Библиотечный каталог авторефератов Украины

НАЦІОНАЛЬНА  АКАДЕМІЯ  НАУК  УКРАЇНИ

Інститут  біохімії  ім.  О.В. Палладіна

ЯКИМОВИЧ  МАРІЯ  ЯРОСЛАВІВНА

УДК 615.277.3:577.112.853

ВПЛИВ  ТРАНСФОРМУЮЧОГО  ФАКТОРА  РОСТУ  ТИПУ БЕТА НА  КЛІТИНИ  ЛІНІЇ  L1210  ЛЕЙКЕМІЇ  МИШі  З  РІЗНОЮ  ЧУТЛИВІСТЮ  ДО  ДІЇ  ЦИСПЛАТИНУ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі регуляції проліферації клітин Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник -

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Відділення регуляторних систем клітини

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

керівник відділення,

завідуючий відділом регуляції проліферації клітин.

Офіційні опоненти: 

доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович,

Львівський державний університет ім. Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії;

доктор медичних наук Микоша Олексій Степанович,

керівник лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України.

Провідна установа -

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

відділ молекулярної генетики, м. Київ.

Захист відбудеться  “25” жовтня 1999 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат розісланий  “16” вересня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук         Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Під час хіміотерапевтичного лікування хворих із злоякісними новоутвореннями все частіше виявляються пухлинні клітини, стійкі до дії застосовуваних препаратів. За даними Kerbel, 1997, така набута резистентність розвивається майже у 30% хворих, які піддавалися хіміотерапії. Тому актуальним є вивчення механізмів резистентності клітин до дії окремих протипухлинних препаратів з тим, щоб перешкодити цьому негативному процесу і уникнути використання неефективних ліків.

Цисплатин широко застосовується для лікування хворих на карциноми яєчників, молочної залози, шлунка, кишківника, сечового міхура, пухлини голови та шиї, гемобластози. Вважають, що цитотоксична дія цього препарату на клітини зумовлена його ковалентним зв’язуванням з ДНК з утворенням одно- і дволанцюгових зшивок ДНК та зшивок ДНК з білками [Chu, 1994]. Внаслідок такого пошкодження ДНК клітини можуть гинути шляхом апоптозу [Sorenson, et al., 1990, Henkels and Turchi, 1997].

Лікування цисплатином, як і іншими протипухлинними препаратами, може викликати розвиток резистентності злоякісних клітин до його дії. Переважно рівень такої резистентності не перевищує 50 разів, хоча є дані про існування клітин, які в 1000 разів стійкіші до дії цисплатину, ніж їх батьківські попередники. Необхідно зазначити, що навіть незначне підвищення резистентності пухлин до цисплатину є серйозною клінічною проблемою, оскільки збільшення дози препарату під час лікування може викликати розвиток ниркової недостатності, периферійну нейропатію, глухоту, кровотечі та інші патологічні стани [Chu, 1994].

Є дані, що резистентність пухлинних клітин до дії цисплатину може забезпечуватися кількома різними механізмами, а саме: 1) зменшенням нагромадження препарату в клітинах; 2) підвищенням внутрішньоклітинного рівня глутатіону або активності глутатіон-S-трансферази; 3) зростанням вмісту внутрішньоклітинних металотіонеїнів; 4) посиленням процесів репарації ДНК у клітинах; 5) пошкодженням механізмів апоптичної загибелі клітин [Шишова и Чехун, 1998; Segal-Bendirdjian, et al., 1998]. Однак, жоден з цих механізмів не є універсальним.

В останні роки зростає кількість даних про участь сигнальних шляхів поліпептидних факторів росту в регуляції відповіді злоякісних клітин на дію різних хіміотерапевтичних препаратів, хоча отримані результати є досить суперечливими. Показано, що епідермальний фактор росту (ЕФР), трансформуючий фактор росту (ТФР) типу α посилюють токсичну дію цисплатину щодо клітин лінії MDA-468 раку молочної залози, а зниження рівня експресії цими клітинами функціонального рецептора ЕФР призводить до припинення такого ефекту [Dixit, et al., 1997]. Однак, у клітинах цієї пухлини лінії MCF-7, резистентних до дії доксорубіцину, виявлено підвищену кількість рецепторів ЕФР у порівнянні з їх чутливими попередниками [Wosikowsky, et al., 1997]. У клітинах лінії ЕМТ6 пухлини молочної залози, резистентних до дії цисплатину і циклофосфаміду, зафіксовано підвищений рівень ТФРβ [Teicher, et al., 1997]. Декорин, який є інгібітором дії ТФРβ, викликав практично повну втрату такої резистентності. В інших дослідженнях було показано, що ТФРβ1 посилює летальну дію цисплатину на клітини лінії А549 карциноми легенів людини та епітеліальні клітини лінії Mv1Lu легенів норки [Raynal, et al., 1997].

Молекулярні механізми, які опосередковують дотичність шляхів передачі сигналу ТФРβ з механізмами резистентності злоякісних клітин до дії протипухлинних препаратів, зокрема цисплатину, залишаються маловивченими. З’ясування таких зв’язків може забезпечити основу для розробки нових, ефективніших підходів у подоланні резистентності пухлинних клітин до дії протипухлинних препаратів з метою їх знешкодження та для підвищення стійкості нормальних клітин організму під час застосування хіміотерапії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі регуляції проліферації клітин Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України згідно з планом науково-дослідної роботи за темою “Дослідження ролі поліпептидних факторів росту у відповіді нормальних і пухлинних клітин на дію стресових чинників” (№ держреєстрації 01970004658).

Мета і завдання дослідження. Головною метою роботи було дослідити механізми зв’язку між резистентністю клітин лінії L1210 лейкемії миші до дії протипухлинного препарату цисплатину та їх чутливістю до регуляторного впливу трансформуючого фактора росту β1. Для досягнення цієї мети у дисертаційній роботі вирішували наступні завдання:

1. порівняти вплив ТФРβ1 на проліферацію та апоптоз клітин лінії L1210, чутливих та резистентних до цитотоксичної дії цисплатину;
2. порівняти експресію головних компонентів сигнального шляху ТФРβ, таких як специфічні рецептори та білки Smad - внутрішньоклітинні провідники регуляторного сигналу цього цитокіна - у клітинах лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину;
3. дослідити вплив на клітини лінії L1210, які виявляють різну чутливість до дії цисплатину, таких чинників, як цитотоксичні лектини та гіпертермія;
4. дослідити вуглеводні детермінанти поверхні клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину за допомогою окремих лектинів.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше встановлено, що резистентність клітин лінії L1210 лейкемії миші до протипухлинного препарату цисплатину співпадає з  їх стійкістю до дії ТФРβ як інгібітора росту та індуктора апоптозу.
2. Вперше показано, що втрата чутливості до дії ТФРβ у резистентних до цисплатину клітин лінії L1210 є асоційованою з  суттєвим зниженням у них рівня експресії специфічних рецепторів І типу ТФРβ та посиленням експресії інгібіторного білка Smad6, який перешкоджає передачі регуляторного сигналу ТФРβ у клітинах-мішенях. Експресія інших білків Smad (Smad2, Smad3, Smad4, Smad7) у клітинах з різною чутливістю до дії цисплатину є подібною.
3. Виявлено відмінності у складі глікопротеїнів плазматичних мембран між клітинами лінії L1210, резистентними до дії цисплатину, та їх чутливими попередниками. Зокрема, відзначено посилену експресію у резистентних клітин цієї лінії мембранного глікопротеїна молекулярною масою близько 240 кДа, який взаємодіє з лектином арахісу Arachis hypogaea (PNA).
4. Показано, що резистентні до цисплатину та ТФРβ лейкемічні клітини лінії L1210 є чутливими до дії деяких цитотоксичних лектинів та гіпертермії.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані у роботі дані про механізми порушення сигнальних шляхів ТФРβ у клітинах лейкемії, які характеризуються підвищеною резистентністю до цитотоксичної дії протипухлинного препарату цисплатину, можуть бути експериментальною основою для розробки нових підходів у хіміотерапевтичному лікуванні онкологічних хворих з підвищеною стійкістю до цього препарату. Крім цього, у таких випадках може бути корисним застосування аглютиніну 1 з омели (VAA-1) та локальної гіпертермії пухлини.

Результати, що стосуються індукції апоптозу пухлинних клітин під дією окремих хіміотерапевтичних препаратів та цитокінів можуть використовуватися у спецкурсах з клітинної біохімії на біологічних факультетах університетів.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана дисертантом самостійно за винятком аналізу глікопротеїнів поверхні клітин з використанням лектинів, який здійснювався спільно з д.б.н. Луциком М.Д., к.фарм.н. Антонюком В.О. та к.б.н. Стасиком Т.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на конференції молодих вчених в Інституті експериментальної онкології, патології і радіобіологіі ім. Р.Є. Кавецького НАН України (Київ, 1997), на 6-й конференції європейського товариства аналітичної клітинної патології (Гейдельберг, Німеччина, 1999) і на міжнародній конференції INTERLEC 18 (Портсмут, Великобританія, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, з них 5 статей.

Структура і об’єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів (огляд літератури, методи досліджень, результати досліджень, обговорення результатів), висновків та списку використаних джерел, який містить 261 найменування. Робота викладена на 155 сторінках, проілюстрована 41 рисунком і 1 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури. Описані молекулярні механізми, внаслідок порушення яких відбувається трансформація нормальних клітин у пухлинні. Висвітлені механізми індукції апоптичної загибелі клітин, пошкодження яких є однією з причин їх злоякісної трансформації. Наведені дані про причини виникнення резистентності злоякісних клітин до дії протипухлинних препаратів, зокрема до цисплатину. Значна увага приділена розглядові структури, рецепторів і сигнального шляху дії ТФРβ - широкорозповсюдженого цитокіна, який бере участь у регуляції проліферації, диференціації та апоптозу клітин. Окремі розділи присвячені опису механізмів дії на клітини рослинних лектинів та гіпертермії.

Методи досліджень. Об’єктом досліджень були клітини лінії L1210 лейкемії миші та клітини сублінії L1210/R з підвищеною резистентністю до дії протипухлинного препарату цисплатину. Використані у роботі клітини були отримані з Колекції клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Клітини вирощували в середовищі Ігла, модифікованому Дальбекко (ДМЕ), у присутності 10% сироватки крові з ембріонів великої рогатої худоби (СК) і антибіотика гентаміцину (50 мкг/мл).

Проліферативну активність клітин визначали: 1) шляхом підрахунку їх кількості в камері Горяєва і визначення відсотка мертвих клітин у тесті з використанням трипанового синього; 2) за включенням 3Н-тимідину в ДНК клітин; 3) за кількістю утворених колоній у середовищі, що містило 0,33% агару [Rizzino, 1987].

Цитотоксичність досліджуваних речовин визначали, додаючи їх до культурального середовища у присутності 10% СК. Для вивчення впливу ТФРβ1 клітини попередньо витримували 24 год у середовищі ДМЕ без СК, після чого додавали цитокін і СК (5%). Для вивчення впливу гіпертермії клітини прогрівали на водяній бані при 42 або 43 0С і після цього інкубували при 37 0С.

Апоптичні клітини виявляли за характерною фрагментацією ДНК, яку виділяли і розділяли методом електрофорезу в 1% агарозному гелі [Кудрявец и др., 1996]. ДНК фарбували етидій бромідом, який додавали в електродний буфер до кінцевої концентрації 2 мкг/мл. Зони ДНК на електрофореграмі виявляли в ультрафіолетовому випромінюванні.

Для дослідження експресії компонентів сигнального шляху ТФРβ білки лізатів клітин і мембранної фракції розділяли електрофоретично в поліакриламідному гелі (ПААГ) за методом Леммлі [Laemmli, 1970] і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Рецептори І і ІІ типу ТФРβ та білки Smad ідентифікували за допомогою специфічних антитіл, люб’язно подарованих доктором Сушельницьким С.І. (Людвігівський інститут раку, Швеція). Місця зв’язування антитіл виявляли за допомогою методу хемілюмінесценції. Концентрацію білка в пробах визначали за методом Петерсона [Peterson, 1977].

Концентрацію ТФРβ1 у кондиціонованих клітинами культуральних середовищах визначали за допомогою набору для кількісної детекції ТФРβ1 Quantikine (“R&D Systems”, США).

Глікозильні детермінанти поверхні клітин досліджували за: 1) аглютинацією клітин лектинами [Цегельский и др., 1989]; 2) зв’язуванням лектинів з клітинами з використанням цитохімічних методів [Луцик и др, 1989]; 3) зв’язуванням лектинів, мічених пероксидазою хрону, з білками клітинних мембран, розділених електрофоретично і перенесених на нітроцеллюлозну мембрану.

Статистичну обробку здійснювали за результатами 3-4 експериментів з трьома повторами у кожному варіанті. Середнє значення “М” і середню похибку “m” розраховували, як описано в [Сорін, Виноградова, 1975]. Порівняння двох мінливих величин проводили на основі показника вірогідності різниці “t” (критерій Ст’юдента). Відмінність між величинами вважали достовірною, коли імовірність різниці Р була меншою 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив ТФРβ1 на проліферацію клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

Є дані, що ТФРβ інгібує ріст та індукує апоптоз клітин лінії L1210 [Motyl, 1998], тоді як клітини цієї лінії, резистентні до цисплатину, такому дослідженню не піддавалися. Ми порівняли чутливість клітин сублінії L1210 та клітин вихідної лінії до дії ТФРβ1.

Встановлено, що ТФРβ1 достовірно знижує рівень включення 3Н-тимідину в ДНК клітин лінії L1210. При концентрації ТФРβ1 10 нг/мл включення радіоактивної мітки становить 66% від рівня контролю. Цей ефект має дозозалежний характер. У той же час рівень включення 3Н-тимідину в ДНК клітин сублінії L1210/R практично не змінюється навіть при концентрації ТФРβ1 50 нг/мл.

В іншому досліді показано, що ТФРβ1 у концентрації 5 нг/мл сильно інгібує проліферацію клітин лінії L1210 (рис. 1а). Так, після 4 діб інкубації кількість клітин, які росли у присутності даного цитокіна, є в три рази нижчою, ніж у контролі. Ріст клітин сублінії L1210/R практично не змінюється під впливом таких концентрацій ТФРβ1 (рис. 1б).

ТФРβ1 виявляє інгібуючий вплив на ріст клітин лінії L1210 у середовищі, що містить 0,33% агару. Так, даний цитокін у концентрації 5 нг/мл на 46% знижує кількість колоній, утворених клітинами лінії L1210, але не змінює рівня колонієутворення клітин сублінії L1210/R. Необхідно зазначити, що ТФРβ1 посилює інгібуючий вплив цисплатину на ріст в агаризованому середовищі клітин лінії L1210 і практично не впливає на дію цього препарату у випадку клітин сублінії L1210/R.

Отже, на підставі цих даних можна зробити висновок, що клітини сублінії L1210/R, які є стійкішими до дії цисплатину, виявляють резистентність до рістінгібуючого впливу ТФРβ. Необхідно підкреслити, що це перший виявлений приклад позитивної кореляції між резистентністю пухлинних клітин до дії цисплатину та їх стійкістю до інгібування ТФРβ.

Індукція апоптозу під впливом цисплатину і ТФРβ1 у клітинах лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

Інгібуюча дія цисплатину і ТФРβ на клітини лінії L1210 може бути зумовлена індукцією в них апоптозу [Sorenson, et al., 1990; Motyl, 1998]. Вважається, що порушення механізмів апоптичної загибелі є однією з причин резистентності злоякісних клітин до дії цисплатину [Segal-Bendirdjian, et al., 1995]. Ми порівняли здатність цисплатину і ТФРβ1 індукувати апоптоз у клітинах лінії L1210 та сублінії L1210/R.

Як видно з результатів, наведених на рис. 2, ТФРβ1 (5 нг/мл) та цисплатин (0,1 мкг/мл) індукують апоптоз у клітинах лінії L1210. У той самий час ні ТФРβ1 (5 нг/мл), ні цисплатин (1 мкг/мл) не викликають фрагментації ДНК, характерної для апоптозу, у клітинах сублінії L1210/R.

Дослідження сигнального шляху ТФРβ та його продукції у клітинах лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

Щоб з’ясувати механізми резистентності клітин сублінії L1210/R до дії ТФРβ, ми дослідили експресію компонентів сигнального шляху цього цитокіна. Відомо, що взаємодія ТФРβ зі специфічними клітинними рецепторами викликає їх активацію. Від поверхневих рецепторів ТФРβ до ядра клітини-мішені сигнал передається білками Smad. Білки Smad2 і Smad3 безпосередньо взаємодіють з активованими рецепторами і фосфорилюються ними. Білок Smad4 взаємодіє з фосфорильованими білками Smad2 і Smad3, утворюючи комплекс, який переноситься в ядро, де бере участь в активації транскрипції. Функцію інгібіторів регуляторного сигналу ТФРβ в клітині виконують білки Smad6 і Smad7 [Derynk and Feng, 1997; Massague, 1998].

Методом Western-блот аналізу з використанням специфічних антитіл ми показали, що клітини лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину відрізняються за рівнем експресії рецептора І типу ТФРβ (рис. 3). Цей білок м.м. 55 кДа добре виявляється у мембранних препаратах, отриманих з батьківських клітин лінії L1210, і дуже слабо експресується у мембранах клітин сублінії L1210/R. У той самий час рецептори ІІ типу чітко виявляються в мембранних препаратах як батьківських, так і резистентних до дії цисплатину клітин лінії L1210 (рис. 3).

Як у клітинах лінії L1210, так і в клітинах сублінії L1210/R експресуються білки Smad2, Smad3, Smad4, Smad6 і Smad7, які модулюють передачу регуляторного сигналу ТФРβ. Нами не виявлено відмінностей в експресії білків Smad2, Smad3 і Smad4 між батьківськими, чутливими до цисплатину клітинами, та резистентними до дії цього препарату клітинами сублінії L1210/R (рис. 4). Такі чинники, як ТФРβ1 (5 нг/мл, 1 год), цисплатин (1 мкг/мл для клітин лінії L1210, 10 мкг/мл для клітин сублінії L1210/R, 24 год) і VAA-1 (5 нг/мл, 24 год) суттєво не змінюють експресії цих білків у досліджуваних клітинах (рис. 4). Дослідження впливу вказаних агентів було зумовлене їх здатністю індукувати апоптичну загибель клітин лінії L1210.

Необхідно відзначити, що експресія активної, фосфорильованої форми білка Smad2 специфічно індукується під дією ТФРβ1 як у батьківських клітинах лінії L1210, так і в резистентних до цисплатину клітинах сублінії L1210/R (рис. 4). При дії цисплатину і VAA-1 фосфорильована форма білка Smad2 не виявляється, що свідчить про високу специфічність індукції регуляторного сигналу ТФРβ.

Як видно з рис. 4, рівень експресії білка Smad7 у клітинах лінії L1210 і в їх похідних з підвищеною резистентністю до цисплатину є однаковим. Однак, рівень експресії білка Smad6 є вищим у клітинах сублінії L1210/R, ніж у батьківських клітинах цієї лінії.

Оскільки під впливом ТФРβ1 як на клітини лінії L1210, так і на клітини сублінії L1210/R виявляється фосфорильований білок Smad2, можна зробити висновок, що рецептор І типу ТФРβ все ж присутній у мембранах клітин сублінії L1210/R, але у значно меншій кількості, ніж у батьківських клітинах. Можна припустити, що підвищена резистентність клітин сублінії L1210/R до дії ТФРβ є наслідком значного зниження в них кількості рецептора І типу даного цитокіна. Крім цього, отримані нами результати розкривають ще один можливий механізм резистентності клітин сублінії L1210/R до дії ТФРβ, а саме через посилення експресії інгібіторного білка Smad6.

Зміна продукції клітинами ТФРβ може впливати на розвиток злоякісності пухлин [Terzaghi-Howe, 1989; Фильченков и др., 1994]. Ми встановили, що рівень ТФРβ1 у культуральному середовищі, кондиціонованому клітинами сублінії L1210/R, є значно вищий, ніж у середовищі, кондиціонованому батьківськими клітинами цієї лінії (рис. 5). Цисплатин і, особливо, VAA-1 значно підвищують продукцію ТФРβ1 клітинами лінії L1210, тоді як ефект цих речовин на клітини сублінії L1210/R виражений слабше. Отже, отримані нами дані вказують на можливість існування певного взаємозв’язку між дією окремих протипухлинних препаратів і експресією ТФРβ1 в організмі.

Вплив лектинів на ріст клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

Лектини є полівалентними лігандами, які приймають участь у міжклітинних взаємодіях [Луцик и др., 1981]. Деякі лектини є надзвичайно токсичними для клітин і можуть використовуватися у протипухлинній терапії [Carlini and Guimaraes, 1991; Bussing, et al., 1997]. Тому було цікаво встановити, чи не супроводжується поява резистентності клітин лінії L1210 до цисплатину зміною їх чутливості до дії різних лектинів.

При дослідженні впливу такого широковживаного лектину, як конканавалін А (Con A) встановлено, що лише високі його концентрації (1-100 мкг/мл) володіють рістінгібуючою активністю і цитотоксичним ефектом щодо клітин лінії L1210. Клітини сублінії L1210/R, резистентні до цисплатину, є чутливішими до впливу Con A. Так, 50%-не інгібування росту клітин лінії L1210 спостерігається при концентрації Con A 20 мкг/мл, а клітин сублінії L1210/R - при концентрації цього лектину 2 мкг/мл. 

Такі токсичні лектини, як аглютинін рицини (RCA-120) і VAA-1 сильно інгібують ріст клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину. RCA-120 виявляє однаковий рістінгібуючий вплив на клітини лінії L1210 і сублінії L1210/R. При концентрації цього лектину 10 нг/мл ріст клітин інгібується на 80%. Однак, токсичний ефект RCA-120 сильніше виражений щодо клітин сублінії L1210/R. Так, при концентрації даного лектину 10 нг/мл серед клітин лінії L1210, резистентних до цисплатину, виявляється близько 30% мертвих, тоді як серед чутливих до дії цього препарату клітин даної лінії відсоток загиблих не перевищує 15%.

VAA-1 також здійснює сильний рістінгібуючий і цитотоксичний вплив на клітини лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину. 50%-не інгібування росту клітин сублінії L1210/R спостерігається при концентрації VAA-1 1 нг/мл, а батьківських клітин цієї лінії - при концентрації лектину 5 нг/мл (рис. 6а). Кількість мертвих клітин при таких концентраціях лектину становить 15% від загальної їх кількості (рис. 6б).

Рис. 6

Вплив VAA-1 на проліферацію клітин лінії L1210 та сублінії L1210/R: а - кількість живих клітин; б - відсоток мертвих клітин ; n - клітини лінії L1210; l - клітини сублінії L1210/R; К - контроль.

Для порівняння ми також вивчили вплив VAA-1 на проліферацію псевдонормальних фібробластів з ембріона миші лінії NIH-3T3. В одному експерименті досліджували вплив VAA-1 на клітини лінії NIH-3T3, які активно проліферували. В другому лектином обробляли клітини, які перебували у стані спокою (фаза клітинного циклу G0), викликаному контактним інгібуванням росту. VAA-1 ефективно інгібує ріст клітин лінії NIH-3T3. 50%-не інгібування росту спостерігається при концентрації лектину 2 нг/мл. VAA-1 у концентрації до 100 нг/мл помітно не впливає на клітини, які перебувають у стані спокою, і лише при концентрації 1 мкг/мл знижує їх кількість. Підрахунок мертвих клітин показав, що аглютинін 1 з омели, навіть у концентрації 100 нг/мл не викликає суттєвого збільшення їх кількості. Лише при концентрації VAA-1 1 мкг/мл кількість мертвих серед клітин, які активно проліферують, зростає до 30%, а серед клітин, які перебувають у стані спокою - до 19%.

Con А, як і у випадку клітин лінії L1210, виявляє рістінгібуючий вплив на клітини лінії NIH-3T3 лише у високих концентраціях. Так, у концентрації 1 мкг/мл він інгібує ріст клітин цієї лінії на 40%. Сильною цитотоксичною дією Con A володіє лише у концентрації 100 мкг/мл, коли фарбування трипановим синім виявляє близько 50% мертвих клітин.

Отримані дані свідчать, що злоякісні клітини мають вищу чутливість до цитотоксичної дії VAA-1, ніж нормальні клітини. Крім цього, чутливість до даного лектину залежить від швидкості проліферації клітин-мішеней. Клітини, які інтенсивніше діляться, очевидно, є чутливішими до дії цього лектину.

Щоб з’ясувати можливий механізм цитотоксичної дії лектинів на клітини лінії L1210 з різною чутливістю до цисплатину ми дослідили їх здатність індукувати апоптоз. Виявилося, що VAA-1 і RCA-120 у концентрації 10 нг/мл індукують появу інтенсивної фрагментації ДНК, характерної для апоптозу, як у клітинах лінії L1210, так і в клітинах сублінії L1210/R (рис. 7). ConА у концентрації 1 мкг/мл не викликає такого ефекту. Поява апоптичних фрагментів ДНК у клітинах лінії L1210 та сублінії L1210/R спостерігається лише після їх обробки СоnА у концентрації 25 мкг/мл (рис. 7).

Варто відзначити, що у псевдонормальних фібробластів з ембріона миші лінії NIH-3T3 VAA-1 та RCA-120 не індукують апоптозу в концентраціях, які викликають загибель клітин лінії L1210. Навіть після обробки клітин лінії NIH-3T3 аглютиніном 1 з омели у концентрації 10 мкг/мл не спостерігається поява характерної для апоптозу фрагментації ДНК.

Порівняльне вивчення глікозильних детермінант поверхні клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

Враховуючи дані про вплив окремих лектинів на клітини лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину, закономірно було порівняти глікозильні детермінанти поверхні цих клітин. До цього нас спонукали також спостереження про відміни у їх цитоморфології та адгезивності.

Для досліджень вуглеводних детермінант поверхні клітин ми використали лектини, що слугували своєрідними молекулярними “зондами” до певних вуглеводних структур. Глікопротеїни мембран клітин лінії L1210 та сублінії L1210/R виявляли після переносу електрофоретично розділених білків на нітроцелюлозну мембрану, використовуючи лектини, мічені пероксидазою хрону. Для дослідження використовували такі лектини, як Con A, PNA, лектин з виноградного слимака (HPA).

Виявлено значні відмінності у складі мембранних глікопротеїнів клітин лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину. Найчіткішою з них є посилена експресія мембранного глікопротеїна м.м. 240 кДа у клітинах сублінії L1210/R. У батьківських клітинах лінії L1210 цей білок практично не виявляється. Даний глікопротеїн взаємодіє як з PNA, так і з Con A, що свідчить про те, що у його складі містяться як О- так і N- зв’язані олігосахаридні ланцюги. Вища молекулярна маса та наявність О-гліканів відрізняє цей глікопротеїн від P-глікопротеїну м.м. 170 кДа, який вважається відповідальним за появу резистентності злоякісних клітин до дії різних лікарських препаратів (MDR-резистентність) [Ling, 1997].

Вплив гіпертермії на клітини лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину

В онкологічній практиці, крім хіміотерапії, часто застосовують фізичні чинники, такі як лазерне та рентгенівське випромінювання, а також гіпертермію. Ми порівняли чутливість клітин лінії L1210 та сублінії L1210/R до дії теплового шоку. Було досліджено вплив різних режимів гіпертермії на життєздатність цих клітин. В цілому, клітини сублінії L1210/R, які є стійкішими до цитотоксичної дії цисплатину, є чутливішими до теплового шоку. Найчіткіша різниця між клітинами лінії L1210 з різною чутливістю до дії цисплатину спостерігається при їх прогріванні протягом 30 хв при 42 0С. Така обробка зупиняє ріст клітин сублінії L1210/R (рис. 8б), однак суттєво не впливає на проліферацію батьківських клітин (рис. 8а).

Рис. 8

Вплив теплового шоку (42 0С, 30 хв) на ріст клітин лінії L1210 (а) та сублінії L1210/R (б) :  n - контроль;  l - оброблені клітини.

Для того, щоб відповісти на питання про те, яким може бути механізм впливу гіпертермії на клітини лінії L1210, ми дослідили фрагментацію ДНК у цих клітинах після температурної обробки. Встановлено, що прогрівання протягом 30 хв при 42 0С викликає апоптичну фрагментацію ДНК як у клітинах лінії L1210, так і в клітинах сублінії L1210/R. Однак, необхідно зазначити, що кількість фрагментованої ДНК є значно більшою у випадку клітин сублінії L1210/R.

Ми також дослідили індукцію апоптозу в клітинах лінії L1210 при спільній дії гіпертермії та цисплатину. Концентрації цисплатину, якими обробляли клітини лінії L1210 та сублінії L1210/R були, відповідно, 0,05 і 5,0 мкг/мл. Встановлено, що обробка цисплатином або гіпертермією індукує приблизно однаковий рівень апоптозу в клітинах лінії L1210. При додаванні препарату через 18 год після припинення прогрівання апоптичний ефект обох чинників на клітини лінії L1210 є аддитивним. Інші результати отримані при обробці клітин сублінії L1210/R, резистентних до дії цисплатину. Гіпертермія (42 0С, 30 хв) індукує в них сильну фрагментацію ДНК, а наступне додавання цисплатину слабо впливає на цей ефект. Отже, гіпертермія викликає апоптичну загибель клітин лінії L1210 з різною чутливістю до цисплатину, причому клітини сублінії L1210/R є більш чутливими до дії теплового шоку, ніж батьківські клітини цієї лінії.

Отже, розвиток резистентності клітин лінії L1210 до протипухлинного препарату цисплатину супроводжується втратою їх чутливості до рістінгібуючої дії та індукції апоптозу під впливом ТФРβ. Причинами цього можуть бути порушення експресії компонентів сигнального шляху ТФРβ, а саме зниження експресії рецептора І типу ТФРβ та підвищення експресії білка Smad6, який інгібує передачу регуляторного сигналу даного цитокіна. Клітини сублінії L1210/R відрізняються від батьківських клітин лінії L1210 складом глікопротеїнів клітинних мембран, характеризуються підвищеним рівнем продукції ТФРβ1, більшою чутливістю до гіпертермії. Крім цього, клітини сублінії L1210/R, резистентні до цисплатину, зберігають чутливість до цитотоксичної дії деяких рослинних лектинів, зокрема аглютиніну 1 з омели. Отримані дані можуть бути використані для розробки нових підходів у лікуванні хворих, які мають пухлини з підвищеною стійкістю до дії цисплатину.

ВИСНОВКИ

1. Підвищена стійкість до дії протипухлинного препарату цисплатину клітин лінії L1210 лейкемії миші співпадає з їх резистентністю до інгібування росту та індукції апоптозу під впливом трансформуючого фактора росту типу β (ТФРβ).
2. Клітини лінії L1210 лейкемії миші з підвищеною стійкістю до дії цисплатину мають змінену експресію компонентів сигнального шляху ТФРβ порівняно з батьківськими клітинами цієї лінії. Так, рецептор І типу ТФРβ, який добре експресується в клітинах лінії L1210, майже не виявляється у мембранній фракції клітин сублінії L1210/R. У клітинах сублінії L1210/R спостерігається підвищена експресія білка Smad6, який є інгібітором передачі регуляторного сигналу ТФРβ.
3. Клітини сублінії L1210/R, резистентні до дії ТФРβ1, мають здатність до підвищеної продукції цього цитокіна. Цисплатин та аглютинін 1 з омели (VAA-1) викликають зростання продукції ТФРβ1 клітинами лінії L1210, і цей ефект сильніше виражений у клітин батьківської лінії. Отримані дані дозволяють припускати роль ТФРβ як посередника у дії цисплатину та VAA-1 на клітини лінії L1210 лейкемії миші.
4. Резистентність до дії цисплатину у клітин лінії L1210 супроводжується змінами у складі їх мембранних глікопротеїнів. Найбільш чітко вираженою відмінністю між батьківськими клітинами лінії L1210 і клітинами сублінії L1210/R є підвищена експресія в останніх мембранного глікопротеїна м.м. 240 кД.
5. Клітини лінії L1210 з підвищеною резистентністю до цисплатину зберігають чутливість до дії окремих цитотоксичних лектинів, зокрема -  VAA-1.
6. Дія VAA-1 на клітини лінії L1210 призводить до їх апоптичної загибелі, тоді як у псевдонормальних фібробластів з ембріона миші лінії NIH-3T3 VAA-1 інгібує ріст, але не викликає загибелі клітин.
7. Клітини лінії L1210, які володіють підвищеною стійкістю до дії цисплатину, є чутливішими до гіпертермії, ніж батьківські клітини цієї лінії. Гіпертермія викликає апоптичну загибель клітин лінії L1210.
8. Виявлені у роботі відмінності між лейкемічними клітинами лінії L1210, стійкими до дії цисплатину, та їх батьківськими попередниками щодо чутливості до інгібіторного цитокіна ТФРβ1, окремих рослинних лектинів та гіпертермії можуть бути експериментальним підгрунтям у розробці нових підходів для подолання набутої резистентності злоякісних клітин до цього протипухлинного препарату.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Stoika R.S., Yakymovych M.Ya., Yakymovych I.A., Chekhun V.F. Murine L1210 leukemia cells resistant to cis-diaminedichloroplatinum (II) action are also refractory to transforming growth factor β1-induced growth inhibition // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т. 20. - №3-4. - С. 256-258.
2. Stasyk T.V., Antonyuk V.A., Yakymovych M.Ya., Yakymovych I.A., Yanish Yu.V., Shishova Yu.V., Shliakhovenko V.A., Chekhun V.F., Stoika R.S., Lutsik-Kordovsky M.D. A comparative study of cell surface glycosyl determinants in sensitive and resistant to cisplatin L1210 murine leukemia cells // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т. 20. - №3-4. - С. 204-209.
3. Yakymovych M.Ya., Yakymovych I.A., Tryndiak V.P., Stoika R.S. Hyperthermia induces apoptosis in cisplatin-resistant murine L1210 leukemia cells // Экспериментальная онкология. - 1999. - Т. 21. - №2. - С. 154-156.
4. Stoika R.S., Yakymovych M.Y., Yakymovych I.A., Chekhun V.F. Resistance to cis-diaminedichloroplatinum (II) in murine L1210 leukemia cells is accompanied by their resistance to transforming growth factor β1-induced growth inhibition and apoptosis // Anti-Cancer Drugs. - 1999. - V. 10. - №5. - Р. 457-463.
5. Yakymovych M., Yakymovych I., Antonyuk V., Lutsik-Kordovsky M., Stoika R. Lectins’ cytotoxicity for L1210 murine leukemia cells with different sensitivity to anticancer drug cisplatin // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 1999. - №2. - С. 39-45.
6. Stoika R.S., Yakymovych M.Y., Yakymovych I.A. Cross-resistance to cisplatin and transforming growth factor beta 1 in murine L1210 leukemia cells // 6th European Society for Analytical Cellular Pathology Congress. - Heidelberg (Germany). - Analytical Cellular Pathology. - 1999. - V. 18. - №1. - P. 49.
7. Lutsik-Kordovsky M.D., Antonyuk V.A., Stasyk T.V., Yakymovych M.Ya., Yakymovych I.A., Hellman U., Soushelnitsky S., Stoika R.S., Lutsyk A.D. Hemagglutinating lectin from fruit bodies of Amanita phalloides: isolation, properties and biological activity // Abstracts of papers presented at INTERLEC 18. - University of Portsmouth. - 1999. - P. 77.

Якимович М.Я. Вплив трансформуючого фактора росту типу β на клітини лінії L1210 лейкемії миші з різною чутливістю до дії цисплатину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено вивченню механізмів набутої резистентності злоякісних клітин лінії L1210 лейкемії миші до дії протипухлинного препарату цисплатину. Встановлено, що клітини цієї лінії, які проявляють підвищену стійкість до дії цисплатину, є резистентними до впливу трансформуючого фактора росту типу β (ТФРβ). ТФРβ пригнічує ріст і індукує апоптоз у клітинах лінії L1210, але не в клітинах сублінії, резистентних до дії цисплатину. Причинами стійкості до впливу ТФРβ можуть бути знижена експресія в клітинах даної сублінії рецептора І типу ТФРβ та підвищена експресія білка Smad6 - внутрішньоклітинного інгібітора передачі сигналу цього цитокіна. Поява резистентності клітин лінії L1210 до дії цисплатину супроводжується змінами у складі глікопротеїнів клітинних мембран, підвищенням чутливості клітин до гіпертермії, а також підвищеною продукцією ТФРβ1. Клітини лінії L1210 з підвищеною резистентністю до цисплатину зберігають чутливість до дії деяких рослинних лектинів, зокрема - аглютиніну 1 з омели.

Ключові слова: ТФРβ, цисплатин, лейкемія, резистентність, апоптоз, інгібування росту, лектини, гіпертермія.