швейцарія, 1996), І Міжнародному конгресі молодих вчених (Тернопіль, 1997), 4-му Міжнародному симпозіумі з клінічної імунології (Amsterdam; Нідерланди, 1997), XIV-му з'їзді Міжнародного товариства гематологів (ISH; Stockholm, Швеція, 1997), щорічному з'їзді Австрійського товариства гематологів і онкологів (ЦGHO; Baden, Австрія, 1998), Спільному гематологічному конгресі Міжнародного товариства гематологів та Європейської асоціації гематологів (ISH-EHA; Amsterdam, Нідерланди, 1998), VII-му конгресі СФУЛТ (Ужгород, Україна, 1998), 4-му конгресі Європейської асоціації гематологів (EHA; Barselona, Іспанія, 1999), XVIII-му з'їзді Польського товариства гематологів і трансфузіологів (PTHP; Јуdџ, Польща, 1999), VIII-му конгресі СФУЛТ (Львів-Трускавець, Україна, 2000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових праць, з них 4 статті у провідних наукових журналах, 3 – роботи в збірниках наукових праць та 10 тез доповідей в матеріалах з'їздів, симпозіумів, конференцій.
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 183 сторінках машинопису; складається зі вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, семи розділів власних досліджень, висновків, списку використаної літератури, який включає 213 джерел (20 сторінок тексту). Робота ілюстрована 25 таблицями та 9 рисунками (26 сторінок тексту).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Представлено сучасні відомості про структуру і функції селезінки, зміни в її лімфоїдній системі при окремих хворобах крові. З'ясовано імунологічні наслідки спленектомії, роль селезінки в патогенезі ССц та автоімунних цитопеній. Показано особливості ураження селезінки при ХЛПЗ та важливість імунофенотипових досліджень для розуміння їх патогенезу і діагностики.
Загальна методика і методи досліджень. Дослідження імунофенотипу мононуклеарів селезінки та крові виконано у 112 хворих, яким за терапевтичними показами виконана спленектомія. 68 осіб склали групу з доброякісною патологією селезінки, серед них 10 хворих на спадковий сфероцитоз (ССц), 14 хворих на автоімунну гемолітичну анемію (АІГА), 42 – на імунну тромбоцитопенічну пурпуру (ІТП) та 2 хворих на посттравматичну несправжню кісту селезінки. Друга група (44 особи) включала хворих зі злоякісними процесами - хронічними лімфопроліферативними захворюваннями (ХЛПЗ), саме: 5 хворих на хронічну лімфоїдну лейкемію (ХЛЛ), 11 - на волосковоклітинну лейкемію (ВКЛ), 28 - на негоджкінські злоякісні лімфоми (ЗЛ).
В усіх хворих виконано цитологічний аналіз еритроцитів та лейкоцитів крові, при необхідності пунктатів кісткового мозку та лімфатичних вузлів; проведено цитохімічне дослідження (к.мед.н. А.А.Мазурок); гістологічно досліджено видалену селезінку, а при ХЛПЗ, крім того, лімфатичні вузли та в окремих випадках кістковий мозок для встановлення чи верифікації діагнозу (О.А.Петрончак). Матеріал для імунофенотипових досліджень (шматочок тканини пульпи селезінки) отримували безпосередньо під час оперативного втручання. Маса видаленої селезінки використана нами як показник ступеню гіперплазії її тканини.
Нормальні показники імунологічного профілю клітин селезінки встановлено при дослідженні поверхневих маркерів клітин суспензії селезінки, отриманої від 10 попередньо здорових осіб середнього віку, спленектомія у яких виконана з приводу травматичного розриву органу; рівень експресії поверхневих маркерів на лімфоїдних клітинах периферичної крові визначено у 15 здорових осіб середнього віку (контрольні групи).
Визначення поверхневих маркерів лімфоїдних клітин селезінки, периферичної крові до і/або після спленектомії, в різні терміни після операції, залежно від завдань дослідження, а також кісткового мозку і лімфатичних вузлів проводили непрямим імунофлюоресцентним методом на предметних склах в моношарі живих клітин. Клітини кісткового мозку та лімфатичного вузла аналізували виключно при ХЛПЗ, паралельно з імунофенотиповими дослідженнями селезінки, з діагностичною метою та для порівняння. Для імунофенотипування використовували МКАТ до лінійних та диференційних антигенів лімфоїдних клітин, включаючи антигени різних стадій дозрівання В- і Т-лімфоцитів, активаційні антигени, антигени NK- та мієлоїдних клітин (всього 26 типів).
Результати реакції відчитували на люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ Р8 (Росія) при світлофільтрі ЗС11, використовуючи фазоконтрастну і люмінесцентну оптику. Інтенсивність реакції та відсоток антигенпозитивних клітин підраховували на 100-200 мононуклеарних клітин. При ХЛПЗ експресія маркера вважалася позитивною, якщо він виявлявся більш як на 20 % клітин.
Статистичне порівняння сукупностей проводили за параметричним критерієм різниці (теста Стюдента t); вірогідність різниці між середніми величинами двох сукупностей приймалося за p<0,05. Зв'язок між показниками встановлювали за коефіцієнтом кореляції (r).
Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення
Імунофенотипова характеристика клітин селезінки в нормі, при реактивних станах (спадковому сфероцитозі ) та несправжніх кістах. Кількісне співвідношення популяцій лімфоцитів у суспензії клітин нормальної селезінки залишається маловивченим. В деяких дослідженнях для порівняння використовують як нормальний показник популяційний склад лімфоцитів селезінки у хворих на ССц [S.Imashuku et al., 2000], з чим ніяк не можна погодитись. В зв'язку з цим ми провели імунофенотипові дослідження експресії мембранних маркерів лімфоїдних клітин патологічно незміненої тканини селезінки, видаленої внаслідок травми (контрольна група).
В тканині селезінки здорових осіб В-клітинна популяція виявилась збільшеною, а Т-клітинна, навпаки, зменшеною порівняно з відповідними показниками крові (табл.1). Ці дані підтверджують думку про те, що селезінка є лімфоїдним органом, в якому проходить антигензалежна стадія дозрівання В-лімфоцитів з продукцією Ig всіх класів. Незважаючи на зниження відсотка Т-лімфоцитів в селезінці, співвідношення їх імунорегуляторних субпопуляцій збережено і відповідає аналогічним показникам крові.
У хворих на ССц гіперплазія селезінки внаслідок посиленого руйнування еритроцитів не супроводжується суттєвими змінами відносної кількості В- та Т-клітин. Виявлено істотне збільшення відсотка CD 8+ клітин, що відображається у зниженні співвідношення CD 4+/CD 8+ та зростання рівня активованих (CD 25+) клітин (табл.1). Виявлені зміни можуть свідчити про залучення імунної системи селезінки, в першу чергу, Т-клітин, в гіперпластичний процес у хворих на ССц. В літературі подібні розлади не описані і не аналізуються. Можна висловити
Таблиця 1
Експресія мембранних маркерів на мононуклеарах суспензії селезінки у хворих на
ССц, АІГА, ІТП
Кластер диференціації Кількість позитивних клітин суспензії селезінки, %
Здорові особи (n=10) Хворі на ССц (n=10) Хворі на ІТП (n=43) Хворі на АІГА (n=14)
В-клітинні маркери
HLA-DR 26,7 ± 1,8 29,1 ± 2,7 27,9 ± 1,6 33,7±2,9*
CD 19 - 27,7 ± 1,3 27,8 ± 3,6 -
CD 20 15,7 ± 0,5 21,5 ± 3,0 19,5 ± 1,8* 26,6±3,6*
CD 22 29,5 ± 3,4 21,8 ± 3,6 22,6 ± 1,6 26,6±2,3
CD 37 38,0 ± 1,5 - 26,1 ± 3,2* 32,5
Т – клітинні маркери
CD 3 30,0 ± 1,5 32,2 ± 1,5 26,4 ± 1,3 32,3±3,9
CD 5 34,0 ± 3,8 - 26,3 ± 1,6 25,6±2,8
CD 4 21,1 ± 2,6 18,3 ± 1,5 12,8 ± 0,7* 10,0±1,8*
CD 8 12,2 ± 1,7 17,2 ± 1,1* 19,1 ± 1,2* 22,1±2,4*
CD 4/CD 8 1,92 ± 0,33 1,09 ± 0,29* 0,72 ± 0,04* 0,49±0,10*
Активаційні маркери
CD 25 6,5 ± 1,1 12,3 ± 1,9* 6,8 ± 1,3 8,0±1,6
CD 30 3,7 ± 0,7 - - 11,8±3,1*
CD 38 5,9 ± 1,0 - 7,9 ± 1,5 5,3±1,1
CD 71 - 8,2 ± 0,7 6,4 ± 1,1 10,7±0,7
CD 95 - 4,7 ± 1,6 8,3 ± 1,6 2,8
NK – клітинний маркер
CD 16 - 9,4 ± 0,6 8,7 ± 0,9 7,0±2,3
Мієло-моноцитарний маркер
CD 11b 11,2 ± 2,1 - 7,9 ± 1,4 8,3±1,6
Примітка. * - вірогідно порівняно з нормою (p<0,05)
припущення, що вони пов'язані з посиленим руйнуванням еритроцитів у селезінці і звільненням глибоких еритроцитарних антигенів, а система Т-клітин забезпечує регуляцію реактивної гіперплазії. Можливо, що такі імунорегуляторні механізми сприяють обмеженню процесів гіперплазії і гіперфункції селезінки. На користь останнього свідчать спостереження, що процеси, які призводять до збільшення селезінки за рахунок стимуляції імунної системи при ССц (наприклад, інфекції), викликають посилення гемолізу [J.H.Jandl, 1996]. Таким чином, хоча імунна система селезінки безпосередньо не бере участі в елімінації дефектних еритроцитів при ССц, повідомлення літератури та результати проведеного дослідження вказують на роль лімфоїдної системи селезінки в підтриманні рівноваги між швидкістю руйнування еритроцитів та інтенсивністю еритропоезу. Їх співвідношення є суттєвим чинником, від якого залежить стан хворого та перебіг ССц.
У хворих на ССц ми виявили існування кореляційного зв'язку між показниками окремих фенотипових популяцій лімфоцитів селезінки та клініко-лабораторними величинами, що характеризують ступінь гіперплазії селезінки (маса видаленої селезінки), інтенсивність гемолізу (рівень білірубіну крові), еритропоезу (ретикулоцитоз) та стан рівноваги між ними (рівень гемоглобіну). Встановлено, що гіперплазія селезінки супроводиться зменшенням кількості CD8+ Т-супресорів/кілерів, тобто можливим є зниження їх регуляторного впливу на гіперплазію лімфоїдної тканини, а також збільшується відсоток активованих клітин з експресією молекули апоптозу (CD95). Таким чином, функціональна гіперплазія селезінки проходить паралельно з підвищенням активності лімфоїдної системи селезінки. Інтенсивність гемолізу корелює зі зменшенням CD8+ клітин та підвищенням рівня HLA-DR+ лімфоцитів, що може вказувати на участь лімфоїдної системи в процесах руйнування аномальних еритроцитів або в регуляції системи фагоцитарних клітин. Рівень гемоглобіну у хворих на ССц корелює з рівнем Т-(CD3+) та В-(CD20+) клітин в селезінці, проте негативно зв'язаний з кількістю активованих (CD95+) лімфоцитів. Ці дані свідчать, що стан рівноваги між руйнуванням еритроцитів та еритропоезу забезпечується повноцінним складом лімфоїдної тканини селезінки.
У хворих на несправжню кісту селезінки виявлено, що кісту оточує селезінкова тканина зі збереженим складом імунокомпетентних клітин. При органозберігаючих операціях на таких кістах, таким чином, можна очікувати повноцінного імунологічного функціонування залишеної тканини (кукси) органу, що має важливе значення для профілактики OPSI.
Дослідження імунофенотипового профілю клітин селезінки у хворих на імунні цитопенії (АІГА та ІТП). Імунофенотиповий репертуар лімфоїдних клітин селезінки вивчали у хворих на АІГА з неповними тепловими автоантитілами, які належать до класу IgG і виявлялися прямою антиглобуліновою пробою.
Проведені імунофенотипові дослідження мононуклеарів селезінки показали, що при АІГА збільшується відсоток В-клітин (HLA-DR+, CD20+), наростає число активованих лімфоцитів (CD30+) (табл.1). Ці зміни, очевидно, пов'язані з підвищеною активністю В-клітинної системи селезінки і участю в синтезі автоантитіл. Значні розлади спостерігаються в системі Т-лімфоцитів. Так, кількість CD3+ клітин не відрізняється від норми та ССц, відсоток CD5+ клітин дещо знижений порівняно з аналогічним показником норми. Більш виражені зміни торкаються імунорегуляторних субпопуляцій (зменшення рівня Тh та зростання Т-s/cyt), що є виявом порушеної імунологічної толерантності, яка лежить в основі автоімунного процесу.
На відміну від ССц рівень окремих імунофенотипових популяцій лімфоїдних клітин селезінки у хворих на АІГА переважно не корелював з показниками, що характеризують ступінь гіперплазії селезінки та печінки чи інтенсивність гемолізу. У хворих на АІГА існує корелятивний зв'язок між інтенсивністю гемолізу та кількістю NK клітин.
Видалення селезінки у хворих на АІГА в найближчому післяопераційному періоді не має суттєвого впливу на розлади популяцій лімфоцитів периферичної крові, що вказує на подальше існування автоімунного процесу.
Популяцію лімфоїдних клітин селезінки досліджено у хворих на ІТП, при якій селезінка розглядається як місце синтезу антитромбоцитарних автоантитіл класу IgG чи IgM і, в більшості випадків, як місце руйнування тромбоцитів, сенсибілізованих антитілами [K.A.Schwartz, 1998].
У селезінці хворих на ІТП виявлена В-клітинна популяція, яка за відсотковим вмістом, в загальному, мало відрізняється від нормальної селезінки (табл.1). Кількість HLA-DR+ та CD19+ клітин приблизно однакова, відсоток CD20+ клітин збільшений, а кількість CD22+ та CD37+ лімфоцитів зменшена. В-лімфоцити селезінки мають виразний поліклональний характер (за розподілом легких ланцюгів к і л). Поряд з цим, ознак активації в тканині селезінки не відзначено. Популяція Т-клітин, які експресували маркери CD3 та CD5, виявилася, порівняно з нормою, не зміненою. В літературі існує думка, що CD5+ В-клітини можуть брати участь в продукції автоантитіл при ІТП [H.Mizutani, 1991]. Виходячи з результатів власних досліджень (відсоток CD5+ відповідає CD3+), можна стверджувати, що в селезінці хворих на ІТП CD5 антиген експресується тільки на Т-лімфоцитах. У цих хворих виявлені зміни також в імунорегуляторних субпопуляціях (зниження CD4+ лімфоцитів та ріст CD8+) та, відповідно, порушення їх співвідношення (Th/Ts/cyt), які можуть відігравати роль в розвитку автоімунного процесу, що перебігає за клітинним типом [Г.Н.Дранник, 1999]. Отримані нами показники відрізняються від результатів досліджень інших авторів, які вказують на гуморальний тип перебігу автоімунного процесу (значний дефіцит Ts/cyt і розлади їх функцій) при ІТП [Т.В. Самадашвили, 1987].
Спленектомія у хворих на ІТП, на відміну від АІГА, вже в найближчий час (9-10 день) після операції приводить до зростання кількості CD19+ лімфоцитів, а також, що особливо важливо, підвищення відсотка Т-клітин, який знижений до операції. Знижується також експресія активаційних антигенів. Ці результати дають привід думати, що селезінка відіграє більшу роль в патогенезі ІТП, ніж АІГА.
При ІТП виявлено корелятивний зв'язок між клініко-гематологічними показниками, які характеризують ступінь тромбоцитопенії (кількість тромбоцитів до і після операції) і тривалістю захворювання, з однієї сторони та імунофенотиповими змінами популяцій лімфоїдних клітин, з другої сторони. Встановлено, що при збільшенні тривалості хвороби знижується рівень CD5+ Т-клітин. Рівень тромбоцитів зворотно зв'язаний з відсотком CD4+ та NK клітин в селезінці, що може свідчити про значення цих груп лімфоїдних клітин, відповідно, в індукції автоімунного процесу та цитотоксичних ефектах при ІТП. Неясною залишається пряма кореляція між кількістю тромбоцитів до операції і CD11b+ клітинами. Післяопераційні показники не виявляють кореляційного зв'язку з фенотиповими групами лімфоцитів селезінки.
У лікуванні ІТП першорядне значення має тривале застосування КС, імуносупресивна дія яких при ІТП в значній мірі спрямована на лімфоїдну систему селезінки - орган, що забезпечує імунний гомеостаз [J.H.Jandl, 1996] та відіграє важливу роль у патогенезі ІТП.
Ми провели вивчення імунофенотипового профілю лімфоїдних клітин суспензії селезінки у хворих на ІТП залежно від тривалості хвороби до спленектомії на фоні КС терапії, надіючись отримати in vivo докази імуносупресивної дії цих препаратів.
При тривалій хворобі на фоні лікування КС у селезінці хворих на ІТП істотно збільшується рівень CD20+ при зниженні відсотка CD22+ та CD37+ В-клітин (рис. 1). Враховуючи стадію появи і функціональне значення цих маркерів, можна думати, що саме КС призводять до нагромадження молодих форм лімфоцитів з активним Са++ каналом (CD20) та зменшеною здатністю до міжклітинних зв'язків та передачі сигналів (CD22, BL-CAM, CD37). Значні зміни виявлено нами в системі Т-лімфоцитів селезінки (рис. 1), як і треба було очікувати на основі пові-домлень літератури про те, що останні є основною мішенню для дії КС. За даними літератури КС викликають в експерименті та in vitro порушення кількості Т-клітин та модуляцію функцій [C.Mueller-Eckhardt., 1989, J.W.Hadden, D.L.Smith, 1992]. У хворих на ІТП спостерігали зменшення кількості CD 3+ і CD 5+ клітин порівняно з нормою. Зазнають значних змін імунорегуляторні субпопуляції Т-лімфоцитів. Так, рівень Т-гелперів (CD 4+-клітин) знижується в усіх обстежених групах. Відсоток CD 8+-клітин у досліджуваних групах незначно зростає. Такі зміни в імунорегуляторних популяціях лімфоцитів приводять до значного зниження співвідношення CD 4+/CD 8+, особливо після тривалого (більше 12 міс.) прийому КС. На відміну від змін В-лімфоцитів, виявлені розлади в системі Т-клітин появляються швидше і більш чітко залежать від тривалості хвороби до операції.
За нашими даними під дією КС настає поступове підвищення експресії активаційних антигенів CD38 (ензиму ADP-рибозилциклази), а при тривалому лікуванні – APO/Fas рецептора (CD95).
Незважаючи на відмінності в патогенезі обох автоімунних захворювань крові (АІГА та ІТП), селезінка відіграє значну роль у їх виникненні і перебігу, про що свідчить позитивний результат спленектомії у більшості випадків АІГА та ІТП [Ю.Л.Євстахевич, 1997]. Cпленектомія у хворих на АІГА та ІТП спрямована на зменшення плацдарму синтезу антитіл та місця руйнування сенсибілізованих клітин крові, однак відбувається і певне коригування імунорегуляторних процесів, які можуть мати зв'язок з патогенезом автоімунної хвороби.
Дослідження поверхневих маркерів лімфоїдних клітин селезінки та крові при ХЛПЗ. Лейкемічні клітини селезінки і крові як при ХЛЛ, так і при ВКЛ експресували на мембрані В-клітинні маркери CD19, CD20, CD21, CD37, HLA-DR та були CD10-. В-клітинна популяція при ХЛЛ та ВКЛ мала моноклональну природу з перевагою одного з легких ланцюгів sIg k чи l. Всі випадки ХЛЛ були CD5+ і М-РУК+ та виявляли низьку густину експресії (рівень свічення) CD22 та sIg (CD22+dim, sIg+dim), що є важливими фенотиповими ознаками даної нозологічної форми. На мононуклеарах селезінки хворих на ВКЛ не виявляли маркера CD5, М-рецептора, проте констатували високі показники експресії CD22, sIg та активаційного антигену CD25 (специфічний маркер при ВКЛ). При ХЛЛ всі активаційні маркери, включно з CD25, виявлялися на <20% клітин селезінки. За повідомленням літератури, ХЛЛ і ВКЛ ще відрізняються за наявністю на поверхні волосистих клітин маркерів CD11cbright і CD103 (MLA) [N.L.Harris et al., 1994]. Ці дані свідчать про те, що лейкемічні клітини при цих нозологічних формах перебувають на різних стадіях диференціації.
У групі хворих на ЗЛ попередній діагноз встановлювався на підставі клінічних ознак. Цитологічне дослідження периферичної крові та кісткового мозку, а також гістологічний аналіз трепанобіопсії кісткового мозку у випадках лейкемізації лімфоми дозволяв тільки підтвердити попередній діагноз без виявлення варіанту лімфоми (крім лімфоми селезінки з ворсинчастими лімфоцитами, ЛСВЛ), а вивчення імунофенотипу лімфоцитів крові чи кісткового мозку допомагало провести диференційну діагностику з хронічними лімфоїдними лейкеміями. Лише опираючись на імунофенотипові дослідження пухлинних клітин ураженої селезінки та частково крові з урахуванням результатів патогістологічного вивчення селезінки вдалося остаточно встановити категорію ЗЛ. Принципи діагностики неопластичних В і Т клітинних популяцій в селезінці, яких ми дотримувались в даній роботі, відповідали критеріям REAL- класифікації [N.L.Harris et al., 1994] та особливо останньої класифікації ВООЗ, яка включає адаптовану REAL- класифікацію [N.L.Harris et al., 1997].
У нашій групі хворих на ЗЛ імунофенотипово встановлено лінійну приналежність пухлинних лімфоцитів: у 27 пацієнтів у селезінці спостерігали В-клітинну проліферацію, в одному випадку – Т-клітинну. В-клітинну природу пухлинних клітин з'ясовано за переважною експресією В-лінійних маркерів CD19, CD20, CD21, CD22, CD37, HLA-DR та наявністю легких ланцюгів sIg. Популяція злоякісних клітин в селезінці для В-клітинних лімфом становила >70%. У всіх досліджених випадках популяція мала моноклональний характер з перевагою одного з легких ланцюгів sIg k чи l. Крім того, спільною для всіх категорій В-лімфом, як і ХЛПЗ В-клітинного походження в цілому, є редукція Т-клітинної популяції лімфоцитів та їх імунорегуляторних ланок (CD4+ і CD8+), очевидно, за рахунок переважання В-лімфоїдної проліферації.
Імунофенотипова діагностика Т-клітинної лімфоми селезінки натрапила на певні труднощі. У цього пацієнта через рік після спленектомії виявлено лейкемічну картину крові з Т-клітинним фенотипом пухлинних лімфоцитів (CD3+CD5-CD4-CD8+).
У 22 хворих з лейкемічною картиною крові і кісткового мозку ми констатували ідентичність фенотипу пухлинних лімфоцитів селезінки та крові чи кісткового мозку. У решти 6 хворих без ознак лейкемізації популяцію злоякісних клітин лімфомного походження виявлено в селезінці, у яких серед морфологічно незмінених мононуклеарів периферичної крові імунофенотипово підтверджено наявність злоякісних клітин.
Серед 28 досліджених хворих на ЗЛ, у 4 встановлено лімфому з клітин мантії (MCL), у 3 - лімфому з центрів фолікул (FL), 1 - лімфому маргінальної зони (MZL), у 5 – лімфому маргінальної зони селезінки (SMZL), 5 – лімфому селезінки з ворсинчастими лімфоцитами (SLVL), у 9 хворих - дифузну крупноклітинну лімфому (DLCL) і у 1 пацієнта діагностовано ймовірно печінково-селезінкову гд Т-клітинну лімфому. Імунофенотипова характеристика пухлинних лімфоцитів у хворих на ЗЛ наведена в табл.2. Невідповідність між частотою окремих варіантів ЗЛ у наших хворих та даними літератури зумовлена підбором пацієнтів, яким за певними показами була рекомендована і виконана спленектомія.
Таблиця 2
Імунофенотипова характеристика пухлинних лімфоцитів у хворих на В-клітинні ЗЛ
Категорія лімфоми Кількість хворих Імунофенотиповий профіль пухлинних лімфоцитів
MCL 4 CD5+CD10-CD19+CD20+CD22+HLA-DR+
FL 4 CD5-CD10+CD19+CD20+CD22+HLA-DR+
SMZL та SLVL 5+5 CD5-CD10-CD19+CD20+CD22+HLA-DR+CD25-/+
MZL 1 CD5-CD10-CD19+CD20+CD22+HLA-DR+
первинна DLCL 8 CD5-CD10-CD19+CD20+CD22+HLA-DR+CD25-CD38+
вторинна DLCL, трансформована з MCL 1 CD5+CD10-CD19+CD20+CD22+HLA-DR+CD25-CD38+
Узагальнюючи результати власних імунофенотипових досліджень злоякісних клітин у хворих на ХЛПЗ В-клітинного типу і враховуючи повідомлення літератури [I.Auer, J.Luider, 2000], нами розроблена схема аналізу імунофенотипу пухлинного В-клітинного клону для діагностики окремих категорій ХЛПЗ (рис.2). В діагностичному відношенні за імунофенотиповими ознаками ми їх розділили на CD5+CD10-, CD5-CD10+ і CD5-CD10- лімфопроліферативні процеси. До CD5+CD10- лімфопроліферацій відносяться ХЛЛ, лімфома з клітин мантії (MCL) та вторинна дифузна крупноклітинна лімфома (DLCL), трансформована з MCL. Фенотип CD5-CD10+ властивий для фолікулярної лімфоми (FL) та DLCL, що розвинулася з FL. Група CD5-CD10- проліферативних захворювань включала волосистоклітинну лейкемію (HCL), лімфому маргінальної зони лімфовузлів (MZL), лімфому маргінальної зони селезінки без ворсинчастих лімфоцитів (SMZL) та з ворсинчастими лімфоцитами (SLVL), а також первинну DLCL. Далі в схемі наведено диференційні ознаки для кожної категорії ХЛПЗ. При цьому ми насамперед брали до уваги можливість їх розрізнення за фенотиповими ознаками, доступними в наших умовах. Як видно, пухлинні CD5+CD10- та CD5-CD10+ лімфоцити можна віднести до певного субваріанту
|
