|
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. Ю.ФЕДЬКОВИЧА
НИКОЛЮК
Ігор Дмитрович
УДК 577.7:616.006
ДОСЛІДЖЕННЯ ОКРЕМИХ КОМПОНЕНТІВ ЗАХИСНИХ СИСТЕМ
ПЕЧІНКИ І КРОВІ ЩУРІВ ПРИ ОПРОМІНЕННІ
ТА КАНЦЕРОГЕНЕЗІ
03.00.04 - біохімія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці - 2000
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Чернівецькому державному університеті
ім. Ю.Федьковича, Міністерство освіти і науки України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
МАРЧЕНКО Михайло Маркович,
Чернівецький державний університет
ім. Ю. Федьковича,
декан біологічного факультету.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
МЕЩИШЕН Іван Федорович,
Буковинська державна медична академія,
завідувач кафедри медичної хімії,
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,
Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка,
кафедра біохімії,
Провідна установа – Харківський національний університет
ім. В.Н. Каразіна, кафедра біохімії
Міністерство освіти і науки України, м. Харків
Захист дисертації відбудеться “_18 _” жовтня 2000 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому державному університеті ім. Ю.Федьковича (58012, м.Чернівці, вул. Коцюбинського, 2).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича (58012, м.Чернівці, вул. Л.Українки, 23).
Автореферат розісланий “_7_ ”вересня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої
ради, к.б.н., доцент Г.П.Копильчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Погіршення екологічної ситуації внаслідок радіоактивного забруднення до якого призвела Чорнобильська катастрофа, спричинило значний ріст різноманітних захворювань, що зумовило посилене вивчення однієї з проблем експериментальної біології, а саме, дії низьких доз проникаючої радіації на організм людини і тварин, і зокрема, на розвиток новоутворень [Серкиз Я.И., 1990; Москалев Ю.И., 1994; Филенко В.А., 1999].
Внаслідок росту пухлини в організмі відбуваються зміни в системі антиоксидантного захисту, які прискорюють ріст пухлин. До складу антиоксидантної системи організму (АОС) входять ферменти знешкодження активних форм кисню – супероксиддисмутаза (СОД), церулоплазмін, каталаза [Владимиров Ю.В., 1998 ]. Важливою ланкою захисту тварин є система глутатiону, яка регулює окисно-вiдновнi процеси, утилізує ксенобiотики, виконує радiопротекторнi функцiї [Колесниченко Л.С., 1990; Кулинский В.И, 1993]. Глутатіонова система включає відновлений глутатіон (ГВ) та глутатіонзалежні ферменти: глутатіонпероксидазу (ГПО), глутатіон-S-трансферазу (Г-S-Т), глутатіонредуктазу (ГР). Крім того, прооксидантні та антиоксидантні властивості проявляють метали змінної валентності, як у формі вільних іонів, так і зв’язаних в складі антиоксидантних ферментів ( Барабой В.А., 1997).
У зв’язку з цим актуальним є вивчення активності антиоксидантних ферментів в організмі в процесі росту пухлини, оскільки результати таких досліджень сприятимуть більш глибокому розумінню протікання біохімічних процесів і пошуку нових протиракових препаратів.
Особливої уваги заслуговують рослинні засоби, які володіють протипухлинною активністю, легко засвоюються, проявляють комплексну дію на організм і володіють незначною токсичністю [Барабой В.А., 1998].
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 1995 до 2000 року на кафедрi бiохiмiї i експериментальної екологiї Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича i є частиною наукових тематик кафедри "Дослiдження пiслядiї радiацiйного та хiмiчного забруднення на життєдiяльнiсть живих органiзмiв", № держреєстрації 0194V028027, “Дослідження захисних систем організмів в нормі та вражених карциномою Герена при дії опромінення та різних видів хімічних агентів”, № держреєстрації 0197U014415.
Мета і задачі дослідження. З’ясувати особливості функціонування окремих компонентів антиоксидантного захисту печінки та крові на різних стадіях росту карциноми Герена попередньо опромінених тварин.
Вiдповiдно до мети поставлено наступні завдання:
- Дослідити у тварин, що зазнали дії чотириразового рентгенівського опромінення в сумарній дозі 13,4 мКл/кг, та опромінених такою ж дозою з подальшим прищепленням їм карциноми Герена:
а) вміст малонового альдегiду в печінці та процент пероксидного гемолізу еритроцитів у крові;
б) активнiсть металовмісних антиоксидантних ферментів: СОД, каталази, церулоплазміну в крові та СОД у печінці;
в) вміст біогенних елементів (міді, цинку, марганцю, заліза) в органах, крові та пухлині;
г) вміст відновленого глутатiону та активність глутатіонзалежних ферментів (глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази, глутатіон-S-трансферази) у печінці;
2. Вивчити дію засобу з лікарських рослин на досліджувані показники попередньо опромінених тварин з карциномою Герена.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботi вперше вивчено вплив чотириразового рентгенівського опромінення в сумарній дозі 13,4 мКл/кг на ріст карциноми Герена у тварин. Досліджено стан антиоксидантної системи печінки і крові, вмiст малонового альдегiду (МА) в печінці та вміст біогенних елементів в різних органах дослідних тварин з карциномою Герена, які були попередньо опромінені.
Виявлено активацію процесів пероксидного окислення ліпідів (ПОЛ) та зміни в активності компонентів антиоксидантної системи організму щурів на ранніх етапах після дії опромінення. Показано, що в крові тварин збільшується відсоток гемолізованих еритроцитів, підвищується активність супероксиддисмутази, каталази і церулоплазміну, зростає вміст міді та заліза. В печінці щурів знижується активність глутатіон-S-трансферази та підвищується вміст малонового альдегіду.
Встановлено, що в процесі росту карциноми Герена у тварин, попередньо опромінених рентгенівськими променями, на 21 добу з часу трансплантації пухлини у печінці накопичується малоновий альдегід, знижується активність ферментів антиоксидантного захисту – супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази. Ріст карциноми Герена викликає перерозподіл металів: підвищення рівня цинку і міді в печінці, цинку в селезінці і нирках, та зниження вмісту міді, заліза, марганцю в досліджуваних органах щурів. В пухлинній тканині відмічено підвищення вмісту цинку, міді, марганцю та зменшення вмісту заліза, що є фактом зниженя процесів ПОЛ у злоякісному новоутворенні.
Показано протипухлинну дію препарату, виготовленого з екстрактів лікарських рослин, яка проявляється в нормалізації активності супероксиддисмутази та глутатіонзалежних ферментів в печінці тварин і сповільненні темпів росту пухлин.
Практичне значення одержаних результатів. Отриманi результати та їх узагальнення доповнюють i поглиблюють існуючі уявлення про вплив низьких доз іонізуючого опромінення на організм тварин, і про особливості росту новоутворень у них, а також дають змогу з’ясувати особливості функціонування захисних систем тварин за дії шкідливих факторів.
Проведено апробування в ролі протипухлинного агенту засобу з лікарських рослин, що спонукає до подальших його досліджень, як перспективного допоміжного препарату при лікуванні ракових захворювань.
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостiйно виконав експериментальну частину роботи, пiдiбрав та опрацював лiтературнi вiдомостi, пiдготував до друку науковi роботи, що вiдображають основні результати дисертацiї. Аналiз та обговорення отриманого матерiалу проведено спiльно з науковим керiвником.
Апробація результатів дисертації. Основнi результати роботи викладенi на Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцiї "Демографiчна ситуацiя в Карпатському регiонi: реальнiсть, проблеми, прогнози на XXI столiття" (Чернiвцi-Київ, 1996), VII Українському бiохiмiчному з'їздi (Київ, 1997), I Всеукраїнській науковій конференції "Екологічний стрес і адаптація у біологічних системах" (Тернопіль, 1998).
Публікації. За матерiалами дисертацiйної роботи опублiковано 5 статей і 3 тез доповiдей.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (4 розділи), матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення (5 розділів), узагальнення, висновків і списку використаних джерел (229 джерел). Робота викладена на 123 сторінках, має у своєму складі 12 таблиць та 12 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Подано огляд літератури, в якому висвітлено деякі особливості впливу іонізуючого опромінення та онкогенезу на живі організми, розглянуто системи захисту тварин від дії шкідливих чинників і методи лікування ракових захворювань.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В роботі використовували білих безпорідних щурів-самок віком 2,5-3,0 місяці та масою 130-140 г, яких утримували на стаціонарному раціоні віварію. Проведено наступні експерименти:
I - тварини були розділені на групи: інтактний контроль та дослідна. Дослідних тварин опромінювали протягом 4-х днів одноразовою дозою 3,35 мКл/кг (сумарна доза - 13,4 мКл/кг). Опромінення проводили на рентгенівській діагностичній установці 12П6 (“Lachema”, Чехія) за таких умов: напруга 80 кВ, сила струму 40 мА, фільтри 0,5 мм Сu, шкірно-фокусна відстань 40 см, потужність дози 1 Р/сек (2,58 х 10-4 Кл/кг). Досліджували активність антиоксидантних ферментів та вміст продуктів ПОЛ в крові та печінці, а також вміст металів в крові та органах дослідних тварин. Декапітацію тварин проводили під легким ефірним наркозом через 1 год, 1 і 3 доби після дії радіації.
II - вивчали стан компонентів АОС в крові та печінці тварин вражених злоякісною пухлиною. Як модель експериментальної пухлини використовували карциному Герена (штам пухлини наданий нам Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України). Імплантацію пухлини проводили підшкірно загальноприй-нятим методом. Для цього готували 30% суспензію ракових клітин в ізотонічному розчині хлористого натрію (0,9% NaCl) і вводили підшкірно по 0,5 мл в ділянку стегна задньої кінцівки. Тварини були поділені на групи: інтактний контроль та дослідні: 1 група (R+П) - тварин опромінювали як і у першому есперименті, і на фоні опромінення щурам прищеплювали карци-ному Герена; 2 група (П) – тварини-пухлиноносії, які знаходились на стаціонарному раціоні віварію; 3 група (R+П+N) – щурі з карциномою Герена, попередньо опромінені отримували засіб з лікарських рослин, який вводили перорально, починаючи на 7-й день з часу імплантації пухлини в розрахунку 0,3 мл на 100 г маси тварини, протягом 14 днів. 4 група (П+N) – щурам з карциномою Герена вводили досліджуваний засіб як і тваринам 3-ї групи; 5 група (R+П+С) - щурі з карциномою Герена, попередньо опромінені отримували 40% спирт, який вводили пер-орально, починаючи на 7-й день з часу імплантації пухлини в розрахунку 0,3 мл на 100 г маси тварини, протягом 14 днів. Декапітацію тварин 1-5 груп проводили на 7, 14, 21-у добу з часу імплантації пухлини.
Визначали: в крові - процент пероксидного гемолізу еритроцитів, активність каталази, СОД, церулоплазміну, вміст металів (мідь, цинк, марганець, залізо); в печінці - вміст МА, ГВ, активність глутатіонзалежних ферментів (ГР, ГПО, Г-S-Т) та активність СОД. Визначали вміст вищезазна-чених металів у печінці, селезінці, нирках, пухлині та м’язах. Вивчали протипухлинну дію засобу вимірюючи біометричні параметри росту пухлин.
Засіб “NIKA” – суміш екстрактів з календули лікарської (Сalendula officinalis L. (суцвіття), тирличу жовтого (Gentiana lutea L. (корені), скорцонери низької (Scorzonera humilis L. (корені), ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea L. (кореневища), аконіту молдавського (Aconitum moldavicum Hogl. (корені)) виготовлених способом мацерації на 40% етиловому спирті.
Визначали в крові процент пероксидного гемолізу еритроцитів за методом Горячковського А.М.(1994), активність каталази [КФ 1.11.1.6] - методом Королюк М.А. та ін. (1988), активність СОД [КФ 1.15.1.1] в крові та печінці проводили за методикою Нашікімі та співавт. (1972) і Фріда (1975), активність церулоплазміну [КФ.1.16.3.1] в сироватці крові визначали за модифікованою методикою Ревіна. Дослідження активності глутатіон-залежних ферментів: Г-S-Т [КФ 2.5.1.18] , ГР [КФ 1.6.4.2], ГП [КФ 1.11.1.9.] проводили за Власовою С.Н. та ін. (1990). Вміст ГВ визначали за методом Батлера Е., Дюбона О., Келлі Б., (1963). Вміст металів (мідь, цинк, марганець, залізо) в печінці, селезінці, нирках, пухлині та м’язах визначали стандартним сухим методом [Шамгунов и др.(1989). Кількість МА визначали методом Владимирова Ю.А. та ін. (1972). Вміст білку визначали за методом Лоурі (1951). Дослідження засобу з лікарських рослин проводили згідно стандарту Державної Фармакопеї (1987). Терапевтичний ефект засобу оцінювали на основі параметрiв: об’єму та маси пухлин. Отримані дані опрацьовували статистично [Ойвин И.А., 1960].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Процеси пероксидного окислення ліпідів в крові та печінці опромінених і щурів з карциномою Герена, які зазнали попереднього опромінення. В результаті проведених досліджень встановлено, що в крові тварин, які зазнали чотириразового рентгенівського опромінення, збільшується відсоток гемолізованих еритроцитів вже через 1 год після дії радіації (табл.1). В печінці дослідних щурів у цей термін було відмічено зниження вмісту МА з подальшим підвищенням продукту ПОЛ через 1 і 3 доби.
Таблиця 1.
Процент пероксидного гемолізу еритроцитів і вміст МА в печінці тварин що зазнали опромінення, M±m, n=8
Примітка: *- вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
Як показали результати проведених досліджень, подані в табл.2 вже на 7-му добу з часу імплантації пухлини в організмі щурів відбувались значні зміни, пов’язані з процесами ПОЛ та активністю АОС, а саме зниження проценту пероксидного гемолізу еритроцитів та збільшення вмісту МА в печінці.
Дослідження вмісту МА в гомогенаті печінки щурів 1-ї групи на 7-му добу з часу імплантації пухлини, показали збільшення його рівня на 16%, відносно даного показника у інтактних тварин.
Таблиця 2.
Процент пероксидного гемолізу еритроцитів і вміст МА в печінці тварин з карциномою Герена, попередньо опромінених, M±m, n=8
Примітка: * - вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
** - вірогідні відмінності порівняно з 1-групою (p≤0,05)
На 14-ту добу по мірі росту пухлини спостерігалось збільшення вмісту МА в печінці тварин-пухлиноносіїв 1-ї групи порівняно з 7-ю добою і становило 131% відносно контролю, що на 16% більше, ніж у гомогенаті печінки щурів 2-ї групи. На 21 добу експерименту вміст МА в печінці тварин-пухлиноносіїв 1-ї групи становив 164% порівняно з контролем.
Таким чином, чотириразове рентгенівське опромінення викликає посилення процесів ПОЛ в організмі, що проявляється в підвищенні вмісту МА в печінці. В процесі росту карциноми Герена, прищепленої після попереднього опромінення, відбувається пошкодження клітинних мембран, що призводить до накопичення ТБК-активних продуктів в гомогенаті печінки тварин, вражених злоякісною пухлиною.
Активність антиоксидантних ферментів в печінці та крові опромінених і щурів з карциномою Герена, які зазнали попереднього опромінення. Посилення процесу ПОЛ в організмі щурів, що зазнали рентгенівського опромінення викликало зміни в АОС. Як наслідок цього, в крові опромінених тварин знайдено підвищення активності CОД, каталази і церулоплазміну (табл.3).
В табл.4. представлені результати дослідження активності СОД в крові попередньо опромінених пухлиноносіїв, які показали значні зміни вже на 7-му добу експерименту, а саме підвищення її активності на 16% порівняно з контролем. У щурів 2- групи каталазна активність крові не відрізнялась від контролю і була вище рівня пухлиноносіїв 1-групи на 47%, що вказує на значно більші порушення в захисній системі пухлиноносіїв, які були попередньо опромінені.
Таблиця 3.
Активність антиоксидантних ферментів у крові та печінці тварин, що зазнали опромінення,
M±m, n=8
Примітка: *- вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
Таблиця 4.
Активність антиоксидантних ферментів в крові та печінці тварин
з карциномою Герена, попередньо опромінених, M±m, n=8
Примітка: *- вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
**- вірогідні відмінності порівняно з 1-групою (p≤0,05)
Було відмічено також підвищення активності церулоплазміну на 62%, порівняно з контролем. В крові тварин 2-ї групи активність церулоплазміну була на 17% нижче даного показника пухлиноносіїв, які зазнали попереднього опромінення. На 14 добу з часу імплантації пухлини, каталазна активність крові дослідних тварин 1-ї групи знижувалась, однак зберігалась підвищеною на 38% активність церулоплазміну.
Стан АОС крові тварин з карциномою Герена 2-групи на відміну від пухлиноносіїв, які були попередньо опромінені на 14 добу з часу імплантації пухлини суттєво відрізнявся. Так, активність СОД була вище рівня контролю на 15%, а порівняно з 1 групою на 23%, каталазна активність крові нижче контролю на 28%, активність церулоплазміну - на 17%. На 14 добу експерименту активність СОД становила 82% порівняно з контролем, тоді як у тварин 2- групи вона була вище рівня інтактних тварин на 24%, що суттєво відрізняється від даного показника тварин 1-ї групи.
На ранніх стадіях збільшення концентрації вільних радикалів стимулює канцерогенез, оскільки вони пошкоджують ДНК сусідніх клітин, залучаючи їх до пухлинного росту. Знешкодження вільних радикалів відбувається в печінці, що і зумовлює ріст її антиоксидантної активності [Бурлакова Е.Б. и др., 1975].
На 21 добу з часу трансплантації пухлини у дослідних тварин відмічено зниження активності ферментів АОС. Попереднє опромінення тварин перед прищепленням пухлини призводить до значного зниження активності антиоксидантних ферментів в крові та печінці.
Стан АОС крові тварин з карциномою Герена 2-ї групи на кінець експерименту схожий з таким у тварин 1-групи, проте каталазна активність крові була вища на 13%, церулоплазміну нижчою на 14%, активність СОД в печінці була на 12% нижчою порівняно з такою у тварин 1 групи.
Таким чином, попереднє опромінення тварин перед імплантацією пухлини, прискорює ріст злоякісного новоутворення, що призводить до посиленого використання захисних резервів організму та спричиняє руйнування АОС.
Вміст біогенних елементів в органах та крові опромінених і щурів з карциномою Герена, які зазнали попереднього опромінення. Зміни в активності антиоксидантних ферментів в організмі щурів за дії опромінення та при карциномі Герена викликають зміни вмісту металів, які є їх кофакторами. Одержані експериментальні дані (табл. 5,6) свідчать про те, що в крові щурів, які зазнали рентгенівського опромінення та в крові пухлиноносіїв відбуваються значні зміни вмісту металів. У цільній кровтварин за дії рентгенівського опромінення в сумарній дозі 13,4 мКл/кг, через 1 год після дії радіації відмічені суттєві зміни вмісту міді та заліза (табл. 5).
Таблиця 5.
Вміст металів у крові щурів, що зазнали опромінення, M±m, n=8
Примітка: * - вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
В цільній крові тварин-пухлиноносіїв, попередньо опромінених (табл.6) вже на 7-му добу з часу перевивки пухлини знижувався вміст марганцю на 47% на фоні надлишку міді - 165% і цинку- 188% порівняно з контролем.
Таблиця 6.
Вміст металів у крові щурів з карциномою Герена, попередньо опромінених, M±m, n=8
Примітка: * - вірогідні відмінності порівняно з контролем (p≤0,05)
** - вірогідні відмінності порівняно з 1- групою (p≤0,05)
| 
