|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
Корнюшенко Ольга Миколаївна
УДК 616.988.23-092.4-092:612.014.1:615.371:578.53:575.857:578.835.15
Імунопатогенез експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності популяцій поліовірусів
03.00.06 - вірусологія
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Київ- 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Національному медичному університеті
ім.О.О.Богомольця МОЗ України
Науковий консультант: доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
член-кореспондент НАН та АМН України
Широбоков Володимир Павлович, завідувач кафедрою мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного Університету ім.О.О.Богомольця
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович,
завідувач відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів
Інституту мікробіології та вірусології
ім. Д. К. Заболотного НАН України
доктор медичних наук, професор Чудна Людмила Митрофанівна,
провідний науковий співробітник лабораторії керованих інфекцій
та засобів їх імунопрофілактики
Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних
захворювань ім. Л. В. Громашевського МОЗ України
доктор медичних наук, професор Виноград Іван Андрійович
завідувач лабораторією трансмісивних вірусів
Львівського науково-дослідного інституту епідеміології
та гігієни МОЗ України
Провідна установа : Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика
Захист відбудеться “ 20 ” травня 1999 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради
Д 26.003.01 Національного медичного Університету ім. О.О. Богомольця (252 057, м. Київ, просп. Перемоги 34, мед.-проф. корпус, ауд. №2)
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця (вул. Зоологічна 3)
Автореферат розісланий “ 19 ” квітня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор О. П. ЯворовськийЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. РНК – геномні ентеровіруси відрізняються від вірусів інших таксонів широким розповсюдженням, циркуляцією в організмі людини та оточуючому середовищі (Є.Г.Гончарук у співавт., 1990; В.М.Гирин у співавт., 1993; В.І.Задорожна у співавт., 1997), поліорганним тропізмом та відповідно різноманітним значенням в інфекційній та неінфекційній патології людини (M.Voroshilova, 1989; H.A.Rotbart et al., 1995; В.П.Широбоков у співавт., 1998), значною мінливістю популяцій (D.H.Bishop, 1988; В.М.Кибардин в соавт., 1991; E.Wimmer et al., 1993; Y.Ghendon et al., 1994). Після відкриття їх типових представників – поліовірусів, імунопатогенез поліомієлітної інфекції вивчали інтенсивно та різнопланово (Г.А.Королева в соавт., 1975; Л.Г.Тулакина, 1975; И.А.Робинзон в соавт., 1978; S.Tracy et al., 1991; R.Welliver et al., 1993). Створення в 50-60 роки Себіним та Солком живої (оральної ОПВ - або ЖПВ) та інактивованої вакцини (ІПВ) та визначні успіхи в профілактиці поліомієліту (J.Salk, 1984; A.Sabin, 1985, H.Faden, 1993) передчасно зменшили увагу до експериментального вивчення поліовірусної інфекції. Ідеї ентеровірусології, імунопатології, популяційної генетики вірусів, які почали розроблятися в 80-90 роки поставили багато нових питань, що потребували продовження вивчення поліовірусів, особливостей імунітету та патогенезу поліомієліту.
По-перше, існує постійна реальна загроза виникнення внаслідок мутацій, рекомбінацій нових варіантів ентеровірусів із зміненою вірулентністю, антигенністю, при поліовірусній інфекції та вакцинальному процесі, при пасажах в лабораторних умовах або під час циркуляції поліовірусів в оточуючому середовищі, (R.Crainic et al., 1984; M.Georgescu et al., 1995; F.Friedrish et al., 1995; R.Tafes et al., 1997). Поглиблене вивчення механізмів еволюції ентеровірусів з позицій досягнень популяційної генетики вірусів було підгрунтям для відкриття явища дисоціації популяцій вірусів Коксакі В в процесі їх репродукції на генетичні варіанти з різними фізико-хімічними та біологічними властивостями (В.П.Широбоков, 1977). Дисоціація ентеровірусів є одним з факторів, що призводить до гетерогенності їх популяцій. Варіанти популяцій ентеровірусів по-різному впливають на патогенез інфекції, формування імунітету, мають різні маркери для ідентифікації (В.П.Широбоков у співавт., 1996; 1998) Особливого практичного значення феномен дисоціації ентеровірусів може мати для удосконалення вакцинних штамів вірусів поліомієліту шляхом селекції з їх популяцій дисоціантів з високою антигенною та імуногенною дією (М.В.Шилов у співавт., 1997; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997).
По-друге, виникнення своєрідного напрямку в імунопатології – вчення про імуномодулюючі властивості вірусів (M.Bendinelli, 1988; А.Ф.Фролов в соавт., 1985; Б.Ф.Семенов, 1989; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997), є підставою для вивчення в такому аспекті ентеровірусів. Атенуйовані штами вірусів поліомієліту серед інших ентеровірусів найбільше представлені в оточуючому середовищі та організмі людини завдяки масовій імунізації ОПВ. Їх майже постійний вплив на імунну систему, на відповідь до гетерологічних антигенів, в тому числі до інших вакцин, ставить питання про імуномодулюючі ефекти, що виникають як наслідок (О.М.Корнюшенко, 1998).
По-третє, нагальні потреби удосконалення поліомієлітних вакцин, особливо ОПВ, а також схем вакцинації, щеплення імунодефіцитних осіб, асоціації вакцин ОПВ, ІПВ з іншими, наприклад з асоційованою кашлюково-дифтерійно-правцевою вакциною – АКДП, можливих сполучень з лікарськими препаратами (J.Grabstein, 1990; WHO Drug Int., 1995; R.Vetter et al., 1997; H.Wyatt, 1997) потребує дослідження імуномодулюючої дії атенуйованих штамів поліовірусів на рівні їх популяцій та вакцин в цілому.
Асамблея ВООЗ прийняла резолюцію про ліквідацію поліомієліту в світі до 2000 року, зважаючи на епідемічність інфекції, велике соціальне значення інвалідізації внаслідок перенесення поліомієліту та можливості керованого впливу на цей процес вакцинами ОПВ та ІПВ (Expanded Programme on Immunization, WHO, 1997; Vaccine Weekly, 1997; J.Nossal, 1997). З 1995 року під егідою ВООЗ в світі проводяться дні Національної масової імунізації дітей перших років життя в епідемічних по поліомієліту країнах. Україна підключилася до цієї програми в 1996 році, близько 2 млн. дітей від 3-х місяців до 3-х років одержали по дві дози ОПВ.В світі триває дискусія про переваги та недоліки ОПВ-ІПВ (J.Modlin, 1995; D.Henderson et al., 1995; D.Greco et al., 1997).Деякі дослідники віддають перевагу для рішення проблеми ліквідації поліомієліту ІПВ, тому що ця вакцина має більш високу антигенну дію ніж ОПВ, перешкоджає виникненню вакциноасоційованого паралітичного поліомієліту (ВАПП), не призводить до циркуляції поліовірусів.(P.Ogra, 1994; S.Plotkin, 1997). Відносно ОПВ головними перевагами вважають легкий спосіб введення, меншу вартість, утворення загального та локального імунітету. Недоліками є не достатньо високий рівень імунітету, можлива інтерференція між поліовірусами різних типів, виникнення ВАПП (J.Melnik, 1993; M.Georgescu et al., 1994; F.Friedrich et al., 1995), такі випадки найчастіше пов”язані з поліовірусами ІІ, ІІІ типів. В середньому показник захворювань на ВАПП складає 1 на 1 млн. 200 тис. доз вакцини (M.Georgescu et al., 1997). В Україні в останні роки також спостерігаються випадки ВАПП (Л.О.Трішкова у співавт., 1995) у вакцинованих ОПВ дітей, особливо вакцинованих із запізненням, або у контактних осіб. В практиці не має сенсу протиставляти обидва типи вакцин, стратегія вакцинації повинна бути гнучкою, в залежності від епідеміологічної ситуації, контингенту, регіону. Зважаючи на незадовільний колективний імунітет до поліомієліту, епідемічну ситуацію в Україні , були проведені дослідження по використанню ІПВ для вакцинації дітей, з наступною ревакцинацією ОПВ (В.И.Задорожная в соавт., 1997). Показано, що після ревакцинації всі діти мали вищі антитіла до поліовірусів, що свідчить про доцільність використання ІПВ в Україні. За прийнятим в Україні та деяких інших країнах календарем щеплень одночасно з введенням ОПВ проводиться вакцинація дітей АКДП. Післявакцинальні ускладнення в таких випадках можуть бути пов”язані із взаємною імуномодюючою дією обох вакцин, антигенним перенавантаженням організму, утворенням ушкоджуючих компонентів (Э.В.Гурвич в соавт., 1991; В.Г.Дорофейчук в соавт., 1991; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997). Взаємодія вакцин між собою є ще далеко не вирішеним питанням для теорії та практики. Для комбінованого застосування вакцин, наприклад ЖПВ та АКДП, або ІПВ з АКДП необхідно переконання в відсутності інтерференції між дифтерійним , правцевим токсоїдами в складі DTP- АКДП та поліовірусами. Найчастіше в світі для запобігання неврологічних ускладнень, енцефалопатій, обумовлених АКДП (DTP), а також провокації розвитку паралітичного поліомієліту у дітей застосовують ІПВ (D.Miller et al., 1981; R.Lagos et al., 1988; H.Wyatt, 1997). В умовах сучасної дійсності в Україні на фоні поширених епізодів імунодефіциту у населення проведення одночасної імунізації дітей 3-х – 5-ти місячного віку або дорослих вакцинами ЖПВ та АКДП стає важливою проблемою(В.И.Бондаренко в соавт., 1991; 1998; Л.М.Чудна у співавт.,1996). Ерадикація поліомієліту в Україні, ефективна імунізація населення, досконала дігностика поліовірусної інфекції вимагають відповідного теоретичного обгрунтування з урахуванням процесів дисоціації, яка відбувається під час репродукції ентеровірусів (В.П.Широбоков, 1977; 1989; 1996). Вище наведене надає актуальності проблемі глибокого вивчення імунопатогенезу експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності популяцій поліовірусів та біологічних властивостей їх варіантів-дисоціантів. Цим визначаються актуальність, мета та завдання даної роботи.
Зв”язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Результати досліджень (1981-1998 років) здійснених за програмами МОЗ України, Державного комітету з науки та техніки, Державного комітету боротьби із СНІДом, ввійшли до тем: “Популяційна мінливість ентеровірусів, її значення в патології та профілактиці ентеровірусних інфекцій” № держеєстрації 0193V19803; “Особливості імунопатогенезу поліомієліту при бактеріально-вірусних асоціаціях” № держеєстрації 0193 V019817; ”Вплив живої поліомієлітної вакцини на імунну систему” № держеєстрації 0194V025378;”Одержання моноклональних антитіл для диференціації вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту” № держеєстрації0193V019812; ”Інтерференція між ентеровірусами та ретровірусами як можливий шлях профілактики СНІДу та СНІД-асоційованих інфекцій”№ держеєстрації 0195V019537;”Удосконалення методології вакцинації та календарю щеплень проти поліомієліту, кашлюку, дифтерії, правцю. Створення шляхом кріоконсервування музею культур клітин, гібридом, вірусів для профілактики поліомієліту” № держеєстрації0195V014159.
Мета роботи: На основі дослідження імунопатогенезу експериментального поліомієліту та біологічних властивостей поліовірусів на рівні вірусних популяцій обгрунтувати шляхи удосконалення імунопрофілактики поліомієліту.
Завдання дослідження:
- Провести вивчення гетерогенності популяцій вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту на прикладі дисоціації. Порівняти основні біологічні властивості – вірулентність, антигенність, імуногенність дисоціантів поліовірусів.
- Дослідити імунопатогенетичні особливості експериментального поліомієліту з урахуванням дисоціації поліовірусів.
- Оцінити імуномодулюючі властивості генетичних варіантів популяцій поліовірусів, розкрити можливі механізми їх імуномодулюючої дії.
- Виявити та охарактеризувати зміни ультраструктурної організації імунокомпетентних органів, обумовлені імуномодулюючою дією генетичних варіантів поліовірусів або поліомієлітних вакцин.
- Вивчити взаємну імуномодулюючу дію вакцин ЖПВ та АКДП, експериментально обгрунтувати удосконалення схеми імунізації проти поліомієліту, дифтерії, правцю.
- Оцінити на обмеженому контингенті дітей ефективність зменшення взаємної імуносупресії вакцин ЖПВ та АКДП шляхом роздільної імунізації.
Наукова новизна отриманих результатів. Робота відноситься до теоретичної вірусології, в ній дістали продовження ідеї професора В.П. Широбокова, який відкрив феномен дисоціації популяцій ентеровірусів(В.П.Широбоков,1977,1996), на моделі Коксакі В вірусів охарактеризував закономірності явища дисоціації та властивості дисоціантів. Під його керівництвом науковці розвивали в дисертаційних роботах різні аспекти вчення про дисоціацію, в цих дослідженнях не були вивчені питання гетерогенності популяцій поліовірусів, біологічні характеристики дисоціантів, особливо вакцинних штамів, імунопатогенез експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності їх популяцій. Віруси поліомієліту як імуномодулятори були вперше вивчені автором на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ, наукові ідеї цих досліджень є власними, перші публікації маємо з 1983 року. В нашій роботі вперше було проведено глибоке порівняльне вивчення важливих для імунопатогенезу біологічних характеристик вакцинних та вірулентних штамів вірусів поліомієліту на рівні популяції:
- Було встановлено, що генетичний варіант – дисоціант Абент+, який закономірно виділяється при репродукції як вакцинних, так і вірулентних вірусів поліомієліту, обумовлює найбільший прояв кардинальних біологічних властивостей: вірулентності, антигенності та імуногенності.
- Виявлено, що віруси поліомієліту мають виразні імуномодулюючі властивості, притаманні як вірулентним, так і вакцинним штамам. На рівні популяцій імуносупресія в значній мірі пов’язана з генетичним варіантом Абент0.
- Вперше на моделі мишей виявлено, що вакцинні штами вірусів поліомієліту мають здатність швидко проникати в органи імунної системи та розмножуватися в них, цю властивість було названо імуноорганотропізмом. Генетичний варіант Абент0 індукує апоптоз в лімфоцитах селезінки.
- Показано,що жива поліомієлітна вакцина, на відміну від інактивованої, спричиняє супресію імунної відповіді до дифтерійного та правцевого анатоксинів. Вакцина АКДП інтенсивно пригнічує гуморальний та клітинний противірусний імунітет при одночасній імунізації з ЖПВ.
- На експериментальних моделях обгрунтована можливість корекції взаємної імуносупресивної дії вакцин ЖПВ та АКДП шляхом роз’єднання імунізації в часі (першою вводиться ЖПВ).
- Ефективність запропонованої схеми роз”єднаної в часі вакцинації проти поліомієліту, дифтерії та правцю була доведена в процесі імунізації дітей м. Прилуки.
Практичне значення одержаних результатів
- Генетична неоднорідність популяцій вакцинних штамів вірусів поліомієліту, дисоціація їх в процесі репродукції на варіанти Абент+ та Абент0, висока антигенна та імуногенна активність варіанта Абент+, імуносупресивна дія варіанту Абент0 дають підстави для удосконалення ЖПВ. В умовах майбутнього створення ЖПВ в Україні доцільно впровадити селекцію із популяцій вакцинних штамів варіантів Абент+, більш - біологічно активних та наділених протективними властивостями.
- З метою зменшення взаємної імуносупресії двох вакцин:ЖПВ та АКДП_-доцільно розпочинати цикл імунізації дітей вакциною ЖПВ, потім послідовно, з інтервалом 1 місяць імунізувати по черзі АКДП та ЖПВ. Після таких імунізацій створюється більш виражений гуморальний імунітет ніж при одночасних вакцинаціях ЖПВ – АКДП.
- Розроблені методичні підходи до корекції календарю щеплень вакцинами ЖПВ та АКДП зможуть в значній мірі сприяти підвищенню ефективності профілактики поліомієліту, дифтерії, правцю та збереженню здоров’я дітей в Україні.
- Планується розвинути запропоновану концепцію корекції вакцинації в широких епідемічних дослідженнях. Одержані результати впровадити при створенні нового удосконаленого календарю щеплень дітей в 2000 році.
Основні положення дисертації, що виносяться на захист
- Дисоціація популяцій вірусів поліомієліту в процесі їх репродукції є базисом для селекції із вихідних популяцій генетичних варіантів з потрібними властивостями. Для створення якісних вакцин, діагностичних препаратів корисними є дисоціанти популяції поліовірусів– варіанти Абент+. В імунопатогенезі поліомієліту варіанти Абент+. мають домінуючу роль, як найбільш вірулентні та антигенні.
- Віруси поліомієліту є потужніми модуляторами імунної відповіді до гетерологічних антигенів. Проявами імуномодуляції може бути імуностимуляція, або імуносупресія в залежності від виду антигенів. Атенуація поліовірусів не відміняє імуномодуляції. В проявах імуносупресії домінує генетичний варіант Абент0. На моделі мишей він індукує апоптоз імунокомпетентних клітин селезінки.
Особистий внесок здобувача. У дисертації викладено результати теоретичних та експериментальних досліджень, переважно проведених автором особисто. Фрагменти планових та грантових НДР виконані пошукувачем як виконавцем та відповідальним виконавцем вищеназваних наукових тем: Електронно-мікроскопічні дослідження були проведені на базі лабораторії електронної мікроскопії НДЛЦ разом з д.б.н., проф. Стеченко Л.О., деякі імунологічні дослідження були здійснені в лабораторії імунології Інституту молекулярної біології та генетики НАН України сумісно з к.м.н. Сенюк О.Ф. Висловлюємо їм щиру подяку. Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор самостійно написав та проаналізував всі друковані матеріали
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені доповідями та стендами на VI,VII з”їздах Українського мікробіологічного товариства, 1984,1989р., IV національній конференції по алергології та інфекційній імунології, Варна, 1984, Всесоюзній конференції “ Ентеровіруси. Загально теоретичні та медичні аспекти.”, 1991р., IV конгресі Світової федерації українських лікарських товариств, 1992р., міжнародній конференції до 150-річчя з дня народження І.І.Мечнікова, 1995р., 10-му інтернаціональному конгресі з вірусології, 1996 р., міжнародній науковій конференції “Морфологія-практичній ветеринарії та медицині”, 1998 р.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 30 статей в наукових журналах та збірниках праць, глави в монографії, 1 патент на винахід, 1 методичні рекомендації, 29 робіт у матеріалах з”їздів та конференцій.
Впровадження в практику. Одержані результати знайшли застосування при виданні методичних рекомендацій “Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде”, під. ред. В.П.Широбокова, Київ, 1986, МОЗ УРСР, в педагогічному процесі на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ. Удосконалена нова схема імунізації дітей проти поліомієліту, дифтерії та правцю впроваджувалася в роботу дитячої лікарні м.Прилуки. Матеріали дисертації були використані при підготовці наказу МОЗ України “Про посилення заходів щодо попередження захворюваності на поліомієліт в Україні” № 196 від 14.07.1998 року.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 5 глав власних досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаної літератури. Роботу викладено на 333 стор. машинописного тексту, ілюстрованого 32 табл., 40 рис. Бібліографія складається з 487 джерел, серед яких 143 україно- та російськомовних і 344 іноземних авторів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
Головними об”єктами були вакцинні та виробничі штами вірусів поліомієліту І, ІІ та ІІІ типів, отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів АМН СРСР в 1982 році. Вакцинні штами: Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип І, штам LSс2аb, атенуйований Себіним 1956-1957р. Походить від дикого вірусу Магоней. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІІ, штам P-712,ch 2аb, виділений Гельфандом, Фоксом з фекалій здорової дитини,. атенуйований Себіним в 1957р. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІІІ, штам Leon12 а,b, був атенуйований Себіним в 1956-1957р., походить із штама Leon, виділений із мозку дитини, померлої від поліомієліту. Пасажі вакцинних штамів проводили при температурі +340С, зберігали при температурі -200C. Вірулентні штами: Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип І, штам Mahoney,. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІI, штам MEF-1, Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип IIІ, штам Saukett.
Культури клітин: перещеплювані культури клітин типів Vero - клітини нирок африканської зеленої мавпи, HЕp-2- клітини карциноми гортані людини, L-929- малігнізована підшкірна сполучна тканина мишей лінії С3Н..
Вакцинні та діагностичні препарати: вакцина поліомієлітна пероральна І, ІІ, ІІІ типів – тривалентний препарат із атенуйованих штамів Себіна вірусів поліомієліту, серія №451. Москва ИПВЭ ім. М.П.Чумакова РАМН.Poliovirus vaccine inactivated – IPOL. Produced by Pasteur Merieux Serums & Vaccins S.A..Adsorbed diphtheria, tetanus and pertussis vaccine. Produced by Pasteur Merieux Serums & Vaccins. Lot: 5429. Сироватки діагностичні поліовірусні типоспецифічні сухі для реакції нейтралізації, типи – І, ІІ, ІІІ. Москва ИПВЭ.им. М.П.Чумакова РАМН. Діагностичний комплект “мікроаналіз – дифтерія, правець”. Містить дифтерійний антигенный (анатоксинний) еритроцитарний діагностикум, правцевий антигенний (анатоксинний) еритроцитарний діагностикум. Створений в Ростовському-на-Дону медичному інституті, центральному НДІ епідеміологіі МЗ СРСР.
Експериментальні тварини: миші ліній BALB/с, СBA, С57Bl, самці та самиці, масою 18 - 20 грамів, одержані із розпліднику віварію Інституту експериментальної онкології та радіології ім.Є.Р.Кавецького НАН України, Інституту мікробіології та вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України. Карантин періоду акліматизації, утримання тварин під час експерименту, мікроклімат, температура, вологість, світловий режим, об`єм повітря, тип клітин, відповідали загальноприйнятим нормативам утримання тварин відповідно Європейської конвенції по захисту хребтових тварин, що використовуються з експериментальною метою. Всього використано 1770 мишей.
Методи вірусологічних досліджень in vitro. Пасажі клітин проводили за загальноприйнятими методами, моношари клітин одержували в скляних флаконах або матрасах при використанні середовища росту( суміші з рівних частин середовищ 199 та Ігла з доданням 8%-10% сироватки великої рогатої худоби або 7% ембріональної сироватки з антибіотиками пеніциліном та стрептоміцином -100 од.на мл). Клітини культивували при 36,60С , при пасажах (через 2-3 доби) моношари обробляли 0,02% розчином Версену для відділення від скла. Пасажи вірусів проводили з вірусвмісним матеріалом в кількості, що забезпечувала високу множинність інфікування моношарів клітин. Адсорбція вірусів-30 хвилин, інкубація при -36,60С для вірулентних та -340С, для вакцинних штамів, 48-72 години до настання повного цитопатогенного ефекту.
Одержання концентрованих препаратів вірусів проводили за методом (В.П. Широбоков, 1973; 1977) із застосуванням природного сорбенту бентоніту. Принцип полягяє у використанні властивості ентеровірусів адсорбуватися на гелі бентоніту при кислих рН (4,5-5,0). При лужних рН (8,0-9,0) та відсутності двухвалентних катіонів ентеровіруси здатні десорбуватися в елюючий розчин. Таким чином із об”ємів -500 - 1000 мл вірусвмісного матеріалу можна одержати значно менші 5 - 10 мл, концентрація вірусів зростає на два-три логарифми.
Титри вірусів визначали: за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям (В.П. Широбоков, 1973) та мікрометодом за ЦПЕ (Руководство по вирусологическим методам, Москва, 1996; Manual for the virological investigation of polio, WHO, 1997), принцип методів: інфекційні віруси під час репродукції спричиняють видимий ЦПЕ - повну деструкцію клітин, руйнування моношару. При застосування гелю бентоніту утворюються зони деструкції моношару клітин- бляшки, вважають, що бляшка є результатом репродукції одного вірусу, кількістіь вірусів виражали в бляшкоутворюючих одиницях-БУО.
Ідентифікація типів вірусів поліомієліту. Для підтвердження належності до серотипів І, ІІ, ІІІ вірусів поліомієліту використовували реакцію нейтралізації вірусів (РНВ) (Manual for the virological investigation of polio, WHO, 1997), принцип методу полягає в тому, що при контакті вірусів з специфічними антитілами віруси втрачають свою інфекційну активність. Це перевіряють при інфікуванні культур клітин, ефект нейтралізації вірусів проявляється як відсутність ЦПЕ, відсутність бляшок.
Селекцію бентонітових генетичних варіантів вірусів здійснювали за оригінальним методом (В.П.Широбоков, 1977), розробленим при відкритті феномену дисоціації ентеровірусів та досліджені його закономірностей. Принцип методу полягає в тому, що частина популяцій ентеровірусів має високий афінітет до сорбенту, тому адсорбуються при нейтральних та слаболужних рН, такий варіант популяції одержав символ Абент+, інша, найчастіше мінорна частина популяції, - віруси з низьким афінітетом до бентоніту - варіант Абент0.Здатність ентеровірусів до адсорбції на бентоніті рекомендована для визначення бентонітового маркеру вірулентності поліовірусів.(М.К.Ворошилова, 1979).
Вірусологічні та імунологічні дослідження in vivo. Визначення нейровірулентності вірусів поліомієліту ІІ типу проводили титруванням вірусів в мозку мишей. Принцип методу: при зараженні мишей різними дозами вірусів за проявами інфекції та летальністю знаходять мінімальну кількість вірусів, яка спричиняє 50% загибелі тварин – LD50 або 95% - DLM, підраховують за методом Ріда та Менча кумулятивні дані летальності та середньої тривалості життя (З.А.Пшеничнов в соавт., 1974; Н.М.Ральф в соавт., 1982). Виділення вірусів поліомієліту із органів мишей проводили для доказу їх репродукції в різних органах. Матеріалом для вірусологічного дослідження були шматочки органів, в яких визначали кількість вірусів методом титрування на культурі клітин НЕр-2, виражали БУО на 1 гр. тканини.
Оцінку антигенності вірусів поліомієліту здійснювали при внутрішньочеревинній імунізації мишей однаковими дозами вірусів. Тут і далі термін імунізація умовно використовували для визначення процесів, що виникають внаслідок введення в організм диких поліовірусів або живих поліовірусних вакцин. На 3, 5, 7 дні після імунізації мишей забивали, брали кров, виділяли сироватку, визначали наявність противірусних антитіл та їх титри за допомогою РНВ (індекс нейтралізації 80%). Для порівняння рівнів віруснейтралізуючих антитіл в різних групах експериментальних тварин розраховували середні геометричні величини титрів, виражали їх у логарифмах при основі 2, також виражали титри в середніх величинах зворотніх розведенням сироваток (О.П.Минцер в соавт., 1982).
Оцінку імуногенної( протективної при інфекції) дії вірусів поліомієліту визначали для вакцинних штамів вірусів поліомієліту ІІтипу та їх генетичних варіантів. Для цього мишей імунізували внутрішньочеревинно дозами вірусів – 1х106БУО. Через 3 доби проводили інтрацеребральне зараження вірулентним для мишей штамом поліовірусу ІІ типу – MEF-1 – в LD50.В кожній групі мишей визначали середню тривалість життя, летальність порівнювали їх з величинами в контрольній групі та розраховували протективну дію вакцинних поліовірусів.
Вивчення гуморального імунітету проводили в процесі імунізації мишей вірусами поліомієліту. На 3, 5, 7, 14, 21 день досліджували сироватки крові за допомогою РНВ для виявлення противірусних типоспецифічних антитіл та їх титрів.
Клітинний імунітет оцінювали за функціональною активністю імунокомпетентних клітин селезінки (J.Robinson et al., 1975; В.Тессенов, 1979; Г.Фримель, 1987). Селезінки мишей забирали на різні терміни після імунізації вірусами поліомієліту або вакцинами .Спленоцити виділяли в градієнті щільності фіколл-верографіну з показником 1,076-1,078, культивували в поживному середовищі RPMI 1640 з 10% вмістом ембріональної телячої сироватки, 2мМ глутаміну, стрептоміцину та пеніциліну по 100 од/мл, в присутності 5%СО2 .Використовували мітогени ФГА та ЛПС в концентрації 5 мкг/мл, або інактивовані формаліном поліовіруси за методом (B.Montagon et al., 1985) 3Н-тимідін додавали за 4 години до закінчення культивування з розрахунку 2 мкКі на лунку, клітини осаджували на нітроцелюльозні фільтри(діаметр пор 0,45мкм). Функціональну активність лімфоцитів визначали за включенням 3Н-тимідіну в ДНК за допомогою сцинтіляційного лічильника.
Пасивний перенос імунітету з сироватками крові (антитілами):мишей імунізували тричі внутрішньочеревинно вірусами поліомієліту ІІ типу штамами MEF-1 та P-712ch2ab в дозі 1х106. На 14 день після останньої імунізації у мишей забирали кров, одержували сироватку, визначали в ній противірусні антитіла та їх титри в РНВ. Одержані сироватки з антитілами в титрі 512 вводили в хвостову вену в об`ємі 0,2 мл.
Адоптивний перенос імунітету з лімфоцитами: у імунізованих вірусами поліомієліту ІІ типу мишей одержували спленоцити (як описано вище), 5х107 клітин вводили внутрішньочеревинно мишам-донорам.
Вивчення імуномодулюючої дії вірусів поліомієліту: мишей імунізували вірусами поліомієліту І, ІІ, ІІІ типів та їх генетичними варіантами, вакцинними та вірулентними штамами, в однакових дозах – 1х106, внутрішньочеревинно. На фоні вірусної імунізації здійснювали імунізацію мишей гетерологічними антигенами, потім визначали зміни імунної відповіді до них, обумовлені імуномодулюючою дією поліовірусів.
Оцінка впливу імунізації вірусами полімієліту на антитілоутворення до гетерологічних еритроцитів: на фоні імунізації поліовірусами проводили імунізацію еритроцитами барана. Кількість антитілоутворюючих клітин (АУК) до еритроцитів барана визначали методом локального гемолізу в гелі (N.Jerne et al., 1963), принцип якого полягає в тому, що лімфоцити імунізованих гетероеритроцитами тварин продукують антитіла-гемолізини. Реакцію оцінювали по кількості зон гемолізу еритроцитів з АУК в центрі.
Оцінка впливу імунізації вірусами поліомієліту на клітинну реакцію підвищеної чутливості сповільненого типу до гетерологічних тимоцитів: на фоні імунізації вірусами поліомієліту моделювали алергічну реакцію на гетерологічні тимоцити. Для цього обрали метод відтворення та оцінки реакції підвищеної чутливості сповільненого типу (ПЧСТ) in vivo (Э.В.Гюллинг в соавт., 1981). Принцип цієї реакції полягає в тому, що у мишей, сенсибілізованих тимоцитами пацюків, на дозволяючу дозу тимоцитів розвивається реакція ПЧСТ, яка чітко реєструється по зміні маси регіонарних лімфатичних вузлів. Імунізованих мишей сенсибілізували тимоцитами пацюків (1х104, в подушечки обох задніх лап). Через 4 доби вводили дозволяючу дозу тимоцитів – 1х106, в праву лапу – дослід, в ліву лапу - 1х106 тимоцитів морської свинки – контроль. Через 1 добу мишей забивали, вилучали підколінні лімфатичні вузли, визначали різницю в масі дослідних та контрольних в %, що свідчило про ступінь прояву ПЧСТ.
Вивчення взаємного впливу імунізації поліомієлітними вакцинами та АКДП на утворення гуморального антитоксичного та противірусного імунітету. Мишей імунізували ЖПВ або ІПВ одночасно з вакциною АКДП внутрішньочеревинно, по одній дозі кожної вакцини. На 7, 14 добу мишей забивали, брали кров, одержували сироватки, в яких визначали антитіла до окремих компонентів вакцин. Віруснейтралізуючі антитіла виявляли за допомогою РНВ. Дифтерійні та правцеві антитоксини виявляли в РНГА (Использование иммунологических исследований в профилактике инфекций, управляемых вакцинацией,-Москва, 1991; Recommendations of the Immunization Practices Advisory committee, 1991).
Принцип РНГА полягає в тому, що специфічні антитоксичні антитіла спричиняють гемаглютинацію еритроцитів барана, використаних в ролі носіїв відповідних антигенів- дифтерійних або правцевих анатоксинів Досліджувані сироватки розводили в 5 разів ізотонічним розчином хлоріда натрія (рН=7,2), потім інактивували при 560С 30 хвилин, обробляли формалінізованими еритроцитами барана (50,0%) для видалення гетерофільних антитіл. Готували відповідні розведення сироваток від 1:10 до 1:1280, в кожне розведення додавали по 0,025 мл відповідного діагностикуму. Контролі: діагностикумів на відсутність спонтанної аглютинації, сироватки на відсутність аглютинінів до еритроцитів барана. Результати оцінювали за ступенем аглютинації еритроцитів. Активність еритроцитарних діагностикумів : 1-дифтерійний (для РНГА) – із стандартною сироваткою 1:3200- 1:6400; 2- правцевий (для РНГА)– із стандартною сироваткою 1:1280- 1:2560. При дослідженні сироваток в РНГА активність дифтерійного діагностикуму -1:3200, правцевого – 1:1280. Це дає можливість переводити одержані в розведеннях результати в міжнародні одиниці (МО), а саме: титр 1:10- 0,03 МО/мл; 1:20- 0,06МО/мл, 1:40- 0,12МО/мл, 1:80- 0,24МО/мл, 1:160- 0,48МО/мл, 1:320- 0,96МО/мл. При оцінці антитоксичного імунітету у дітей вважали, що групу серонегативних складали особи, у яких не виявляли відповідних антитіл в сироватках. Групу незахищених складали особи з титром нижче захисного, враховували також серонегативних. Протективним для дифтерії вважається титр 1:40, для правцю- 1:20.
Створення моделей вакцинального процесу з використанням поліомієлітних вакцин та АКДП. З метою експериментального обгрунтування підвищення ефективності вакцинації проти поліомієліту, дифтерії та правцю були створені різні схеми імунізації: 1-Одночасна імунізація ЖПВ та АКДП. 2-Одночасна імунізація ІПВ та АКДП. 3-Імунізація ЖПВ – інтервал 7 діб – імунізація АКДП. 4-Імунізація ЖПВ – інтервал 14 діб – імунізація АКДП. 5-Імунізація ЖПВ – інтервал 21 доба – імунізація АКДП. Контрольні групи- імунізація окремо ЖПВ, ІПВ, АКДП. Всі вакцини вводили в одній дозі, через 7-14 днів після останньої імунізації мишей забивали, брали кров та досліджували її на наявність антитіл та їх титрів.
Електронно-мікроскопічні методи дослідження ультраструктури імунокомпетентних клітин мишей. Використовували класичну методику приготування електронномікроскопічних препаратів із шматочків тимусу, селезінки. Матеріал фіксували у 2% розчині OsO4 по Колфільду на протязі 2 годин при температурі +4oС. Зразки зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, починаючи з 700 спирту, ацетону та заливали у суміш епону та аралдіту за загальновідомою схемою (В.Я.Карупу, 1984). Зрізи виготовляли на ультратомах LKB-Ш та Reichert і контрастували 2% розчином уранілацетату у 70% етанолі та цитратом свинця та вивчали в електронних мікроскопах ЕМВ-100Б, ЕМВ-100БР. Оцінку змін морфофункціональної організації клітин, ознаки апоптозу в лімфоцитах проводили згідно методам (Р.Исмаилов, 1979; А.П.Сорокин, 1989; R.Duke et al., 1996; S.Bergese et al., 1997).
Вивчення впливу імунізації живою поліомієлітною вакциною на перебіг стафілококової інфекції у мишей. Модель стафілококозу з клінічними проявами відтворювали при інфікуванні Staphylococcus aureus Cowan 1, в дозі 109 бактерій, адаптованих до мишей ( штам отримали з колекції Державного контрольного інституті медичних та біологічних препаратів ім. Л.А.Тарасевича, Росія). Мишей забивали шляхом цервікальної дислокації, проводили розтин та взяття в асептичних умовах крові та шматочків органів. Для оцінки патогенетичних особливостей стафілококозу на фоні імунізації поліовірусами оцінювали мікробне обсім`яніння крові, серця, легенів, печінки, селезінки в динамиці. Для уніфікації кількість мікроорганізмів переводили в показник, що характеризував мікробне обсім`яніння на 1 г органу чи 1 мл крові Бактерії при висівах ідентифікували за класичними методами. У заражених стафілококами мишей визначали фагоцитарну активність ядровмісних клітин крові за класичним методом (Ю.Аиба, 1989).
Оцінка інтерфероногенної активності ЖПВ та АКДП. Використовували 2 підходи до визначення ІФН: (Ф.И.Ершов, 1996) 1-Виявлення ендогенного сироваткового ІФН, індукованого вакцинами..2-Виявлення синтезованого спленоцитами під дією індукторів: конканаваліну А- γ-ІФН та вірусу хвороби Ньюкастла - α-ІФН. Принцип методу полягає в тому, що ІФН має протективну дію по відношенню до клітин, інфікованих вірусами. Цей ефект спостерігали по нейтралізації ЦПЕ мінімум на 50%., використовували загальноприйняту систему: культуру клітин L-929 та вірус везікулярного стоматиту (ВВС).
Методи статистичної обробки одержаних результатів. Аналіз результатів досліджень проводили з використанням методів математичної варіаційної статистики на ПК 486 DX 2 - 66 AMD при використанні програмних продуктів фірми Microsoft.. Основною ознакою до висновку про різницю між двома сукупностями був ступінь розходження їх середніх величин. Для оцінки достовірності різниці показників визначали t-критерій Стьюдента. Також застосовували метод оцінки різниці між частотами появи ознаки в окремих серіях спостережень (Г.Крамер, 1975; О.П.Минцер в соавт., 1982).
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Гетерогенність популяцій вірусів поліомієліту на прикладі дисоціації. Базою для проведення досліджень і реалізації поставлених завдань, пов’язаних із вивченням імунопатогенезу та біологічних властивостей вірусів поліомієліту на популяційному рівні було одержання шляхом селекції з вихідних популяцій вірулентних та атенуйованих штамів вірусів поліомієліту І, ІІ, ІІІ типів генетичних бентонітових варіантів. Проведена селекція продемонструвала гетерогенність популяцій поліовірусів та дозволила одержати дисоціанти вірулентних та вакцинних вірусів поліомієліту Абент+ та Абент- (табл.1).
Таблиця 1
Селекція генетичних бентонітових варіантів із популяцій вірусів поліомієліту
Примітка: при порівнянні титрів вірусів до та після адсорбції на бентоніті р<0,001
В табл.1 наведена узагальнена інформація про селекцію генетичних бентонітових варіантів вірусів поліомієліту, яку ми постійно здійснювали на протязі 15 років. Для інтерпретації були використані факти про вміст в популяціях генетичних варіантів Абент0, які найбільш закономірно повторювалися. Серед вірулентних штамів надзвичайна кількість варіанту Абент0 була зареєстрована для вірусів поліомієліту І типу, штаму Mahoney – 97,91%, тобто цей вірус практично існує в “мінусовій”формі. Популяції ІІ та ІІІ серотипів містять практично однакову кількість варіантів Абент0-0,36 та 0,39% відповідно. Атенуйовані музейні віруси поліомієліту, які протягом десяти років проходили пасажі в культурах клітин Vero при 37о, відрізнялися значно меншим вмістом варіантів Абент0 в порівнянні із аналогічним набором виробничих вакцинних штамів, пасажі яких проводили при 34оС. Типи культур клітин (Vero та HEp-2) для репродукції вірусів практично не впливали на вміст дисоціантів в популяціях. Домінуючими компонентами популяцій трьох типів атенуйованих вірусів поліомієліту, незалежно від виду клітин, були віруси з високим афінітетом до бентоніту – Абент+. Селекціоновані генетичні бентонітові варіанти популяцій вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту використовували для подальшого порівняльного аналізу їх біологічних властивостей.
Нейровірулентність генетичних варіантів вірусів поліомієліту. Значна увага до вивчення популяційної мінливості ентеровірусів обумовлена виявленням генетичної нестабільності вакцинних штамів вірусів поліомієліту (J. Drake et al., 1993; R.Duggal.et al., 1997). З метою адекватної оцінки процесів мінливості поліовірусів були створені маркери нейровірулентності, які перевіряють in vitro та in vivo. Існує кореляція між нейровірулентністю вірусів поліомієліту для мишей та людей (М.К.Ворошилова,1979). Ідеї проведення наведених експериментів були підпорядковані: 1-порівняльному вивченню нейровірулентності генетичних варіантів популяції Абент+ та Абент0 у вірулентних штамів вірусів поліомієліту ІІ типу, 2- визначенню впливу умов культивування на можливість виникнення реверсії нейровірулентності у атенуйованих поліовірусів ІІ типу. Оцінка нейровірулентності наведена за середньою тривалістю життя та летальністю у мишей (табл.2).
Таблиця 2
Нейровірулентність генетичних варіантів вірусів поліомієліту ІІ типу MEF-1
Примітки: 1.Чисельник: миші СВА, знаменник: –BALB/c. 2.р1-різниця нейровірулентності для двох ліній мишей 3. р2 – порівняння Абент+, Абент0, вихідної популяції.
Аналіз вірулентності, проведений на рівні популяції штама вірусу поліомієліту ІІ типу MEF-1 показав, що адаптований до мишей та бавовняних пацюків штам спричиняв при інтрацеребральному інфікуванні клінічну картину поліомієліту з розвитком паралічів кінцівок. Варіант Абент+ спричиняв летальність у більшої кількості тварин 98,8+0,4% ніж варіант Абент072,3+0,6%. Середня тривалість життя мишей, заражених, варіантом Абент+ -3,1+0,12 днів була менша в 2,36 рази за таку для Абент0- 7,32+0,78 дні. При інтрацеребральному введенні високих доз “гарячих” (тривалі лабораторні пасажі при 370С) атенуйованих вірусів поліомієліту P712ch2ab, виявлена їх нейровірулентність для мишей, особливо для варіанта популяції Абент+. Існування таких штамів має важливе епідемічне значення, повинно бути врахованим при удосконаленні поліомієлітних вакцин. В аналогічних дослідженнях з“холодовими” (пасажі при 340С) варіантами поліовірусів ІІ типу нейровірулентність не була виявлена.
Антигенність вірусів поліомієліту. Оцінка антигенності вірусів поліомієліту демонструє, що за цією ознакою вірусні популяції досить неоднорідні (табл. 3).
Таблиця 3
Антигенність генетичних варіантів вірусів поліомієліту.
Примітки: р1 -різниця антигенності між типами поліовірусів ,
р2 –різниця антигенності між генетичними варіантами Абент+ та Абент0).
Найбільш високою антигенністю відрізняються варіанти Абент+ вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту за винятком вірулентного штаму І типу Mahoney, у якого антигенність Абент0 була вищою в 1,6 рази вищою, ніж для варіанту Абент+. Величини титрів антитіл до генетичних варіантів Абент+ атенуйованих вірусів поліомієліту вищі ніж до варіантів Абент0 в 3,49; 3,27; 2,13 рази відповідно для І, ІІ, ІІІ типів.
На прикладі вірулентних вірусів поліомієліту антигенність генетичних варіантів Абент+ була також вищою за таку для генетичних варіантів Абент0 в 2,27 та 1,59 рази відповідно для ІІ, ІІІ типів. Варіанти Абент+ поліовірусів ІІ типу мали найвищий ступінь антигенної активності. Інформація про різну антигенність генетичних варіантів Абент+ та Абент0 атенуйованих поліовірусів перспективна для удосконалення ЖПВ шляхом селекції із вихідних популяцій високоантигенного варіанта Абент+.
Імуногенність генетичних варіантів вірусів поліомієліту оцінювали за протективним ефектом імунізації, яка передувала подальшому зараженню поліомієлітом. Результати представлені в табл. 4. СТЖ тварин на фоні імунізації варіантами Абент+ та Абент0 збільшувалась порівняно з контролем в 2,45 та 1,64 рази відповідно. Тенденцію на користь протективного ефекту імунізації варіантом Абент+ відмічали по зменшенню летальності (41,6%) в порівнянні з контролем (58,3%), на фоні імунізації варіантом Абент0 летальність була 50,1%.
Таблиця 4
Імуногенна (протективна) дія генетичних варіантів вакцинного штаму вірусів поліомієліту ІІ типу при експериментальному поліомієліті у мишей.
Примітка: р1- різниця показників між контрольною групою та групами, імунізованими поліовірусами варіантів Абент+ та Абент0.
Була доведена ще одна суттєва різниця в біологічних характеристиках варіантів Абент+ та Абент0популяцій поліовірусів. Висока імуногенність варіанту популяції Абент+ повинна бути корисною для процесу удосконалення живих поліомієлітних вакцин.
Імунопатогенез експериментального поліомієліту на рівні популяцій поліовірусів. Для вивчення патогенезу та імунітету при ентеровірусних інфекціях, найчастіше використовують інтрацеребральне, інтраспинальне зараження мавп (Н.М.Ральф, 1982). Вірулентні віруси поліомієліту ІІ типу були адаптовані до новонароджених бавовняних пацюків та білих мишей. Репродукція поліовірусів відбувається в мозку тварин, м’язах, серці, нирках, печінці, спостерігають вірусемію (И.А.Робинзон,1975). В організмі людини під час репродукції ентеровірусів постійно відбувається дисоціація, дисоціанти популяцій спричиняють спектр різноманітних патогенетичних явищ, змінюють класичні канони щодо клінічних проявів інфекції, впливають на ефективність методів профілактики, діагностики ентеровірусних інфекцій. Були створені моделі поліомієлітної інфекції: після інтрацеребрального зараження мишей варіантами Абент+ та Абент0 проводили спостереження за розвитком клінічних симптомів захворювання - слабкості, тремтіння, розвитку паралічів кінцівок тетраплегії, через 1-3 доби миші вмирали (табл.5). Виявлена переконлива різниця між величинами інфікуючих доз для варіанту Абент+ - 240,38 БУО, та Абент0- доза була в 30,14 рази більшою- 7246,37 БУО. СТЖ в моделі при інфікуванні варіантом Абент0 була на 5,5 дня більше, ніж при інфікуванні варіантом Абент+, що доводить вищу вірулентність у Абент+.
Таблиця 5
Створення моделей поліомієлітної інфекції з 50% летальністю у мишей при інфекції генетичними варіантами вірусів поліомієліту ІІ типу MEF-1.
Примітка: р1 -різниця між популяцією та варіантами Абент+ , Абент0; р2- між варіантами.
Репродукція генетичних варіантів вірусів поліомієліту в організмі мишей
Відомі моделі експериментального поліомієліту, в яких вивчали розподіл вірулентних штамів вірусів поліомієлітуів в головному мозку, спинному мозку, серці, м’язах (Н.В. Овсянникова, 1970; Л.Г. Тулакина, 1975). Було важливо дослідити взаємодію вірусів поліомієліту та їх генетичних варіантів з органами імунної системи: тимусом та селезінкою. Інформація про динаміку репродукції варіантів популяції поліовірусів в органах імунної системи та серці у мишей наведена в табл.6.
Таблиця 6
Динаміка репродукції генетичних варіантів вірулентних вірусів поліомієліту штаму MEF-1 в організмі мишей (n=40).
Примітки:1. Цифрами в таблиці представлена кількість вірусів в БУО на 1 г тканини. 2. p1<0,001, достовірна різниця вмісту в органах варіантів Абент+ та Абент0. 3. p2<0,001- різниця вмісту варіантів Абент+ та Абент0 в тимусі та селезінці в порівнянні з серцем.
Вважали, що концентрація вірусів в серці тварин корелює з такою в крові, тобто може бути показником вірусемії. При зараженні варіантом Абент+ вже через 12 годин віруси виділяли із серця в титрі 8,1+0,04х102 БУО/г, на 24 годину їх кількість збільшувалась до 1,7+0,11х103 БУО/г, на 72 годину зменшувалась до2,9+0,03х101. Віруси варіанту Абент0 виділяли із серця з 12-ї до 48 години. Віруси з характеристиками Абент+ та Абент0 виділяються із тимусу з 12-ї до 48-ї години, але кількість Абент0 була на один lg вища.
Особливо помітною була різниця в концентрації вірусів на 24-ту годину: вміст варіанту Абент0є значним в тимусі, він більше в 17,5 раз ніж для варіанта Абент+, але в селезінці кількість Абент+ в 4,06 рази більше за вміст вірусів варіанту Абент0.Обидва варіанти більш тривало знаходились в селезінці, ніж в тимусі. Інформація про своєрідний тропізм популяції Абент0, до органів імунного захисту, про особливості розподілу генетичних варіантів поліовірусів ІІ типу MEF-1 в тимусі та селезінці при поліомієлітній інфекції є абсолютно новою. Внаслідок транзиторної інфекції імунокомпетентних органів, вірогідно змінюється імунна відповідь до гетерологічних антигенів та може виникати імуносупресія.
Ультраструктурні зміни в органах імунної системи, обумовлені генетичними варіантами поліовірусів. При електронно-мікроскопічному дослідженні структури імунокомпетентних клітин. в першу годину інфекції виявляли вірусні часточки варіантів Абент+ в ендоцитозних вакуолях цитоплазми селезінки та тимусу. В більшості імунокомпетентних клітин активізувалася білок-продукуюча діяльність, спостерігали збільшення розмірів ядерець, ядерних і цитоплазматичних гранул РНП. Варіант Абент+ підсилював активність макрофагів: збільшення їх числа, розмірів та лізосомоподібних утворень. При дії варінту Абент0 віріони виявляли в основному в цитоплазмі, в селезінці, поруч з підвищенням макрофагальної активності, були деструктивно змінені імунокомпетентні клітини.Через 6 годин інфекції варіантом Абент0 зростала кількість апоптозних клітин, які зморщувалися, їх ядра пікнотично змінювались, збільшувалась кількість конденсованого, маргінально розміщеного хроматину. Об`єм еухроматину був значно менший на ранніх стадіях апоптозу, а на пізніх- повністю відсутній, і ядро зазнавало каріорексису. В цитоплазмі відмічали лізис матриксу , набряк мітохондрій та деструкцію інших органел. Такі клітини фагоцитувалися макрофагами або інтердигітуючими та дендритними клітинами. Кількість цитолітичних проявів, спричинених вірусами в імунокомпетентних клітинах, була закономірно вища при дії варіанту Абент0, ці віруси індукували апоптоз- запрограмовану, в клітині смерть. Вірусами – індукторами апоптозу можуть бути вірус імунодефіциту людини, грипу та інші (D.L. Vauі, G. Hacker, 1995; S.Nagata, 1996), але відомості. про можливості клітинного апоптозного шляху при ентеровірусній інфекції відсутні.
Вплив генетичних варіантів вірусів поліомієліту на формування гуморального та клітинного імунітету. Процес імуногенезу при поліомієліті являє утворення сироваткових та секреторних антитіл, розвиток місцевої резистентності тканин, дію факторів клітинного імунітету. Продовжується дискусія про домінуючу роль гуморальних або клітинних компонентів імунної відповіді при інфекції або вакцинації (E. Ehrenfeld et al., 1995; J. Modlin, 1995). Генетична неоднорідність популяцій вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту, існування варіантів Абент+ та Абент0 з різною вірулентністю, антигенністю, імуногенністю, свідчить про можливу різницю в процесі реалізації імунної відповіді на ці віруси. Виявили, що віруснейтралізуючі антитіла з”являються в сироватці крові з 3-го дня спостережень, їх величини достовірно більші для варіанту Абент+, ніж Абент0. Максимальні титри антитіл спостерігали на 7 день – 7,47+0,11; 7,47+0,19 – для варіантів Абент+ вірулентного та вакцинного штамів. Для варіанту Абент0- вірулентного штаму максимальний титр– 3,28+0,13 також пов’язаний із 7-м днем імунізації, а при імунізації Абент0 вакцинного штаму – пік антитілоутворення 3,08+0,19 відмічали вже на 5 день. Після 7-го дня спостережень титри антитіл до всіх варіантів поступово знижуються. За ступенем антигенної активності вакцинний штам вірусу поліомієліту ІІ типу P712ch2ab не поступається його вірулентному аналогу– штаму MEF-1 Варіанти Абент+ обох вірусів були більш антигенними, ніж Абент0. Активацію Т-лімфоцитів під дією мітогену ФГА, оцінювали за інтенсивністю включення 3Н-тимідину в ДНК клітин, що діляться. Такий ефект спостерігали з 3 доби для всіх варіантів експериментів при порівнянні контрольних показників – 528+132 із дослідними– 4528+258, 3910+116 – для варіантів Абент+; та 2312+29, 1348+78 – для відповідних варіантів Абент0. Активація Т-лімфоцитів, їх висока проліферативна здатність, індукована ФГА, зменшувалась до 5 доби. Стимуляція функціональної активності В-лімфоцитів під дією мітогена ЛПС була надзвичайно інтенсивною та для Абент+ вищою, ніж для Абент0, що підтверджує переважну активність варіанта Абент+. Мітогенна дія вірусного Т-залежного антигену в культурі лімфоцитів селезінки була близькою до такої у ФГА. Проліферативна відповідь лімфоцитів на вірусний антиген показала, що функціональна активність лімфоцитів мала вірус-залежний характер.
Порівняльний аналіз протективних механізмів імунітету при експериментальному поліомієліті. Противірусні антитіла можуть мати ушкоджуючу дію, пов’язану з відкладенням в судинах імунних комплексів. Сенсибілізовані лімфоцити здатні спричиняти цитотоксичні ефекти, розповсюдженими імунопатологічними реакціями при вірусних інфекціях є аутоімунні реакції, хвороби імунних комплексів. (M. Bendinelli, 1984) В умовах експериментальної поліовірусної інфекції є можливості для порівняльного аналізу протективних механізмів імунітету (табл.7).
В групі реципієнтів виділяли 2 підгрупи. 1.1– мишей інфікували інтрацеребрально вірусом поліомієліту ІІ типу, вірулентним штамом MEF-1 в дозі, 500 БУО (LD50 ). 1.2 – мишам вводили за 48 годин до моделювання поліомієлітної інфекції препарат циклофосфан 2 мг/кг (як імунодепресант, що пригнічує проліферацію лімфоцитарних клонів). Після зараження мишам внутрішньовенно та внутрішньочеревинно вводили різні засоби імунотерапії від мишей-донорів. При гострій поліомієлітній інфекції з коротким перебігом, (СТЖ мишей – 3,84+0,41 дня) протективний ефект виявили такі фактори, як пасивна імунізація, особливо сироватки з специфічними проти вірулентного штаму поліовірусу антитілами. СТЖ у мишей збільшується на 77%.
Таблиця 7
Протективна дія факторів імунного захисту при експериментальному поліомієліті
Примітка: p-різниця показників в дослідних та контрольних групах
Сироватка з антитілами проти вакцинного штаму обумовлює ефект захисту мишей на 58,85%. При комбінації імунних антитіл з несенсибілізованими спленоцитами імунотерапія була також оптимальною, СТЖ збільшувалась на 82,29%, відносно контролю. Варіанти імунотерапії, пов’язані з переносом сенсибілізованих або несенсибілізованих лімфоцитів не були ефективними. У мишей із пригніченим циклофосфаном імунітетом противірусні антитіла, імунні та неімунні спленоцити, не призводили до протективного ефекту. Продовження життя мишей було досягнуто при застосуванні композиції із імунних сироваток та несенсибілізованих спленоцитів. В умовах створеної моделі поліомієлітної інфекції спостерігали складні, неоднозначні за трактуванням, захисні варіанти імунотерапії. У мишей з нормальною імунною системою протективна дія була пов’язана з віруснейтралізуючою активністю антитіл сироватки, особливо гомологічних. У імунодефіцитних тварин імунотерапія поліомієлітної інфекції була успішною при використанні неімунних спленоцитів в комплексі з сироватковими антитілами.
Віруси поліомієліту як імуномодулятори. Імуномодулюючі ефекти, пов’язані з атенуйованими вакцинними штамами вірусів поліомієліту, практично не вивчені. Зважаючи на масове застосування живої поліомієлітної вакцини, вкрай необхідно вивчити зміни імунологічної реактивності , обумовлені вакцинацією проти поліомієліту. Це ідейно обумовило проведення досліджень розділу, присвячених вивченню впливу вірулентних та вакцинних поліовірусів і їх генетичних варіантів на гуморальну та клітинну імунну відповідь до гетерологічних антигенів. Імуномодулююча дія вірусів поліомієліту відносно антитілоутворення до гетерологічних антигенів - еритроцитів барана (табл.8).
Таблиця 8
Імуномодуляція антитілоутворення до гетерологічних антигенів поліовірусами
Примітки: 1.АУК- число антитілоутворюючих клітин 2.- р1- різниця трьох типів поліовірусів відносно контролю; р2 -різниця між варіантами Абент+ та Абент0.
Виявлено,що вакцинні штами вірусів поліомієліту та їх генетичні варіанти проявляли виражену імуносупресивну дію: пригнічували антитілоутворення до тимусзалежних гетерологічних еритроцитів. Імуномодулюючі ефекти, які відтворювалися, визначалися типовою характеристикою вірусів та залежали від генетичного варіанту. Найбільшим імунодепресивним ефектом відрізнявся атенуйований поліовірус ІІІ типу.
При порівнянні імуномодулюючих властивостей генетичних варіантів вірусів поліомієліту очевидною є така тенденція: генетичні варіанти Абент0 значно більше пригнічують утворення антитіл в порівнянні з впливом варіантів Абент+. Особливий ефект імуносупресії, зменшення кількості АУК до еритроцитів барана на 71,55%, розвивався на фоні імунізації варіантом Абент0 атенуйованого вірусу поліомієліту ІІІ типу, але для інших двох типів поліовірусів також спостерігали аналогічну тенденцію більш виразної імуносупресивної дії обумовленої впливом варіантів популяції Абент0. Для асоціації поліовірусів у вигляді живої поліомієлітної вакцини також був виявлений імуносупресивний ефект - зниження кількості АУК відносно контролю на 64,55%. Генетичні варіанти Абент+ поліовірусів мають більш високу антигенність та імуногенність, ніж варіанти Абент0. Виразна імуносупресивна дія останніх не пов’язана з цими ознаками. Порівняння імуномодулюючих ефектів, спричинених вакцинними та вірулентними поліовірусами довело, що імуномодулюючі ефекти притаманні як вакцинним, так і вірулентним поліовірусам, тобто “Атенуація не відміняє імуномодуляції”(Б. Ф. Семенов, 1981). Можна було пов’язати виразні імуномодулюючі ефекти ІІ та ІІІ типу вакцинних та вірулентних поліовірусів з вірулентністю. Контраргументом є те, що в усіх атенуйованих штамах більш імуносупресивним був генетичний варіант Абент0, а він має меншу вірулентність, ніж Абент+.
Імуномодулюючу дію вірусів поліомієліту відносно клітинних реакцій імунітету до гетерологічних антигенів (тимоцитів пацюка) вивчали в ПЧСТ, класичній алергічній реакції, яка відзеркалює стан клітинного імунітету. Показано, що в створеній моделі всі типи поліовірусів спричиняли значне пригнічення ПЧСТ. Найвищий прояв імуносупресії був пов’язаний із поліовірусами ІІІ типу, вакцинні штами та генетичні варіанти Абент0 були більш активними відносно пригнічення ПЧСТ, ніж варіанти Абент+(табл.9). Імунізація ЖПВ спричиняла суттєвий імуносупресивний ефект, прояви ПЧСТ зменшувались на 62,27%. Індукована поліовірусами та їх генетичними варіантами імуносупресія гуморальних та клітинних реакцій імунітету на гетероантигени викликає серйозний інтерес з точки зору патогенезу, імуногенезу та профілактики ентеровірусних інфекцій. Здатність вакцинних штамів вірусів поліомієліту впливати на формування імунної відповіді до інших антигенів закономірно привели до наступних етапів вивчення поліовірусів як імуномодуляторів. Було доцільно перенести вивчення атенуйованих штамів поліовірусів І, ІІ, ІІІ типів на рівень живої поліомієлітної вакцини, яка являє собою асоціацію вірусів поліомієліту, атенуйованих Себіним. Серед різноманітних проявів біологічної активності ЖПВ логічно вивчити імуномодулюючі ефекти.
При вивченні феномену вірусіндукованої імуномодуляції в ролі гетерологічних антигенів можуть бути патогенні та непатогенні бактерії, віруси, компоненти вакцин. Саме тому в подальших дослідженнях були створені нові моделі оцінки імуномодулюючої дії вірусів поліомієліту на прикладі ЖПВ.
Таблиця 9
Вплив вакцинних штамів вірусів поліомієліту на прояв реакції ПЧСТ у мишей
відносно гетерологічних антигенів (тимоцитів пацюка).
Примітка: р -різниця показників між дослідними та контрольною групами, а також між дією варіантів Абент+ та Абент0 трьох типів поліовірусів
Вплив живої поліомієлітної вакцини на перебіг стафілококової інфекції
Стафілококова інфекція у мишей мала виразні клінічні ознаки без летального кінця, розвивалась надзвичайно інтенсивно, бактеріємія виникала в першу годину спостереження. З цього часу визначали достовірну різницю між кількістю бактерій в крові в контрольних групах та під впливом імунізації ЖПВ- зменшення числа стафілококів в 5,47 раз. Найбільш істотний вплив імунізації ЖПВ спостерігали при виділенні бактерій із селезінки: зменшення обсім”яніння стафілококами було в 12,16 рази. Бар”єрні та антимікробні функції кровотворних та імунокомпетентних органів обумовлюють високий ступінь накопичення в них бактерій, але на сьому добу, при імунізації ЖПВ, переважали процеси елімінації стафілококів з крові, легенів та печінки на фоні значної концентрації бактерій у мишей контрольної групи. Таким чином, вплив ЖПВ на розвиток стафілококової інфекції проявлявся як формування антибактеріальної резистентності.
Взаємна імуномодулююча дія поліомієлітних вакцин та АКДП Багато вакцинних препаратів застосовують шляхом ассоційованого введення,.наприклад ЖПВ та АКДП. Серйозною науковою проблемою є пізнання взаємодії вакцин між собою. У складі вакцини АКДП потужним імуномодулятором є кашлюковий компонент, який досить часто викликає пригнічення імунологічних реакцій організму та розвиток серйозних неврологічних ускладнень (D.Miller, 1981, M.Griffin, 1990). ЖПВ спричиняє вірусіндуковану антигеннеспецифічну імуномодуляцію, змінюює імунну відповідь організму до гетероантигенів у вигляді як імуностимуляцїі, так і імуносупресії. Перспективним є порівняльне вивчення імуномодулюючої дії ЖПВ та ІПВ. Остання вільна від можливості реверсії патогенності, але не можна виключати модуляцію імунної відповіді до інших антигенів по аналогії з відомими фактами про імуномодулюючу дію інактивованих вірусних вакцин (Б.Ф.Семенов, 1989). Тому було досліджено феномен імуномодуляції для ЖПВ та ІПВ, результати наведені в табл.10. Встановлено, що титри протидифтерійних антитіл зменшуються під впливом ЖПВ в 12,44 рази, а правцевих – в 16,0 раз. Ці факти демонструють нові ефекти в імуномодулюючій дії вірусів поліомієліту, що заключаються в виразній імуносупресії відносно утворення дифтерійних та правцевих антитоксинів, індукованих компонентами АКДП. Реалізація такого імуномодулюючого ефекту відбувається в умовах одночасної імунізації живою поліомієлітною вакциною та АКДП. ІПВ має значні переваги- значно менші прояви імуносупресії. ІПВ мала більш високу антигенність, титри віруснейтралізуючих антитіл до всіх трьох типів поліовірусів були достовірно вищими відповідно в 2,0; 1,43 та 2,29 рази, ніж такі самі при імунізації ЖПВ. Під впливом АКДП на імунну відповідь до ЖПВ рівні віруснейтралізуючих антитіл достовірно зменшувались в 3,66; 4,66 та 3,55 рази для поліовірусів І, ІІ, і ІІІ типів відповідно. Взаємодія АКДП з ІПВ спричиняла супресію антитілоутворення до поліовірусу І типу – зменшення в 1,96; ІІІ типу–в 1,3 рази.
Експериментальне обгрунтування удосконалення календарю щеплень проти поліомієліту, дифтерії, правцю на лабораторних моделях
Попередніми дослідженнями було встановлено, що ЖПВ має виразну імуномодулюючу дію відносно дифтерійного та правцевого анатоксинів в складі АКДП. Одночасна імунізація мишей вакцинами ЖПВ та АКДП призводить до взаємної імуномодулюючої дії. На фоні істотного зниження рівня дифтерійних та правцевих антитоксинів, відбувається пригнічення синтезу віруснейтралізуючих антитіл. Найбільш простим та реальним шляхом корекції взаємної імуносупресії є роз’єднання імунізації в часі. Встановлено, що (табл.11) із збільшенням часу між введенням двох вакцин від 7 діб до 21 дня настає оптимальний ефект нівелювання імуносупресивної дії. Утворення дифтерійних антитоксинів при імунізації АКДП за 21 добу після ЖПВ збільшується в 16 раз, правцевих – в 21,33 рази; віруснейтралізуючих антитіл – в 4,02; 6,66 та 4 рази відносно поліовірусів І, ІІ, ІІІ типів. Розділення в часі імунізації ІПВ та АКДП також призводило до значного підвищення ефективності вакцинації. На рівні вивчення функціональної активності Т- та В-лімфоцитів встановлено, що найбільші показники проліферації обумовлені імунізацією ЖПВ та ІПВ (2035+146; 816+93). Пригнічення проліферації лімфоцитів спостерігали при імунізації мишей вакциною АКДП (219+24), або при асоційованій з АКДП імунізації ЖПВ, ІПВ- відповідно- (444+30); (363+57). Безпосередніми наслідками таких феноменів може бути пригнічення індукції інтерферону, супресія антитілоутворення. Нормалізація функціональної активності лімфоцитів відбувається при роз’єднаній імунізації.
Можливі механізми імуномодулюючої дії вірусів поліомієліту. Репродукція вірусів в органах імунної системи може пояснювати їх імуномодулюючу дію .Одним із вірогідних механізмів імуномодуляції, спричиненої вірусами поліомієліту, також могло бути їх розмноження в органах і клітинах імунної системи. Імуноорганотропізм вакцинних вірусів поліомієліту. Встановлено, що через 3 години після імунізації спостерігається велика різниця кількості вірусів в органах імунної системи - тимусі і селезінці, в порівнянні з серцем. Через 1 добу така тенденція підтверджується. Цю властивість вірусів в даному випадку можна охарактеризувати як імуноорганотропізм. Вакцинні та вірулентні штами вірусів поліомієліту І, П, Ш типу здатні до швидкого проникнення і репродукції в органах імунної системи. Атенуйовані штами, на відміну від вірулентних, мають більш виразний імуноорганотропізм, ця ознака асоціюється з поліовірусами І і ІІ типів. Феномен імуномодуляції, обумовлений зв`язком поліомієліту з клітинами імунної системи, необхідно враховувати для удосконалення профілактики поліомієліту, дифтерії та правцю. Інтерфероногенна дія ЖПВ та АКДП. ІФН, як модулятори імунних реакцій, спричиняють низку позитивних ефектів: стимуляцію фагоцитозу, активацію природних кілерів, підвищення резистентності клітин до вірусної інфекції, разом з тим, є і негативні феномени: пригнічення антитілоутворення, проліферації лімфоцитів (В.Д. Соловьев, 1981). При одночасній імунізації ЖПВ та АКДП однією із причин пригнічення антитілоутворення може бути надмірна продукція цього медіатору. Показано, що ЖПВ, як і її складові компоненти- атенуйовані штами Себіну вірусів поліомієліту (И.А.Фролова, 1993), індукує виразну продукцію ІФН. Максимум синтезу сироваткового ІФН ЖПВ індукує на 1 добу дослідження – 586,6± 51,53 МО. Вакцина АКДП була значно слабкішим індуктором ІФН, пік синтезу відбувався на 4 добу –133,3 ± 25,76 МО При сумісній імунізації обома вакцинами спостерігали найбільшу продукцію ІФН, яка на 1 добу– 1066,7±103,1– в 1,81 рази перевищувала такий показник для ЖПВ, далі кількість ІФН стрімко зменшувалася Такі ефекти очевидно пов”язані з великим антигенним навантаженням - “шоком” для імунної системи одразу після імунізації. Висока продукція ІФН може бути шкідливою для реалізації реакцій гуморального імунітету. При роз”єднанні імунізації в часі спостерігали тенденцію до нормалізації рівня ІФН на першу добу –213,3±25,76. Ультраструктурна організація органів імунного захисту при різних типах вакцинації була вивчена у мишей для пізнання механізмів імуномодулюючої дії вакцин. В тимусі та селезінці під впливом ЖПВ виявляли реакцію лімфоїдної системи різної інтенсивності. Активація спленоцитів, тимоцитів, плазмоцитів та клітин
Таблиця 10
Взаємна імуномодулююча дія вакцин ЖПВ та АКДП.
Таблиця 11
Експериментальне обгрунтування ефективних варіантів імунізації для профілактики поліомієліту, дифтерії, правцю.
Примітки: 1. Цифрами в таблицях представлені титри антитоксичних та віруснейтралізуючих антитіл в середніх зворотніх величинах розведень сироваток. 2.р-різниця показників між дослідними та контрольними групами
макрофагальної системи, реакція мікроциркуляторного русла свідчили про явне індукування імунної відповіді.ІПВ також сприяла активації імуногенезу. АКДП призводила до пошкоджуючих змін структурної організації селезінки: відмічали порушення реології крові, обтурацію судин форменними елементами, периваскулярне скупчення колагенових волокон, фрагменти цитоплазми ушкодженних клітин строми, лейкоцитів та макрофагів. Частина імунокомпетентних клітин знаходилась в стані функціональної активності, що ультраструктурно проявлялось збільшенням в них кількості рибосом, полісом, мітохондрій та виростів плазматичної мембрани. При одномоментній імунізації ЖПВ і АКДП виражені зміни відзначали в гемомікроциркуляторному руслі, де просвіти судин, як правило, були обтуровані тромбоцитами, лейкоцитами та еритроцитами. Аналогічні ''сладж феномени'' виявляли в кровоносних капілярах, в венулярній ланці гемомікроциркуляторного русла. Імунокомпетентні клітини зазнавали деструктивних та дистрофічних змін. При імунізації мишей ІПВ одночасно з АКДП в селезінці відзначали зміни в гемомікроциркуляторному руслі, пов’язані з пошкодженням ендотелію цих судин, розходженням ендотеліальних клітин та виявленням форменних елементів крові периваскулярно. Структурна організація макрофагів і плазматичних клітин близька до контрольних. Введення вакцини АКДП через 21 день після імунізації ЖПВ показало, що в селезінці дещо посилювались реактивні зміни з боку гемомікроциркуляторного русла та строми. Активувалися макрофаги та плазматичні клітини, збільшувалась їх кількість та відзначалась гіперплазія клітинних органел. В білій пульпі селезінки на фоні активації лімфоцитів відмічали відсутність виразних порушень їх ультраструктурної організації, що, очевидно, пов’язано з розвитком компенсаторно-пристосувальних процесів в органі.Таким чином, проведене електронно-мікроскопічне дослідження селезінки і частково тимусу при дії вакцинних препаратів показало, що вони в певній мірі мали ушкоджуючу дію на імунокомпетентні клітини селезінки та тимусу. Прояви цього ефекту були неоднаковими. Найбільш виражений негативний ефект притаманний об’єднаній імунізації (ЖПВ+АКДП), а найменшій ІПВ. При роздільному (через 21 добу) введенні ЖПВ та АКДП формувались компенсаторно-пристосувальні процеси і зменшувалась кількість ушкоджених імунокомпетентних клітин. Таке введення вакцин призводило до найкращого імуностимулюючого ефекту.
Корекція взаємної імуномодулюючої дії вакцин ЖПВ та АКДП в процесі імунізації дітей проти поліомієліту, дифтерії, правцю була проведена на базі дитячої поліклініки м.Прилуки Чернігівської області за дозволом заступника Головного державного санітарного лікаря України А.Г.Падченко, лист №5.09.19/711 від 11.09.1997 року Головному державному санітарному лікарю Чернігівської області Донцю М.П. За допомогу в організації та проведенні роботи з дітьми висловлюємо щиру подяку спеціалістам охорони здоров”я м.Прилук. Були створені дві групи дітей, в першій групі було обстежено 18 дітей, народжених в грудні 1997 року. Вони були вакциновані одночасно ЖПВ та АКДП двічі, з інтервалом один місяць в березні та квітні 1998 року. друга група – 16 дітей, народжених в березні 1998 року, імунізацію в цій групі провели вакцинами ЖПВ та АКДП послідовно з інтервалом один місяць, в чотири етапи. Друга група дітей одержала аналогічну із першою групою кількість вакцинальних доз атенуйованих вірусів поліомієліту та анатоксинів, але в різній послідовності.(табл.12).
Таблиця 12
Ефективність роздільної та сумісної імунізації дітей вакцинами ЖПВ та АКДП.
Примітка: р -різниця показників середніх титрів в величинах, зворотніх розведенням
Результати порівняльного аналізу обох варіантів імунізації – одномоментної та роздільної в часі, наведені в табл.12. Роздільна імунізація має безперечні переваги в порівнянні з одночасною: середній титр дифтерійних антитоксинів в 1,86 рази вище, максимальний титр антитіл – 160 виявляли в 3,37 рази частіше, мінімальний титр для одночасної імунізації – 20, для роздільної – 40, і нарешті кількість дітей, що не мали протективного титру (40) було меншим на 43,05% при роздільній імунізації. Антитоксичний проти-правцевий імунітет відрізнявся за величиною середнього титру антитоксинів, вона була дещо більшою – 125,0+17,0 при роздільній імунізації, ніж 82,2+17,7 при сумісній, але інші показники істотно не відрізнялися. Середні титри віруснейтралізуючих антитіл значно відрізнялись при роздільній імунізації, до вірусу поліомієліту І типу середній титр збільшився в 3,63 рази, до ІІ типу – в 1,69 рази, до ІІІ типу – в 1,51 рази. Порівняння двох схем імунізації було проведено лише в процесі вакцинації. Але вже зараз можна бачити, що формування імунітету свідчить про значну користь роз’єднаної в часі імунізації в порівнянні із одночасною вакцинацією.
ВИСНОВКИ
- Показано, що під час репродукції в популяціях вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту відбувається дисоціація на генетичні варіанти з високим (Абент+) та низьким афінітетом до бентоніту (Абент0). В кількісному складі популяцій вакцинних поліовірусів домінують варіанти Абент+, вміст варіантів Абент0 є від 0,02% до 5,9% та 0,36% - 0,39% - для вірулентних вірусів поліомієліту ІІ-ІІІ типів. Вірулентний поліовірус І типу Mahoney існує в формі Абент0 -97,91% варіанта в загальній популяції.
- Варіанти Абент+ вакцинних та вірулентних поліовірусів мають значно вищу біологічну активність, їх антигенність при порівнянні з варіантами Абент0 в середньому більше в 2,96 рази у вакцинних штамів та в 1,93 рази у вірулентних. Винятком є вірулентний поліовірус І типу Mahoney, його антигенність більш виражена у варіанта Абент0. Імуногенність варіантів Абент+ вакцинних поліовірусів ІІ типу також вища ніж у Абент0, різниця протективного ефекту імунізації при експериментальній поліомієлітній інфекції досягає 63,7%.
- Провідна роль в патогенезі експериментальної поліомієлітної інфекції асоційована з варіантом Абент+. Доведено, що генетичний варіант Абент+ в популяціях вірулентних вірусів поліомієліту ІІ типу MEF-1 відрізняється в 2,36 рази вищою нейровірулентністю для мишей, ніж Абент0 (порівняння за величиною середньої тривалості життя). Варіанти Абент+ та Абент0 інтенсивно проникають в тимус та селезінку в перші години інфекції, вони ушкоджують структуру імунокомпетентних клітин, варіант Абент0 обумовлює апоптоз лімфоцитів селезінки.
- На експериментальних моделях виявлено, що Абент+ та Абент0 варіанти популяцій вірусів поліомієліту справляють різноманітний вплив на імунну систему. Провідна роль в індукції утворення віруснейтралізуючих антитіл та в бластогенезі лімфоцитів належить варіанту Абент+ для вірулентних та вакцинних штамів.
- Вперше для вірусів поліомієліту на рівні популяцій показано, що вони мають виразну імуномодулюючу дію. Її проявом є пригнічення гуморальної та клітинної імунної відповіді до гетерологічних антигенів. Імуносупресія більшою мірою пов”язана з варіантом популяції Абент0 : пригнічення антитілоутворення до гетероеритроцитів на 71,55%, для
Абент+ -на 64,23 %; зменшення проявів ПЧСТ до гетеротимоцитів варіантом Абент0 на 83,1%, Абент+ на 42,8% (на прикладі вакцинного поліовірусу ІІІ типу). Атенуація поліовірусів не впливає на прояв їх імуносупресивної дії.
- Імуномодулююча дія популяцій вірусів поліомієліту досліджена при взаємодії вакцин- ЖПВ та АКДП. Обидві вакцини при одночасному введенні взаємно пригнічують антитоксичний імунітет (дифтерійний в 12,44 рази, правцевий в 16 раз) та противірусний імунітет (зменшення титрів антитіл до поліовірусів І, ІІ, ІІІ типу відповідно в 3,66; 4,66 та 3,55 раз). Інактивована поліомієлітна вакцина (ІПВ) має більш високу ніж ЖПВ антигенну дію, титри антитіл до всіх трьох типів поліовірусів були вищими в 2; 1,43; та 2,29 раз відповідно. При одночасній імунізації індукована ІПВ імуносупресія була значно меншою, ніж для ЖПВ. Під впливом АКДП утворення віруснейтралізуючих антитіл індукованих ІПВ зазнавало меншої супресії, що свідчить про її істотні переваги.
- Вперше для вірусів поліомієліту показано, що причиною їх імуномодулюючої дії є інтенсивне та швидке (за перші 3 години) проникнення в селезінку та тимус, феномен названий нами імуноорганотропізм. Він більш виражений для вакцинних штамів І, ІІ типів, ніж для вірулентних. Доведено, що іншими механізмами, що сприяють взаємній імуносупресії ЖПВ та АКДП можуть бути порушення індукції інтерферону та ушкодження ультраструктури клітин в органах імунного захисту при одночасній імунізації, при роз”єднанні вакцин в часі (21 доба) негативні ефекти поступово нівелюються.
- Експериментально обгрунтовано та запропоновано для корекції взаємної імуномодулюючої дії ЖПВ та АКДП їх роз”єднане введення. На моделях лінійних мишей встановлено, що інтервал 21 день між імунізацією ЖПВ (спочатку) та АКДП призводить до нейтралізації імуносупресії (титри дифтерійних та правцевих антитоксинів відповідно підвищувались в 16, та 21,33 раз; антитіл нейтралізуючих поліовіруси типів І, ІІ, ІІІ в 4,02; 6,66; 4 раз відповідно.
- Ефективність роздільної імунізації доведена при вакцинації ЖПВ та АКДП двох груп дітей м. Прилуки за підвищенням середніх титрів віруснейтралізуючих антитіл в 3,63; 1,69; 1,51 раз відповідно до типів поліовірусів І, ІІ, ІІІ; зменшенням кількості дітей без протективного титру для дифтерії на 43,05% та збільшенням числа дітей з максимальним титром дифтерійних антитоксинів- 160 на 13,2%.
|
