|
Академія медичних наук України
Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова
ЧЕРНЯЄВ СЕРГІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ
УДК 578.651.63:576.8.095.38
ГЕТЕРОГЕННІСТЬ ПОПУЛЯЦІЇ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДУ AEROCOCCUS І ЇЇ РОЛЬ В РОЗРОБЦІ НОВИХ ПРОБІОТИКІВ
І КОНТРОЛЮ ЇХ АВТЕНТИЧНОСТІ
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків - 2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений працівник народної освіти України Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, завідувач лабораторії теоретико-прикладних основ специфічної профілактики захворювань мікробного генезу;
доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри імунології, алергології та ендокринології
Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України
Захист відбудеться 25.10.2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057: м. Харків, вул. Пушкінська, 14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: м. Харків,
вул. Пушкінська, 14.
Автореферат розісланий 23.09.2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої ради
к.мед.н., с.н.с. С.В.Бруснік
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В боротьбі з інфекційними та нагнійно-запалювальними хворобами бактеріальної, вірусної та грибкової етіології в умовах сучасної клініки ведуча роль належить антибіотикам і сульфаніламідним препаратам. Та в значній мірі ефективному використанню цих вельми цінних ліків сьогодні перешкоджає формування стійкості збудників захворювань до них, селекція та інтенсивне розповсюдження полірезистентних штамів. Вказане диктує нагальну необхідність пошуку нових надійних засобів хіміотерапії, антисептики та дезинфекції (Г.К.Палій, 1998; В.В.Смирнов, 1999; І.Й. Сидорчук, 2001).
При цьому в останні десятиріччя набули достатньо інтенсивного розвитку дослідження по розробці та використанню профілактичних і лікувальних препаратів біологічного походження, сконструйованих на основі сапрофітних та умовно-патогенних мікроорганізмів з вираженими антагоністичними властивостями по відношенню до збудників патологічних процесів. Враховуючи нерідко низьку клінічну ефективність хіміопрепаратів та цілий ряд їх негативних ефектів (токсичність, алергізація, вплив на імунну систему, формування стійких варіантів збудників) фактично відроджується підхід наших великих попередників – Мечникова, Мапасеіна, Габричевського, Гамалеї, Ермольєвої, - щодо формування в екологічних нішах організму людини мікробіоценозів, оптимально збалансованих для підтримки його гомеостазу.
Цілком виправдане захоплення клініцистів чудодійним ефектом хіміотерапевтичних засобів на початку ери антибіотиків і в її подовження поступово змінюється на помірне і навіть песімистичне. Дійсно, навіть в країнах з високим рівням охорони здоров’я, не дивлячись на вельми широкий арсенал антибіотиків і антисептиків, кількість післяопераційних гнійних ускладнень, в т.ч. і сепсису, поступово збільшується і в деяких клініках вже перевищує рівні, характерні для доантибіотичної ери.
Відповідно до визначника бактерій Берджі (1994) аерококи відносяться до 17-ї групи, яка об’єднує аеробні і факультативно-аеробні позитивні коки. Типовим видом родини Aerococcus є A.viridans. В останні роки на основі 16S pPHK секвенування, біохімічного і жирнокислотного аналізу, шляхом дослідження фенотипової і генетичної кревності аерококоподібних мікроорганізмів, вилучених від людей, диференційовано ще два види аерококів – A.urinae і A.christensenii sp. nov. (M.D. Collins ; M.R. Jovita , R.A. Hutson , 1999).
Все зростаючий інтерес дослідників до аерококів пов’язаний як з наявністю серед них патогенного виду A.urinae (викликає нагнійно-запальні захворювання сечових шляхів, ендокардити, сепсис), так і з вираженими антагоністичними властивостями A.viridans – представника нормальної мікрофлори людини, з широким спектром біохімічної активності, суперпродуцента альфагліцерофосфат оксидази (M. Mackova, J Kost’Al, K Demnerova, 2000) і L-лактат оксидази (K. Maeda-Yorita , K. Aki, H. Sagai, 1995). A.christansenii sp.nov. (тип CCUG 28831Т) ізольовані із піхви людини, та біологічна роль їх поки що не встановлена.
Лікувально-профілактичний препарат для боротьби з гнійно-запальними і кишковими інфекціями з представників нормальної мікрофлори організму людини, грампозитивних коків роду Аеrососсиs розроблений колективом кафедри мікробіології Дніпропетровської медичної академії і в даний час, згідно з наказом МОЗ України від 7 липня 1995 р. включений до реєстру лікарських препаратів, дозволених для застосування в Україні.
Нечисленні дослідження біологічних властивостей аерококів, які визначають їх антагоністичні властивості, відсутність даних по генетиці цих мікроорганізмів і новизна використання аерококів-антагоністів в якості лікувально-профілактичних препаратів для лікування гнійно-запальних інфекцій шкіри і слизових оболонок обумовили мету і задачі дослідження.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – характеристика явища гетерогенності встановлення гетеротрофності аерококів для розробки нових пробіотиків і можливості контролю їх автентичності.
Виходячи з поставленої мети, визначені такі основні завдання дослідження:
- Вилучення аерококів з різних джерел, вивчення їх морфологічних, фізіологічних і біохімічних властивостей.
- Вивчення гетерогенності виділених культур аерококів. Дослідження частоти і умов появи атипічних клітин аерококів і їх властивостей.
- Отримання стабільних клонів атипових клітин аерококів і дослідження процесу їх реверсії до вихідних типів аерококів.
- Дослідження властивостей ревертантів і їх ідентичності вихідним типам. Визначення можливості використання ревертантів для створення нових активних клонів аерококів.
- Визначення і дослідження біологічних процесів і метаболітів, пов'язаних з антагоністичною активністю аерококів, розроблення індикаторних середовищ для реєстрації біохімічних властивостей аерококів.
- Дослідження спонтанної і індукованої мінливісті культур аерококів для отримання високоактивних клонів з біологічними властивостями, що прогнозуються, і селекція нових культур аерококів з визначенням аспектів їх використання.
- Розробка нового критерію визначення автентичності А-бактерину на основі його антагоністичної і оксидазної активності, а також по ступеню індукції виникнення атипових клітин.
Об’єкт дослідження – гетерогенні за біологічними властивостями мікроорганізми роду Аеrососсиs та пробіотичний препарат А-бактерин, створений на їх основі.
Предмет дослідження – штами аерококів з тонкими варіаціями, щодо культуральних (потреба в ауксинах) та біохімічних властивостей, антагоністичної дії, чутливості до антибіотиків, спонтанної мінливості, здатності до цілеспрямованої селекції клонів з заданими якостями.
Методи дослідження . Для виконання поставлених завдань використані мікробіологічні, біохімічні, фізичні, генетичні та статистичні методи.
Наукова новизна одержаних результатів. Показана гетерогенність культур аерококів, що мають різне походження, за біохімічними властивостями. Встановлена наявність в популяції аерококів "Н2О2 - " мутантів аерококів, раніше не описаних, що мають складні морфологічні зміни, пояснені підвищеною продукцією метилгліоксалю. У аерококів означений механізм продукції перекису водню, обумовлений сумою лактатоксидазної, а-гліцерофосфатоксидазної, піруватоксидазної, супероксиддисмутазної активності, що включає в себе утворення супероксидного аніона і його дисмутацію. При цьому виявлений також метаболічний шлях, який веде до продукції молочної кислоти через продукцію метилгліоксалю.
Встановлено декілька біотипів аерококів у залежності від оксидазної або редуктазної активності клонів. Виявлені оригінальні стабільні морфофункціональні мутанти аерококів, які дають гетерогенні ревертанти з різними морфологічними, біохімічними і фізіологічними ознаками.
Отримані результати відкривають перспективу досліджень, пов'язаних з розв'язанням питань щодо ролі аерококів в мікробіоценозах і їхнього впливу на біологічні процеси в місцях колонізації на слизових оболонках.
Практичне значення одержаних результатів. Селекціоновані два штами аерококів: полірезистентний до антибіотиків штам № 167 і штам № 308 - неактивний "Н202 “ мутант, призначений для отримання високоактивних клонів аерококів у процесі реверсії або при генетичній трансформації. Розроблені селективно-індикаторні середовища для аерококів, які дозволяють провести виділення аерококів з контамінованих іншими бактеріями матеріалів, диференціювати їх за біохімічною активністю, гетерогенністю.
Підібраний хіміотерапевтичний комплекс з фармакопейних препаратів "грамурин-етоній", високоантагоністично активний відносно умовно-патогенних і патогенних бактерій, неінгібуючий ріст і розмноження аерококів, що створює селективні умови для аерококів з інгібізацією росту контамінантів у бактерійному препараті. Грамурин-етоній раціонально включати до складу середовищ для вирощування і ліофілізації клітин аерококів.
Удосконалена схема означення автентичності А-бактерину для введення в ФС і ПР виробництва препарату. Отримані і досліджені "Н2О2 –“ мутанти аерококів, що мають складні морфологічні зміни.
Отримані результати відкривають перспективи розв'язання питання щодо ролі аерококів в мікробіоценозах, їх впливу на біологічні процеси в місцях колонізації на слизових оболонках, перспективи створення нового біологічного препарату. Вдосконалені етапи отримання препарату з аерококів з підвищенням антагоністичної активності клітин і їх виживання в процесі ліофільної сушки. Розроблений високочутливий лактатоксидазний сенсор для визначення молочної кислоти на базі іммобілізованих клітин з культур аерококів з підвищеною лактатоксидазною активністю. Запропоновані методи виділення та ідентифікації аерококів з об’єктів зовнішнього середовища, організму людини і тварин.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізована література з фізіологічних. біохімічних, антигенних та антагоністичних властивостей бактерій роду Аеrососсиs, дана оцінка сучасного стану розробки та використання в медицині пробіотиків, визначена перспектива пошуку штамів-антагоністів з широким спектром дії для користування більш ефективних профілактичних та лікувальних засобів. Автором самостійно проведено вивчення гетерогенності популяцій аерококів, ізольованих від людей, тварин та навколишнього середовища, а також дана оцінка їх з позицій явища гетерогенності, перш за все щодо біохімічних властивостей мікробних компонентів А-бактерину. Самостійно вивчена спонтанна мінливість аерококів та селекціоновано їх МФ-мутанти для удосконалення технології виробництва і підвищення клінічної ефективності А-бактерину. Разом з вченими кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської медичної академії МОЗ України розроблені та впроваджені в медичну практику селективно-індикаторні живильні середовища СІС-1. СІС-2 та СІС-3 для вилучення аерококів з контамінованих іншими бактеріями об′єктів та оцінки їх біохімічних властивостей. Матеріали, представлені в роботі, є особистим внеском автора у вирішення проблеми. що вивчається. Автору належить вибір теми дисертації, самостійно виконані: патентно-інформаційний пошук, огляд літератури, визначення напрямків дослідження, накопичення та обробка фактичного матеріалу.
Разом з вченими Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України розроблені та затверджені МОЗ України методичні рекомендації “ Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій “, Харків, 2000.
Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів на кафедрах вищих медичних учбових закладів та в системі післядипломної освіти (Дніпропетровська державна медична академія, Вінницький державний медичний університет ім. М.І. Пирогова, Харківська державна медична академія післядипломної освіти).
Апробація роботи. Матеріали дисертації відображені в доповідях на Міжнародній науковій конференції “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями”, Харків, 2001; Всеукраїнських науково-практичних конференціях “Розвиток санітарної мікробіології в Україні”, Чернівці, 2002 і “Україна наукова”, Київ, 2002; 10-й ювілейній Міжнародній конференції “Нові інформаційні технології в медицині і екології”, Гурзуф, 2002, а також на засіданнях Дніпропетровського філіалу Українського наукового товариства мікробіологів, 1998, 1999, 2000.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 - наукових робіт, з них 3 – в центральних фахових журналах, 2 методичні рекомендації, затверджені МОЗ України (у співавторстві).
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 147 сторінках, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, три розділи власних досліджень з 23 таблицями і 15 рисунками, розділ аналізу і узагальнення здобутих результатів, висновки, список використаних джерел літератури з 213 найменувань, який займає 21 сторінку.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі проаналізовано стан проблеми таксономії аерококів і створення пробіотиків на їх основі, викладено суть мети та наукових завдань, які розв’язувались при виконанні дисертаційної роботи, обгрунтовано актуальність теми дисертації, визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами і темами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, апробацію результатів дисертації, вказано її обсяг і структуру.
У першому розділі подано огляд літератури, в якому наведені та проаналізовані основні дані щодо філогенетичного положення аерококів у систематиці прокаріот, підступи щодо їх ідентифікації за фено- та генотиповими ознаками, нуклеотидними послідовностями 16Sр РНК і гомологєю ДНК-ДНК. Стисло викладено і проаналізовано досягнення сучасної світової науки в розробці пробіотиків. На основі даних літератури доведено актуальність і перспективу конструювання високоефективних пробіотичних препаратів для попередження і лікування нагнійно-запальних захворювань.
Матеріали, методи і обсяг досліджень наведено у другому розділі. У роботі використані мікробіологічні, біохімічні, генетичні і статистичні методи дослідження.
З таксономічною метою було досліджено 105 культур аерококів, виділених з організму людини, 16 культур, виділених з об'єктів зовнішнього середовища, 15 культур, виділених від тварин, 2 виробничих штами для приготування бактерійного препарату і 3 музейні культури аерококів.
Морфологія бактерій досліджувалася за допомогою фазово-контрастної і електронної мікроскопії. Дезінтеграція клітин аерококів досягалася обробкою лізоцимом з ЕДТА (1,2 мг/мл і 0,001 М -відповідно) або ультразвуком на установці УРСК-7Н.
Виділення і часткове очищення ферментного комплексу аерококів проводили за допомогою висолювання сульфатом амонію білків з лізатів клітин, розчиненням осаду в 0,01 М фосфатному буфері (рН 7,4) і діалізом розчину через целофанову мембрану проти 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), як описано Р. Скоупсом (1985). НАД-незалежна лактатдегідрогеназна активність аерококів визначалася згідно з Н.W.Dое11е (1971). Глутатіонредуктазна активність визначалася за методом, описаним Ю.І.Губським з співавт. (1983). Супероксиддисмутазна активність аерококів визначалася згідно з Е.В.Макаренком (1988). Електрофоретичні фракції ферментного комплексу з супероксиддисмутазною активністю локалізувалися за методом С.О.Deauchamp et al. (1971).
Молочна кислота визначалася ензиматичним методом (F.NоІІ, 1974), піровиноградна кислота - ензиматичним та хімічним методами за Умбрайтом (В.Г.Колбом з співавт., 1982). Протеоглікани визначалися за методом Т.Bitter еї а1. (1962), гліоксалаза - як описано Е.Racker (1957). Метилгліоксаль визначався ензиматичним методом (В.С.Асатіані, 1969) і хімічним (В.С.Алексеєв, 1978). Паперова хроматографія метилгліоксаля проводилася, як описано К.Мацеком (1962). Малоновий диальдегід визначався за утворенням дієнового кон'югата з тіобарбітуровою кислотою (Е.А.Строєв з співавт., 1986). Перекис водню враховували ензиматичним методом (Державна фармакопея України, 2001). Білок визначався біуретовим методом (А.G. Gornall еt а1., 1949) і в реакції скріплення білка з барвником - кумассі синім (Р.Скоупс, 1985). Активнісгь розщеплення вуглеводів клітинами аерококів визначалась кондуктометричним методом на апараті ІФАМ - 1. Поглинання кисню при окисленні молочної кислоти клітинами аерококів і їх ферментними комплексами визначали полярографічно і за допомогою електрода Кларка (К.К.АІехаndег еt а1., 1985). Контроль відсутності мутагенної дії аерококів і їх продуктів проводили згідно з В.Ames et а1. (1973).
Іммобілізацію клітин аерококів за допомогою глутарового альдегіду проводили, як описано Ж.Ж.Гальбо з співавт. (1988). Результати досліджень оброблені статистичними методами (П.П.Ашмарін, 1962; П.Ф.Рокицький, 1967).
Результати власних досліджень наведено у третьому – п’ятому розділах.
Попередній таксономічний аналіз дозволив виділити коло мікроорганізмів, схожих з аерокока-ми за основними критеріями групи коків (вміст Г + Ц пар в ДНК, морфологія, культуральні особливості, фізіологічні властивості, біохімічна активність) і близьких до представників роду Аегососсus, описаних R.Е.Williams еt а1. (1953).
Було проведене експериментальне порівняння властивостей виділених культур коків і виробничих штамів з музейними культурами аерококів.
Визначено, що морфологічно схожі вказані мікроорганізми являють собою грампозитивні коки неправильної форми, розташовані по два, чотири, нерідко скупченнями. Доведено широку мінливість морфології аерококів - від зерноутворення до формування гігантських клітин.
Вивчені культури коків ростуть убого на стандартних поживних середовищах: м'ясопептоному агарі та м'ясопептоному бульйоні. Додавання до цих середовищ 10%-вої кінської сироватки майже повністю пригноблює ріст культур, у той час як наявність у середовищі 1 – 3 % людської крові або крові тварин стимулює ріст бактерій. Ріст культур на кров'яному агарі супроводжується багатофазовою зміною кольору навколо колоній. На початку росту навколо колоній виникає виражене позеленіння, що і призвело раніше до їх видового найменування. Після 2-3 діб експозиції при кімнатній температурі позеленіння навколо колоній поступово змінюється на іржаво-червоний стійкий колір, що пов'язано з утворенням окису заліза.
Всі виділені культури і аерококи мали однакові поживні потреби при рості в середовищі певного біохімічного складу з включенням біотину, нікотинової кислоти, пантотенової кислоти, пуринів (гуанін, аденін, ксантин, гіпоксантин), які в деяких випадках можуть бути замінені на рибозо-5-фосфат. Потреба в амінокислотах може мінятися у різних культур коків, але для більшості з них для росту необхідно гліцин, глутамінова кислота, валін, цистеїн і лейцин.
У аерококів відсутні гемутримуючі структури: цитохроми, каталаза і пероксидаза. Культури володіють супероксиддісмутазною і лактатоксидазною активністю, продукують су-пероксидні радикали і перекис водню, добре утилізують більшість вуглеводів, розщеплюючи їх до кислоти без газоутворення, не виділяють аміак при розщепленні аргініну, але відновлюють метиленовий синій при культивуванні в молоці.
Використання спеціально розробленого селективно-індикаторного середовища для оцінки біохімічної активності культур аерококів дозволило диференціювати їх по здатності окислювати йодистий калій у результаті продукування перекису водню /оксидазна активність/ і відновлювати селен з його солі /редуктазная активність/ на три групи: а)культури з вираженою оксидазною активністю, колонії яких при рості на селективно-індикаторному середовищі забарвлюються в інтенсивно-чорний колір і мають чорне забарвлення середовища навколо; б) культури з переважно вираженою редуктазною активністю, колонії яких забарвлені в червоний колір без зони забарвлення навколишнього середовища; в) культури з оксидазно-редуктазною активністю, колонії яких мають червоне забарвлення з чорною зоною забарвлення середовища навколо колоній.
У табл. 1 наведена характеристика культур аерококів по тестах біохімічної активності при рості на селективно-індикаторному середовищі. Аерококи мають ідентичну стійкість до фізико-хімічних чинників: не ростуть при 45 °С, рН 5,0, чутливі до більшості антибіотиків, що широко застосовуються в клініці, стійкі до прогрівання при 60 ° С протягом ЗО хв., ростуть при вмісті в поживному середовищі К2ТеОз близько 100 -мкг/мл, стійкі до дії антисептиків (водень пероксид, фурацилін).
Нуклеотидний склад вивчених штамів мікококів і аерококів дорівнював 38,1-41,8 мол.%Г+Ц в ДНК. Грунтуючись на таксономічному аналізі відомих властивостей аерококів і аналізі експериментального матеріалу, група безпігментних мікококів, продуцентів водень пероксиду, представників нормальної мікрофлори організму людини і тварин, класифікована нами до роду Аегососсus.
Таблиця 1
Характеристика груп аерококів по тестах активності при рості на селективно-індикаторному середовищі
Створення з аерококів лікувально-профілактичного препарату, призначеного для лікування гнійно-запальних інфекцій шкіри і слизових оболонок людини, ініціювало розв'язання питання щодо механізмів антагоністичної активності аерококів.
Давно відомо, що аерококн продукують перекис водню (М.Л.Горбунова, 1970) і гліколіпопротеїд "виридоцин", антагоністична дія якого нейтралізувалася каталазою, додецилсульфатом натрію і прогріванням при 60° С протягом 30 хв. (J.M.Ballester et. al., 1977, 1980).
У роботі І.І.Самойленко з співавт. (1983) була показана підвищена чутливість мутантів бактерій з порушеною репарацією ДНК до дії перекису водню. Використання диких типів Есherichia соlі АВ 1157, Васіllus subtilis GSY 228 і рекомбінація дефектних мутантів Есhеrісhіа соli АВ 2463 гес А13, Васіllus subtilis 1618 гес F виявило підвищену чутливість мутантів в порівнянні з їх дикими типами до дії екзометаболітів аерококів.
Чітко збалансовані селективно-індикаторні середовища і синтетичні середовища певного біохімічного складу багато в чому визначають успіхи у вивченні фізіологічних, біохімічних та генетичних властивостей бактерій. Для Аегососсus viridans раніше запропоноване селективне середовище (R..Е. Williams еt а1., 1950) і була зроблена спроба розробки середовища певного біохімічного складу (Т.L.Міlleг еt а1., 1970), яка не увінчалася успіхом. Для виділення аерококів з контамінованих матеріалів використовувалося поживне середовище (м'ясо-пептоний агар), що містить 0,01% перекису водню (М.Л.Горбунова, 1970).
Нами поставлена і вирішена задача розробки штучного живильного середовища для аерококів, яке володіло б індикаторними властивостями на продукцію клітинами водню пероксиду.
Оптимальним живильно-індикаторним середовищем виявилась композиція за таким складом інгредієнтів (в гр/л дистильованої води):
Нижній селективно-індикаторний шар
Розчинний крохмаль 10,0
Калію йодид 23,0
Натрію селеніт 0,4
Грамурін 0,03
Етоній 0,002
Агар-агар 15,0
Сольовий концентрат
Амонію хлорид 20,0
Амонію нітрат 4,0
Натрію сульфат 8,0
Калію водень фосфат 12,0
Калію діводень фосфат 4,0
Магнію сульфат 0,4
Грамурін 0,15
Етоній 0,015
Верхній ростовий шар
Сольовий концентрат 200,0
Нікотинова кислота 0,05
Біотин 0,001
Кальцію пантотенат 1,0
Пурин (або рибозо-5-фосфат) 0,01
Глутамінова кислота 0,5
Гліцин 1,0
Цистеїн 0,05
Лейцин 0,05
Валін 0,05
Марганцю гліцерофосфат 0,4
Інозит 1,0
Глюкоза 10,0
Агар-агар 12,0
Компоненти середовища стерилізуються при 1 ат протягом ЗО хв. При приготуванні середовища спочатку формується нижній індикаторний шар, а після його застигання в чашці Петрі зверху нашаровується верхній ростовий шар. Після затвердіння середовище готове до висіву культури мікробів. Середовище отримало умовне найменування СІС-2.
При роботі з мікроорганізмами з невідомими поживними потребами можлива заміна вказаного вище верхнього шару на м'ясо-пептонний агар або будь-яке інше повноцінне середовище (СІС-1). Для направленого визначення лактатоксидазної активності клітин аерококів до складу СІС-2 у ростовий шар додається на 1 л середовища, молочна кислота в концентрації 0,05 г на 1 л середовища і глутатіон відновлений - 0,1 г, що відіграє роль протектора клітин аерококів (СІС-3). Диференціація культур аерококів на "оксидазні", "редуктазні" і проміжні варіанти можлива при їх посіві на середовища СІС-1 і СІС-2.
При розсіюванні клітин аерококів газоном на СІС-2 і внесенні у вміщений в центр чашки Петрі металевий циліндр 0,045 М розчину молочної кислоти або її солі навколо циліндра утворюється зона окислення лактату чорного забарвлення (d = 35-40 мм).
Дослідження лактатоксидазної активності ферментних комплексів, що виділяються з лізатів аерококів, показало їх НАД - незалежність і залежність окислення лактату від концентрації білка в ферментному комплексі. Було виявлено, що піруват, який нагромаджується в реакції окислення лактату, здатний реагувати з екзогенним воднем пероксидом. У той же час, екзогенний піруват, що вводиться до складу поживного середовища в концентрації 5 мМ, практично повністю нейтралізує антагоністичну дію 6мМ водню пероксиду відносно чутливих тест-бактерій, а також знімає антагоністичну дію аерококів, обумовлену продукцією водню пероксиду. Результати експериментів вказують на антиоксидантну роль піровиноградної кислоти у аерококів та мікроорганізмів, позбавлених гемвмісних систем (каталаза, пероксидаза, цитохром).
У табл. 2 підсумовані результати експериментів по визначенню активності ферментів і накопиченню біологічно активних метаболітів у ланцюзі утворення і окислення молочної кислоти у аерококів. Наведені дані щодо 2-х "оксидазних" варіантів - № 201 і № 167, "редуктазного" штама - № 82006, стосовно якого проводився розрахунок достовірності відмінностей показників, і "Н202-“ мутанта № 308. Видно, що активність лактатоксидази і супероксид-дисмутази ферментних комплексів "оксидазних" штамів достовірно вище за ті ж види "редуктазного" штаму. У "Н202-“ мутанта відсутні лактатоксидазна активність, продукція супероксидного радикалу і водню пероксиду.
На процес окислення молочної кислоти ферментним комплексом, поглинання кисню і антагоністичну активність аерококів впливають амінокислоти, введені в реакційну систему або до складу поживного середовища, на якому вирощуються аерококи для випробування антагоністичної активності. Тирозин, гліцин, лізин, треонін, ізолейцин, валін, пролін, глута-тіон окислений та цистин достовірно посилюють лактатоксидазну активність ферментного комплексу. Лізин, треонін, глутамінова кислота, метіонін, аланін гістидин, пролін, глутатіон окислений і відновлений, цистеїн і цистин посилюють поглинання кисню при окисленні ферментним комплексом молочної кислоти. Введення до складу поживного середовища треоніну, глутамінової або аспарагінової кислоти, валіну, глутатіону відновленого і цистеїну посилює антагоністичну активність аерококів "іn vitro".
Дослідження показали, що антагоністична активність препарату з аерококів зумовлена продукцією водню пероксиду і АЕК. Штам Aerococcus viridans 167, використаний для приготування препарату, є диким типом аерококів, виділеним з грудного молока, чутливим до більшості антибіотиків. Технологічний регламент приготування препарату з аерококів був запозичений з регламенту виробництва колібактерину і не враховував особливостей метаболізму аерококів. Заплановане широке застосування нового оригінального препарату з аерококів для лікування гнійних ран та кишкових порушень ставить завдання отримання антибіотикорезистентного варіанту аерококів, що обумовило б можливість його подальшого застосування в комплексі або разом з антибіотиками.
У результаті послідовного пасирування початкового штаму аерококу № 167 на поживних середовищах, що містять зростаючі концентрації антибіотиків, отриманий полірезистентний штам № 167 VR з підвищеною антагоністичною активністю щодо пеніцилінорезистентних і пеніциліночутливих стафілококів.
Аналіз достатньої кількості колоній з природного розсіювання аерококів і з розсіванням суспензій, оброблених N- нітрозо N-N-метилсечовиною і етиленіміном, дозволив виявити групу “Н2О2 – “ мутантів, які характеризувались втратою лактатоксидазної і антагоністичної активності, а також зміною морфології клітин.
При електронно-мікроскопічному дослідженні клітин “Н2О2 – “ мутанта № 308 виявлено, що на відміну від клітин початкового штама № 167, у клітин мутанта виявляється фібрилярна мікрокапсула і електронно-щільні глибки різних розмірів у цитоплазмі, а також більш великі електронно-щільні відсвіти в зоні нуклеотиду. Реверсія “Н2О2 – “ мутантів до "дикого" типу вела до відновлення морфології початкових клітин, лактатоксидазної і антаго0ністичної активності "in vitro" з появи ревертантів двох типів. "Оксидазні" варіанти характеризувалися гіперсинтезом водню пероксиду і посиленням антагоністичної активності. "Редуктазні" ревертанти відрізнялися слабкою продукцією водню пероксиду і підвищенням концентрації антагоністичної фракції в АЕК.
У табл.3 представлені основні властивості початкових штамів аерококів і ревертантів двох типів, отриманих з "Н202 –“ мутанта № 308. Посилення корисних властивостей ревертантів дозволяє використати прояви прямої мутації і реверсії для направленої селекції високобіологічноактивних культур аерококів.
Лікувальний ефект різних штамів аерококів, відібраних у процесі селекції, був доведений на моделі місцевої синьогнійної інфекції у мишей. Застосування аерококів вело до швидкого зняття симптомів локального запалення. Профілактичний ефект тих же штамів був показаний і на моделі сальмонельозної інфекції у білих мишей.
Тест Еймса з використанням повної мікросомальної активуючої системи не виявив мутагенної дії ні клітин аерококів, ні їхніх метаболітів.Встановлення механізмів антагоністичної активності, селекція високоактивних штамів, підбір чинників, що впливають на антагоністичну активність, дозволили запропонувати ряд удосконалень технологічного процесу приготування пробіотичного препарату з аерококів. Для стимуляції синтезу антагоністичної фракції АЕК запропоновано введення в середовище вирощування 1%-вої глюкози, а для посилення синтезу водню пероксиду запропоновано введення в середовище вирощування аерококів 0,01% -вого треоніну.
Як антиконтамінуючу добавку запропоновано введення в середовище висушування препарату антибактерійного комплексу грамурину з етонієм, а для захисту клітин від токсичних метаболітів - лізат Deinococcus radiodurans, що містить супероксиддисмутазу.
Таблиця 3
Біологічна активність “дикого” типу аерококів № 167, селекціонованого 167VR, "Н202–“ мутанта № 308 і ревертантів “оксидазного” і “редуктазного” типів
Висока специфічність лактатоксидазної активності аерококів, особливо "оксидазних" культур, дозволила розробити лактатчутливий сенсор на базі імобілізованих клітин аерококів для визначення молочної кислоти з пороговою чутливістю 0,1 - 1,0 мМ лактату в зразку.
У розділі аналізу і узагальнення результатів досліджень у стислій формі наведено підсумки проведених експериментів, результати реалізації поставленої мети і задач дисертаційної роботи.
В дисертаційній роботі на підставі теоретичного аналізу та експериментального дослідження обгрунтовано нові оригінальні підступи щодо ідентифікації аерококів та селекції штамів з вираженими антагоністичними властивостями і на їх основі конструювання ефективних пробіотичних препаратів.
| 
