|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ
КЛОЧЕНКО
Петро Дмитрович
УДК [582.23/26-113:574.63] (28)
МЕТАБОЛІЗМ АЗОТУ У ПРІСНОВОДНИХ ВОДОРОСТЕЙ ТА
ЙОГО РОЛЬ У ФОРМУВАННІ ЇХ УГРУПОВАНЬ І ЯКОСТІ ВОДИ
03.00.17 - гідробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Київ - 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті гідробіології НАН України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор КУЗЬМЕНКО
Михайло Ілліч, Інститут гідробіології НАН України,
завідувач відділу радіоекології
член-кореспондент АН Молдови, заслужений діяч
науки Молдови, доктор біологічних наук, професор
ШАЛАРЬ Василь Максимович, Молдовський
державний університет, завідувач кафедри ботаніки
доктор біологічних наук, професор МАСЮК Надія
Прохорівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного
НАН України, провідний науковий співробітник
Провідна установа: Одеський філіал Інституту біології південних морів
ім. О.О. Ковалевського НАН України
Захист відбудеться " _19__" __грудня___ 2002 р. о _11_ годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01 Інституту гідробіології
НАН України за адресою: 04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гідробіології
НАН України (04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12)
Автореферат розісланий " _15_" __листопада__ 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук Гончаренко Н.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. У зв'язку з ростом антропогенного навантаження на водойми особливо загострилася проблема якості води, що зумовлює необхідність з'ясування механізмів функціонування водних екосистем з метою управління їх станом. Значний інтерес при цьому становить кругообіг азоту. Від кількісного та якісного складу азотвмісних речовин залежать ступінь трофності і загальна продуктивність водойм, а також якість води в них. Сполуки азоту характеризуються високою біологічною активністю, беруть участь у метаболічних процесах гідробіонтів та істотно погіршують органолептичні властивості води.
В екологічному метаболізмі азоту важливу роль відіграють водорості, клітини яких здатні засвоювати як неорганічні (аміак, нітрити, нітрати), так і органічні сполуки азоту, а також молекулярний азот (Сиренко, 1972; Кузьменко, 1981). Разом з тим водорості прижиттєво, а також після відмирання виділяють у воду різноманітні азотвмісні речовини, які суттєво впливають на формування біоценозів та якість води (Хайлов, 1971; Сакевич, 1985; Сиренко, Козицкая, 1988).
Однак попри чисельні літературні дані щодо різнобічного впливу азотвмісних сполук на розвиток водоростей та їх участі в кругообігу азоту у природних водах все ще не розкритими залишаються фізіолого-біохімічні механізми формування угруповань фітопланктону, а також не до кінця розшифровані процеси, які супроводжуються накопиченням біологічно активних азотвмісних речовин у клітинах водоростей та у воді. Відсутність належних знань про хімічну природу метаболітів водоростей та шляхи їх трансформації у водному середовищі не дозволяє зробити остаточні висновки про складні хімічні взаємовідносини в угрупованнях гідробіонтів, а отже розкрити сутність функціонування прісноводних екосистем.
З'ясування особливостей метаболізму азоту у водоростей пов'язане також з необхідністю обгрунтування шляхів підвищення продуктивності водойм та зменшення негативного впливу біологічно активних речовин водоростевого походження на гідробіоценози та якість питної води.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота тісно пов'язана з виконанням планових наукових досліджень Інституту гідробіології НАН України, державних проектів та міжнародних грантів, зокрема держбюджетних тем "Оцінити роль водяних рослин у процесах трансформації азотвмісних сполук у водоймах різного типу" (номер держреєстрації 0194U019358); "Дослідити зв'язок функціональних та морфологічних характеристик фотосинтезуючих гідробіонтів з факторами формування якості води" (№ 0197U003309); "Дослідити фізіолого-біохімічні механізми впливу гідрофітів на зміну ряду показників якості води" (№ 0198U003582); "Дослідити вплив біологічно активних сполук водяних рослин на формування якості води та перспективи їх практичного використання" (№ 0100U003771); проекти Комітету України по науці та технологіях "Визначення механізмів і кількісна оцінка процесів самоочищення, детоксикації, дезактивації забруднень у водних екосистемах різного типу з метою розробки заходів по відновленню стану природних водойм України" (шифр 6/97); "Створити уніфіковану базу даних для Дніпра, його водосховищ та головних притоків у межах України і на цій основі розробити комплексну оцінку та прогноз їх стану" (№ 01.06/08076) і міжнародні гранти "To study adaptive and morphological changes in aquatic plants under the influence of radioactive and chemical contamination with the purpose of bioindication and prediction of ecological consequences" (ISF, № UAV 000); "Toxic species of blue-green algae in the water bodies of Ukraine: biology, morphology, potential activity, influence on the water quality, perspectives of using" (CRDF, № UB1-331) та "Cyanobacterial agents for agricultural fungal pest control" (INTAS, № 95-238).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було встановлення закономірностей асиміляції, трансформації та виділення сполук азоту прісноводними водоростями і з'ясування ролі цих процесів у формуванні альгоугруповань та якості води. Для цього необхідно було виконати такі завдання:
- вивчити специфіку асимиляції і трансформації неорганічних сполук азоту та сечовини залежно від біологічних особливостей водоростей, що вегетують як в умовах культур, так і в різних біотопах водних екосистем;
- встановити закономірності взаємозв'язку між ступенем розвитку фітопланктону, особливостями його якісного складу та динамікою вмісту неорганічних сполук азоту як у водосховищах Дніпра, так і в його притоках;
- виявити особливості механізмів, що регулюють зміни угруповань планктонних водоростей під впливом азотвмісних сполук;
- оцінити вплив рослинного планктону на динаміку вмісту білковоподібних речовин, вільних амінокислот і летких амінів у прісноводних екосистемах;
- дослідити кількісний та якісний склад органічних азотвмісних екзо- та ендогенних продуктів життєдіяльності прісноводних водоростей і розкладу їх біомаси;
- вивчити особливості трансформації азотвмісних органічних речовин водоростевого походження, ідентифікувати сполуки, що утворюються при цьому, та оцінити їх значення для екологічного і санітарно-гігієнічного стану водного середовища.
Об'єкт дослідження: механізми функціонування прісноводних екосистем.
Предмет дослідження: метаболізм азоту у водоростей та його значення в прісноводних екосистемах.
Методи дослідження: загальноприйняті методи відбору і опрацювання проб водоростей та їх культивування; фотоколориметрія та спектрофотометрія при визначенні вмісту неорганічних і органічних сполук азоту, пігментів та активності ферментів; мас-спектроскопічний аналіз для встановлення вмісту 15N і хімічної структури метаболітів водоростей; газова, рідинна та іонообмінна хроматографія при визначенні складу азотвмісних сполук водоростевого походження; ELISA для оцінки вмісту альготоксинів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у синьозелених і зелених водоростей виявлено суттєві відмінності в активності ферментних систем, які здійснюють зв'язування аміаку, що має істотне значення для процесів формування угруповань рослинного планктону. Показано, що внесення в природну воду вуглеамонійних солей та сечовини супроводжується змінами видового складу альгоугруповань та інтенсивності їх розвитку: знижується вегетація представників Cyanophyta і посилюється розвиток зелених водоростей, в першу чергу із порядків Volvocales і Chlorococcales, які активно споживаються зоопланктоном.
Вперше на прикладі водосховищ Дніпра і водотоків його басейну встановлено позитивний зв'язок між біомасою планктонних водоростей та концентрацією в природній воді нітритів. Співвідношення процесів поглинання і виділення нітритного азоту значною мірою залежить від складу домінуючого комплексу рослинного планктону.
Вперше на прикладі видів роду Scenedesmus встановлена залежність вмісту нітритного азоту в культуральному середовищі від таксономічного положення водоростей. Показано, шо максимальний питомий вміст нітритів у альгологічно чистих та аксенічних культурах синьозелених і зелених водоростей спостерігається в період їх активної життєдіяльності.
З'ясовані особливості взаємозв'язку між добовими коливаннями вмісту неорганічних сполук азоту в середовищі та кількістю клітин водоростей в процесі їх росту на різних джерелах цього біогенного елементу.
Доведено, що прісноводні водорості беруть активну участь у трансформації сечовини внаслідок ферментативної діяльності, інтенсивність якої найвища в період активного росту культур і зумовлена у хлорококових водоростей біологічними особливостями видів.
Вперше продемонстрована участь природних угруповань фітоепіфітону в асиміляції і трансформації неорганічних та органічних сполук азоту.
Вперше встановлено позитивний зв'язок між інтенсивністю вегетації фітопланктону в притоках Дніпра та вмістом у воді білковоподібних речовин і вільних амінокислот; вивчено склад і визначено концентрацію окремих вільних амінокислот у Київському та Канівському водосховищах, а також виявлено особливості амінокислотного складу білків низки видів прісноводних водоростей.
Вперше серед летких амінів, що накопичуються у середовищі в процесі інтенсивного росту та при розкладі біомаси зелених і синьозелених водоростей, ідентифіковано 13 сполук, 9 з яких є вторинними амінами. Доведено, що леткі аміни можуть активно асимілюватись клітинами планктонних мікроводоростей.
Синьозелені водорості, які вегетують у різнотипних водоймах України, синтезують і виділяють у воду мікроцистини – азотвмісні сполуки, токсичні для гідробіонтів і теплокровних тварин. Доведено, що низькомолекулярні азотвмісні метаболіти синьозелених водоростей здатні пригнічувати ріст мікроскопічних грибів з роду Fusarium.
Вперше серед канцерогенних сполук, які утворюються в результаті нітрозування амінів водоростевого походження, ідентифіковані N-нітрозодибутиламін і N-нітрозоморфолін. Встановлено, що вміст канцерогенних N-нітрозамінів у воді, які утворюються в процесі трансформації азотвмісних метаболітів водоростей, знаходиться в прямій залежності від концентрації попередників (аміни, нітрити) та знижується з підвищенням рН середовища. N-нітрозосполуки виявлені у воді дніпровських водосховищ і здатні впливати на вегетацію планктонних водоростей.
Практичне значення одержаних результатів. Досліджені ланки кругообігу азоту, пов'язані з метаболізмом прісноводних водоростей, мають важливе значення для розшифровки складних і тонких механізмів формування якості води, а також для розробки комплексу заходів щодо поліпшення технології водопідготовки на водозаборах.
Встановлені залежності між інтенсивністю вегетації фітопланктону та динамікою вмісту неорганічних і органічних сполук азоту у водосховищах Дніпра та його притоках можуть бути використані для розробки моделей прісноводних водойм з метою регулювання їх станом.
Відкриті особливості ферментативного зв'язування аміаку у представників різних таксонів водоростей можуть бути використані для аналізу конкретних екологічних ситуацій, пов'язаних з інтенсивним розвитком окремих видів рослинного планктону.
Запропонований підхід до оцінки рівнів біологічної активності азотвмісних метаболітів водоростей, що базується на особливостях їх хімічної структури, дозволить здійснювати ідентифікацію потенційно активних сполук, попередньо оцінювати рівень їх токсичності й прогнозувати ступінь небезпеки для гідробіонтів та користувачів питної води.
Виявлені серед метаболітів водоростей біологічно активні сполуки з фунгіцидними властивостями можуть бути використані при створенні високоефективних препаратів для потреб сільського господарства України.
Практичні аспекти роботи стосовно змін у схемі підготовки питної води для міст Запоріжжя, Дніпропетровська, Вінниці та інших відображені у низці рекомендацій, які передані "Укркомунндіпроекту" (м. Харків).
Матеріали дисертації використані при виконанні Республіканської програми "Здоров'я людини та екологія" (розділ "Питна вода"), а також програми Кабінету Міністрів України "Використання вуглеамонійних солей в сільському господарстві" (Постанова № 732 від 20.10.1994 р.).
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно обгрунтував тему, мету та основні завдання вивчення метаболізму азоту у прісноводних водоростей; оволодів сучасними методами досліджень (газова та рідинна хроматографія, ізотопний аналіз тощо); особисто виконав основний комплекс експериментальних робіт; дослідив фітопланктон водосховищ Дніпра, його притоків та ряду малих водойм і визначив у їх воді вміст неорганічних і органічних сполук азоту; самостійно проаналізував і узагальнив одержані в лабораторних та польових умовах результати досліджень і сформулював висновки щодо ролі азотного обміну прісноводних водоростей у формуванні їх угруповань і якості води та підвищенні продуктивності водойм.
При проведенні досліджень, пов'язаних із встановленням особливостей розвитку організмів зоопланктону, підрахунок їх чисельності та біомаси здійснив к.б.н. Г.В. Парчук; тестування біологічної активності на мікроміцетах виконали к.б.н. І.О. Еланська та к.б.н. О.В. Соколова.
У процесі підготовки і виконання роботи консультативну допомогу з окремих розділів і методів досліджень авторові надали колеги з Інституту гідробіології НАН України: к.б.н. В.О. Медвідь (визначення вмісту хлорофілу "а"), к.б.н. Т.Ф. Шевченко (оцінка якісного складу фітоперифітону і фітобентосу), к.х.н. Т.О. Васильчук (визначення речовин білкової природи та вільних амінокислот), к.х.н В.Г. Кленус (оцінка рівнів вмісту радіонуклідів); наукові співробітники з інших установ Національної академії наук України та Міністерства освіти і науки України – д.б.н. В.В. Грубінко (методичні особливості при визначенні активності ферментів), д.б.н. П.М. Царенко (питання систематики хлорококових водоростей), к.б.н. О.В. Борисова (методи одержання аксенічних культур зелених водоростей), к.б.н. В.М. Михайленко та к.б.н. О.А. Главін (визначення N-нітрозамінів); дослідники із США – проф. W.W. Carmichael, Wright State University (визначення альготоксинів) і Швейцарії – проф. F. Jьttner, Institut fьr Pflanzenbiologie, Limnologische Station (м?с-спектроскопічний аналіз).
Велику допомогу при виконанні роботи авторові надали д.б.н., проф. Л.Я. Сіренко (цінні поради при узагальненні одержаних матеріалів) та д.б.н. О.Й. Сакевич (важливі рекомендації при проведенні експериментальних досліджень).
Участь співавторів у виконанні окремих досліджень відображено у відповідних спільних публікаціях.
Апробація результатів роботи. Результати дисертації були представлені на Республіканській науковій конференції "Теоретические и прикладные аспекты изучения флоры Молдавии" (Кишинів, 1989); 8-му Всесоюзному симпозіумі "Канцерогенные N-нитрозосоединения и их предшественники – образование и определение в окружающей среде" (Таллінн, 1990); 1-й Всесоюзній нараді по хемотаксономії (Київ, 1990); Республіканській нараді "Методы и приборы для экологических исследований" (Іркутськ, 1990); 2-му Всесоюзному симпозіумі з екологічної онкології (Київ, 1990); 1, 2 і 3-му з'їздах Гідроекологічного товариства України (Київ, 1993, 1997; Тернопіль, 2001); науково-практичній конференції (Гримайлів, 1995); симпозіумі з екологічної хімії (Кишинів, 1995); конференції молодих вчених та спеціалістів "Актуальные вопросы ботаники и экологии" (Харків, 1996); 6-му Міжнародному фікологічному конгресі (The Netherlands, Leiden, 1997); 4-й і 5-й Міжнародних науково-практичних конференціях "Вода: проблемы и решения" (Дніпропетровськ, 1998, 1999); 2-му Міжнародному симпозіумі з біотехнології рослин (Київ, 1998); 2-й Міжнародній конференції "Актуальные проблемы современной альгологии" (Киев, 1999); 16-му Міжнародному ботанічному конгресі (USA, St. Louis, 1999); 8-й Міжнародній конференції з прикладної альгології (Italy, Montecatini Terme, 1999); 11-му Угорському альгологічному симпозіумі (Hungary, Salgуbбnya, 2000); 5-й Всеросійській конференції з водяних рослин (Борок, 2000); 7-му Міжнародному фікологічному конгресі (Greece, Thessaloniki, 2001); 1-му Конгресі Міжнародного товариства з прикладної альгології (Spain, Almeria, 2002); Міжнародному зібранні з культивування водоростей (Germany, Gцttingen, 2002).
Публікації. Результати дисертації викладено у 55 роботах, із них 34 – у фахових виданнях, а 21 – в інших наукових журналах та матеріалах конференцій, з'їздів і симпозіумів.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків та списку літератури, який нараховує 414 назв. Робота ілюстрована 26 таблицями та 72 рисунками. Загальний обсяг рукопису становить 353 сторінки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОСОБЛИВОСТІ АЗОТНОГО ОБМІНУ У ВОДОРОСТЕЙ
(Огляд літератури)
Наведено критичний аналіз наявної у фаховій вітчизняній та зарубіжній літературі інформації про шляхи азотного обміну у прісноводних водоростей, зв'язок їх життєдіяльності з динамікою концентрації неорганічних та органічних сполук азоту у водному середовищі, хімічну природу азотвмісних метаболітів водоростей, особливості їх синтезу та вплив на якість води. Акцентується увага на нез'ясованих питаннях щодо механізмів формування угруповань рослинного планктону під впливом азотвмісних сполук.
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Основні експериментальні роботи з культурами водоростей проводили в Інституті гідробіології НАН України. Комплекс натурних досліджень виконано на водосховищах Дніпра та його притоках (річки Прип'ять, Здвиж, Ірпінь, Либідь, Рось, Вільшанка, Тясьмин, Цибульник і Сула), а також на озерах та ставках, розташованих в околицях Києва та в Київській області.
У процесі відбору проб фітопланктону, фітоепіфітону, фітоперифітону і фітобентосу, їх камерального опрацювання, визначення видового складу та біомаси водоростей використовували загальноприйняті гідробіологічні методи (Топачевський, Масюк, 1984).
Об'єктами лабораторних досліджень були альгологічно чисті та аксенічні культури синьозелених (Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Brйb. HPDP-26, Anabaena hassalii (Kьtz.) Wittr. HPDP-7, Anabaena sp. P-9 (Wolk, USA), Calothrix braunii Born. et Flah. HPDP-16, Calothrix elenkinii Kossinsk. HPDP-2, Gloeotrichia natans (Hedw.) Rabenh. HPDP-107, Hapalosiphon fontinalis (Ag.) Born. HPDP-3, Lyngbya limnetica Lemm. HPDP-9, Microcystis aeruginosa Kьtz. emend. Elenk. HPDP-6, Microcystis wesenbergii Komarek HPDP-31, Nostoc linckia (Roth.) Born. et Flah. HPDP-453, Nostoc muscorum Ag. HPDP-526, Nostoc punctiforme (Kьtz.) Hariot HPDP-48, Oscillatoria limosa Ag. HPDP-12, Oscillatoria neglecta Lemm. HPDP-25, Plectonema boryanum Gom. HPDP-24, Phormidium bijugatum Kongiss. HPDP-35, Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. HPDP-27, Tolypothrix tenuis Kьtz. HPDP-5) та зелених (Ankistrodesmus fusiformis Corda HPDP-437, Chlorella fusca Shihira et Krauss IBASU-A 348, Chlorella saccharophila (Krьger) Mig. IBASU-A 187, Chlorella vulgaris Beijer. ССАР-211/11в, Coelastrum astroideum De Not. IBASU-A 211, Scenedesmus acuminatus (Lagerh.) Chod. CALU-200, Scenedesmus acutus Meyen IBASU-A 251, Scenedesmus armatus (Chod.) Chod. IBASU-A 270, Scenedesmus brasiliensis Bohl. IBASU-A 273, Scenedesmus communis Hegew. IBASU-A 277, Scenedesmus falcatus Chod. IBASU-A 281, Scenedesmus javanensis Chod. IBASU-A 283, Scenedesmus maximus (W. et G.S. West) Chod. IBASU-A 287, Scenedesmus obtusus Meyen IBASU-A 310, Scenedesmus opoliensis P. Richt. IBASU-A 298, Scenedesmus subspicatus Chod. IBASU-A 302, Selenastrum gracile Reinsch. IBASU-A 317, Pediastrum boryanum (Turp.) Menegh. IBASU-A 240 і Tetraedron caudaum (Corda) Hansg. IBASU-A 319) водоростей із колекцій Інституту гідробіології НАН України (HPDP), Інституту ботаніки ім. М.Г Холодного НАН України (IBASU-A), Біологічного інституту Санкт-Петербурзького університету (CALU), а також із колекцій культур Великобританії (CCAP) та Лімнологічної станції в м. Цюрих (Швейцарія).
Водорості культивували на середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горема № 11 (Методы …, 1975) при температурі 22–250 С та освітленні лампами денного світла (4000 лк) протягом 16 год/добу; рН середовища вимірювали за допомогою іономіра ЭВ-74.
У деяких дослідах використовували природні популяції Microcystis aeruginosa Kьtz. emend. Elenk., Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs і Oscillatoria sp. із Канівського водосховища.
У процесі дослідження фунгіцидної активності синьозелених водоростей використовували 13 видів мікроміцетів із родів Fusarium, Bipolaris, Rhizoctonia та Alternaria з колекції Інституту мікробіології і вірусології НАН України.
Підрахунок клітин водоростей в умовах культур здійснювали за допомогою камери Горяєва, інтенсивність їх росту визначали за сухою біомасою, а фізіологічний стан контролювали за допомого люмінесцентного мікроскопа МЛД-1 (Методы …, 1975).
Концентрацію хлорофілу "а" встановлювали за методикою ЮНЕСКО (Сиренко, Курейшевич, 1982) з використанням відомих рівнянь (Jeffrey, Humphrey, 1975).
Активність ферментів, що зв'язують аміак, визначали відповідно до методів, наведених у працях (Евстегнеева и др., 1980; Софьин и др., 1984).
Під час визначення особливостей розвитку фітопланктону в умовах мікрокосм використовували скляні посудини спеціальної конструкції об'ємом 50–70 л (Клоченко и др., 1994).
Радіоактивність зразків біомаси водоростей при вивченні асимиляції амінів визначали на сцинтиляційній установці SL-30 (Франція); ізотопний аналіз з використанням 15N здійснювали відповідно до методичних вказівок (Методические указания …, 1978) із підрахунком вмісту міченого азоту на мас-спектрометрі МИ-1208 В.
Кількість кисню у середовищі визначали йодометричним методом (за Вінклером) (Методы …, 1975); вміст неорганічних сполук азоту у воді, його органічної форми та загального азоту в культурах водоростей встановлювали загальноприйнятими методами (Лурье, 1973; Руководство …, 1977; Методы …, 1987).
Для визначення концентрації речовин білкової природи у природній воді використовували реактив Фоліна (Дебейко и др., 1973); загальний вміст вільних амінокислот та летких амінів оцінювали відповідно до методик (Семенов и др., 1961; Немцева и др., 1964).
Аналіз кількісного та якісного складу амінокислот проводили за допомогою методу іонообмінної хроматографії з використанням аналізатора ААА Т339 М (Чехія).
Із культурального середовища водоростей та води при розкладі їх біомаси леткі аміни вилучали методами вакуумної дистиляції та відгонки з парою (Головня, 1971; Головня и др., 1971; Методы …, 1975), а їх ідентифікацію здійснювали на газовому хроматографі "Pye-Unicum" 304 (Великобританія) з урахуванням методичних вказівок (Golovnya, Zhuravleva, 1973; Головня и др., 1986).
Метанольні екстракти біомаси водоростей розділяли на окремі фракції за допомогою рідинного хроматографа фірми "KNAUER" (Німеччина) з використанням УФ-детектора. Мас-спектроскопічний аналіз активних фракцій здійснювали на мас-спектрометрі фірми "BRUKER" (Німеччина).
Кількісний та якісний склад N-нітрозамінів визначали за методикою (Канн, 1981) з використанням газового хроматографа "Газохром 09" з детектором ТЕА-502 (США), а метаболіти водоростей нітрозували відповідно до методики (Scheunig, Ziebarth, 1976).
Наявність токсичних сполук у воді та біомасі водоростей встановлювали за допомогою імунного тесту (ELISA) "Microcystin Tube Kit" (США).
Вміст Sr-90 в біомасі водоростей визначали радіохімічним методом, а Cs-137 – на ?-спектрометрі (Марей, Зыкова, 1980).
Проби зоопланктону відбирали за допомогою планктонної сітки (80–90 мкм), а під час їх камерального опрацювання ідентифікували до виду коловерток, гіллястовусих та веслоногих ракоподібних (Иванова, 1985; Ricci, 1983).
Математичне опрацювання одержаних результатів здійснювали з використанням кореляційного та регресійного аналізів, а також інших статистичних методів (Зайцев, 1984; Лакин, 1990).
УЧАСТЬ ПРІСНОВОДНИХ ВОДОРОСТЕЙ У ДИНАМІЦІ ВМІСТУ
І ТРАНСФОРМАЦІЇ НЕОРГАНІЧНИХ СПОЛУК АЗОТУ
Наші дослідження асиміляції сполук азоту прісноводними водоростями показали, що форма цього елементу у водному середовищі справляє значний вплив на накопичення їх біомаси. Найвища продуктивність культур зелених водоростей Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis спостерігається при їх вирощуванні на вуглеамонійних солях (ВАС) (відповідно 848,0 і 779,0 мг/л на 80-ту добу), тоді як максимальні величини сухої маси синьозелених водоростей Anabaena flos-aquae (555,0 мг/л) і Microcystis aeruginosa (535,0 мг/л) були зареєстровані при використанні як джерела азоту нітрату натрію. У присутності ВАС культура Anabaena flos-aquae відмирала на 12-ту добу досліду, а розвиток Microcystis aeruginosa пригнічувався впродовж усього періоду культивування, внаслідок чого біомаса цієї водорості не перевищувала 55,6 мг/л.
Дослідження динаміки вмісту неорганічних сполук азоту у культуральному середовищі показало, що процес росту зелених водоростей за наявності ВАС супроводжується активною асиміляцією іонів NH4+. Зокрема, концентрація амонійного азоту в культуральному середовищі на 80-ту добу вирощування Scenedesmus acuminatus була в понад 60 разів меншою, ніж його початкова кількість, і становила всього 1,23 мг/л.
При використанні NaNO3 як джерела азоту в культурах досліджуваних водоростей реєструвалося зменшення кількості позаклітинних іонів NO3-. Однак вже на 25-ту добу досліду відзначалась істотна різниця в інтенсивності асиміляції цієї форми азоту: при вирощуванні Microcystis aeruginosa і Anabaena flos-aquae кількість іонів NO3- у середовищі не перевищувала 40,0–45,0 мг N/л, тоді як у культурах Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis вона знаходилась у межах 55,0–61,25 мг N/л. Така ж тенденція щодо концентрації іонів NO3- спостерігалась і при вирощуванні водоростей на середовищі з нітратом амонію.
Дослідження вмісту загального азоту в культурах зелених і синьозелених водоростей також засвідчили, що найсприятливішим його джерелом для росту представників Chlorophyta є ВАС. Так, наприкінці досліду (80-й день) у біомасі Scenedesmus acuminatus містилося 64,2% азоту від його початкової кількості в культурі, а для Ankistrodesmus fusiformis ця величина становила 40,4%. При використанні ж NaNO3 ці показники були такими: 27,1% – для Anabaena flos-aquae, 23,0% – для Scenedesmus acuminatus і 19,2% – для Ankistrodesmus fusiformis.
Подібні результати були отримані і при вивченні надходження 15N в клітини досліджуваних водоростей. Зокрема, вміст 15N у біомасі Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis при вирощуванні на ВАС становив 44,0 і 26,0%, тоді як у присутності NaNO3 – відповідно 16,8 і 11,0% від початкової кількості в культурі. Anabaena flos-aquae за наявності ВАС відмирала на 10–12-ту добу експерименту.
У дослідах щодо впливу різної концентрації ВАС на розвиток синьозелених водоростей встановлено, що найбільш істотне зменшення кількості клітин у культурі Microcystis aeruginosa спостерігається уже в межах 5–10 мг N/л. Подібні результати були одержані і при підрахунку чисельності живих і відмираючих клітин цієї водорості, коли збільшення концентрації амонійного азоту супроводжувалось досить помітним зростанням кількості її мертвих клітин. На відміну від ВАС, чисельність клітин Microcystis aeruginosa у процесі росту на нітратах істотних змін не зазнавала.
Характерною рисою культивування водоростей на нітратах є трансформація останніх в нітрити і подальше накопичення іонів NO2- у воді. Наші дослідження показали, що максимальна концентрація нітритного азоту в культуральному середовищі хлорококових водоростей коливалась в досить широких межах – 0,225–14,460 мг N/л. На підставі порівняння одержаних даних з результатами молекулярно-генетичних досліджень німецьких вчених (Kessler, 1984, 1992), що свідчать про наявність у роді Scenedesmus двох чітко відмінних підродів Desmodesmus і Scenedesmus, виявлені суттєві відмінності щодо продукування нітритного азоту представниками цих двох підродів. Зокрема, у видів підроду Desmodesmus (Scenedesmus armatus, S. brasiliensis, S. opoliensis, S. communis і S. maximus) найбільші показники накопичення нітритного азоту знаходилися в межах 0,225–0,786 мг N/л, тоді як у видів підроду Scenedesmus (S. acutus, S. falcatus, S. javanensis, S. obtusus і S. subspicatus) вони становили 1,995–4,594 мг N/л (рис. 1). Ця відмінність, очевидно, свідчить про наявність досконалішої ферментної системи асиміляційної нітратредукції у видів підроду Desmodesmus, який, як гадають, в еволюційному плані молодший, ніж підрід Scenedesmus.
Рис. 1. Динаміка вмісту нітритного азоту в культуральному середовищі
хлорококових водоростей в процесі їх росту. А : 1 – Scenedesmus
obtusus, 2 – S. javanensis, 3 – S. falcatus, 4 – S. acutus, 5 – S.
subspicatus; Б: 6 – S. brasiliensis, 7 – S. maximus, 8 – S. communis,
9 – S. armatus, 10 – S. opoliensis.
Незважаючи на досить широкий діапазон абсолютної концентрації нітритного азоту в позаклітинному середовищі, максимальні значення його питомого вмісту в культурах зелених та синьозелених водоростей спостерігаються в логарифмічній фазі їх росту, тобто в період інтенсивного перебігу фізіологічних процесів. Найбільшим зазначений показник був у Chlorella vulgaris (65,6 мкг N/мг сухої маси) і Scenedesmus obtusus (44,8 мкг N/мг), а найменшим – у Nostoc muscorum, Chlorella saccharophilla і Scenedesmus armatus (відповідно 0,8, 1,7 і 2,0 мкг N/мг).
Дослідженнями показано, що не існує істотної різниці в питомому вмісті нітритного азоту в альгологічно і бактеріально чистих культурах Scenedesmus acutus. Однак, як свідчать одержані нами дані, більш високий абсолютний вміст цієї форми азоту в середовищі альгологічно чистої культури може бути наслідком інтенсифікації зростання біомаси водорості під впливом бактерій- супутників (Борисова и др., 1997).
При дослідженні динаміки вмісту неорганічних сполук азоту в середовищі під час репродукції водоростей встановлено, що процеси асиміляції і трансформації цих сполук мають добову ритміку. Так, протягом доби спостерігається обернена залежність між концентрацією іонів NH4+ і NO3- та кількістю клітин Microcystis aeruginosa і Chlorella vulgaris, тоді як для нітритів цей взаємозв'язок може бути різний: прямий – для представників Chlorophyta і обернений – для Cyanophyta. Зафіксовано також зміщення у часі максимумів чисельності клітин водоростей при використанні різних джерел азоту.
В експериментах з експозицією дослідних склянок in situ показано, що асиміляція амонійного та нітратного азоту, а також трансформація останнього до нітритів за участю планктонних водоростей мають місце і у водоймах різного типу (річки, ставки, водосховища), а інтенсивність цих процесів залежить від кількісного та якісного складу фітопланктону. У зазначених процесах також беруть участь водорості, що вегетують на вищих водяних рослинах. Так, у варіанті з нітратним азотом найактивніше засвоювали іони NO3- епіфітні водорості рогозу вузьколистого (Typha angustifolia L.), тоді як амонійний азот вуглеамонійних солей більш активно поглинали водорості, субстратом для розвитку яких є очерет звичайний (Phragmites australis (Cav.) Trin. et Steud.). Фітоепіфітон здійснює також редукцію нітратів до нітритів, причому інтенсивніше вона відбувається під час життєдіяльності водоростей, що вегетують на Tуpha angustifolia. Процеси асиміляції, трансформації та виділення азоту за участю епіфітних водоростей значно активніші за наявності світла.
Узагальнення власних даних щодо вмісту неорганічних сполук азоту у деяких водосховищах Дніпра і водотоках його басейну та біомаси фітопланктону показало, що, поряд з асиміляцією клітинами прісноводних водоростей іонів NH4+, NO3- і NO2-, відбувається накопичення у природній воді нітритного азоту, пов'язане із збільшенням біомаси цих організмів. Аналіз кількісного та якісного складу рослинного планктону свідчить, що співвідношення процесів поглинання та виділення нітритного азоту значною мірою зумовлене складом домінуючого комплексу фітопланктону: за умов переважання у воді зелених і діатомових водоростей спостерігається інтенсифікація процесу виділення нітритів у середовище, тоді як з появою (в основному, влітку) в значній кількості синьозелених водоростей домінуючим стає процес поглинання іонів NO2-. Перебіг цих процесів найактивніший при помірній біомасі планктонних водоростей.
Проведений регресійний аналіз показав, що залежність між кількістю у воді неорганічних сполук азоту та біомасою фітоплантону як для водосховищ Дніпра, так і для водотоків його басейну описується степеневою функцією y = a0 · xв , де y – вміст іонів NH4+, NO3-, NO2-, мг N/л; х – біомаса, мг/л; а0 і ? – коефіцієнти.
Поряд з чисельністю та біомасою водоростей, важливим показником інтенсивності розвитку фітопланктону є кількість основного фотосинтезуючого пігменту – хлорофілу "а" з розрахунку на одиницю об'єму води. Наші дослідження показали, що його концентрація в притоках Дніпра коливалась у межах 1,12–67,93 мкг/л. Порівнюючи вміст хлорофілу "а" у воді таких річок, як Здвиж, Ірпінь, Либідь, Рось, Вільшанка, Тясьмин, Сула та Цибульник, із кількістю неорганічних сполук азоту, ми виявили, що в цих водотоках має місце обернена залежність між кількістю пігменту та вмістом іонів NH4+ і NO3-. Широкий діапазон значень коефіцієнта кореляції (r = –0,29…–0,72 – для NH4+ та r = –0,12…–0,66 – для NO3-), очевидно, пов'язаний з різним рівнем азотного навантаження на водотоки, а також з різною інтенсивністю вегетації фітопланктону. На відміну від амонійного і нітратного азоту, залежність між кількістю у воді нітритів та хлорофілу "а" може бути як оберненою, так і прямою.
Таким чином, зелені (хлорококові) водорості в умовах лабораторного культивування з використанням різних джерел азоту характеризуються переважним засвоєнням його амонійної форми, тоді як синьозелені активніше поглинають азот у вигляді нітратів. Це знайшло своє підтвердження як при визначенні загального вмісту азоту в культурах водоростей, так і в дослідах з 15N. На відміну від поглинання іонів NH4+, процес засвоєння NO3- клітинами водоростей супроводжується накопиченням у воді екологічно небезпечних сполук – нітритів, питомий вміст яких найбільший в період інтенсивного розвитку культур водоростей. На прикладі представників роду Scenedesmus встановлена залежність цього процесу від біологічних особливостей видів. Супутні бактерії здатні впливати на кількість нітритів у середовищі через сприяння збільшенню біомаси водоростей. Динаміка вмісту неорганічних сполук азоту у водному середовищі зазнає суттєвих змін під час репродукції водоростей. У водоймах з інтенсивним розвитком фітопланктону спостерігається обернена залежність між його біомасою та концентрацією у воді іонів NH4+ і NO3-, тоді як для нітритів вона може бути як оберненою, так і прямою, що визначається якісним складом фітопланктону. Поряд з планктонними водоростями, активну участь в екологічному метаболізмі азоту беруть водорості-епіфіти, що розвиваються на вищих водяних рослинах. Встановлені нами закономірності кругообігу азоту у воді за участю водоростей підтверджено при використанні такого показника, як кількість хлорофілу "а" в одиниці об'єму води.
РОЛЬ ПРІСНОВОДНИХ ВОДОРОСТЕЙ В ТРАНСФОРМАЦІЇ СЕЧОВИНИ
При вирощуванні культур Scenedesmus acuminatus, Ankistrodesmus fusiformis та Anabaena flos-aquae на сечовині як джерелі азоту нами встановлено, що найбільшим приростом біомаси характеризувались зелені водорості, тоді як синьозелені Anabaena flos-aquae відмирали на 10-ту добу культивування.
У дослідах з використанням (15NH2)2CO, а також при визначенні загального вмісту азоту в культурах зелених та синьозелених водоростей показано, що найактивніше засвоювали азот з цього джерела Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis, тоді як ріст Anabaena flos-aquae був пригніченим до відмирання водоростей на 9–10-ту добу. Виявлено також, що під час росту водоростей на сечовині значна кількість азоту виноситься в атмосферу у вигляді NH3 і на різних етапах вегетації культур коливається в межах 0,7–37,3% від початкового вмісту в культурі.
Ріст прісноводних водоростей на сечовині супроводжується також добовими змінами кількості позаклітинного амонійного азоту, яка знаходиться в оберненій залежності від чисельності їх клітин.
Одержані нами дані свідчать, що досліджувані синьозелені водорості завдяки активності ферменту уреази здійснюють гідроліз сечовини, який супроводжується різким збільшенням у середовищі концентрації амонійного азоту (29,94–42,84 мг N/л) протягом перших 12 діб росту культур. Далі цей процес стабілізується, однак вміст іонів NH4+ залишається високим до кінця досліду (рис. 2). Разом з тим, в культурах більшості хлорококових водоростей кількість
Рис. 2. Динаміка вмісту амонійного азоту (А, В) в культуральному
середовищі та біомаси (Б, Г) синьозелених і зелених водоростей
в процесі їх росту на сечовині: 1 – Plectonema boryanum, 2 –
Spirulina platensis, 3 – Oscillatoria sp., 4 – O. neglecta, 5 –
Microcystis aeruginosa, 6 – Scenedesmus brasiliensis, 7 – S.
communis, 8 – S. maximus, 9 – S. subspicatus.
амонійного азоту, що утворюється внаслідок дії іншого ферменту – амідази сечовини, в цей період набагато менша (не вище 6,13 мг N/л). У подальшому концентрація іонів NH4+ збільшувалась і лише у Chlorella vulgaris досягала 20,80 мг N/л, тоді як у інших видів вона не перевищувала 12,55 мг N/л.
Слід зазначити, що суттєві відмінності спостерігалися також у динаміці накопичення біомаси водоростей. Так, коли основний компонент середовища Фітцджеральда – NaNO3 був замінений на (NH2)2CO з еквівалентною кількістю азоту, біомаса хлорококових водоростей збільшувалась впродовж усього періоду культивування і становила на 40-ву добу для різних видів 317,2–606,2 мг/л. Водночас у культурах синьозелених водоростей (Microcystis aeruginosa, Oscillatoria neglecta, Oscillatoria sp., Plectonema boryanum і Spirulina platensis) максимальний вміст сухої маси був набагато нижчий і знаходився у межах 15,0–31,5 мг/л, а далі водорості відмирали (див. рис. 2).
Інтенсивність процесу гідролізу сечовини з утворенням амонійного азоту зумовлена у хлорококових водоростей біологічними особливостями видів, що підтверджується реєстрацією максимальної концентрації іонів NH4+ на різних етапах розвитку культур. Аналіз динаміки питомого вмісту амонійного азоту в культуральному середовищі хлорококових водоростей свідчить, що більшість із них характеризується максимальними значеннями цього показника в період активного росту. При цьому найбільший питомий вміст іонів NH4+ відмічено у Coelastrum astroideum (91,3 мкг N/мг), а найменший – у Scenedesmus armatus (2,7 мкг N/мг).
При з'ясуванні ролі бактерій – супутників культур хлорококових водоростей встановлено, що амонійний азот, який утворюється під час ферментативного гідролізу сечовини, частково асимілюється бактеріофлорою. Інтенсивність цього процесу, очевидно, зумовлена видовим складом бактерій.
Виявлено суттєві відмінності в активності ферментів, що зв'язують аміак у процесі його асиміляції клітинами зелених і синьозелених водоростей (таблиця). Зокрема, у зелених
Таблиця
Активність ферментів, що зв'язують аміак, у зелених і синьозелених водоростей
Примітка. ГДГ – глутаматдегідрогеназа, мкмоль NADH/мг білка · хв; ГСс – глутамінсинтетаза (синтетазна реакція), мкмоль Pi/мг білка · хв; ГСт – глутамінсинтетаза (трансферазна реакція), мкмоль j-глутамілгідроксамату/мг білка · хв. (M ± m; n = 5).
водоростей активність глутаматдегідрогенази більш як у 20 разів вища, ніж у синьозелених, що свідчить про наявність у них високої здатності щодо детоксикації аміаку. Зелені водорості характеризуються відносно високою активністю глутамінсинтетази в синтетазній реакції, що забезпечує їм можливість тривалого перебування у воді при значній концентрації аміаку. Натомість у синьозелених водоростей більш високою є активність глутамінсинтетази у трансферазній реакції, що вказує на спрямування ними основного потоку іонів NH4+ на синтез білка (Энзимология …, 1987). Отже, представники Cyanophyta можуть розвиватися у водному середовищі лише при певному рівні амонійного азоту, тоді як при його збільшенні вони відмирають через низьку активність детоксикації аміаку.
Одержані нами дані свідчать про те, що трансформацію сечовини до амонійного азоту здійснюють і природні популяції водоростей, які розвиваються у водоймах різного типу, причому її інтенсивність зумовлена кількісним та якісним складом фітопланктону і наявністю світла.
У наших дослідах сечовину гідролізували і водорості, які розвиваються на
вищих водяних рослинах. Активніше цей процес відбувався під час життєдіяльності фітоепіфітону очерету звичайного (Phragmites australis) у порівнянні з епіфітоном рогозу вузьколистого (Typha angustifolia).
Отже, на підставі одержаних даних можна стверджувати, що в процесі росту синьозелених і зелених водоростей на сечовині відбувається її ферментативний гідроліз, який супроводжується накопиченням у середовищі амонійного азоту. Його питомий вміст свідчить про те, що найбільша активність цього процесу спостерігається в період інтенсивного росту культур і зумовлена у хлорококових водоростей видовою специфікою. Наявність в їх культурах бактерій-супутників призводить до зменшення в середовищі концентрації іонів NH4+. Інтенсивність розкладу сечовини природними популяціями водоростей планктону і епіфітону визначається їх кількісним та якісним складом і наявністю світла. Існують суттєві відмінності в активності асиміляції амонійного азоту у синьозелених і хлорококових водоростей, що має істотне значення для процесів формування угруповань фітопланктону.
РОЛЬ ПРІСНОВОДНИХ ВОДОРОСТЕЙ У ЗБАГАЧЕННІ ВОДИ ОРГАНІЧНИМИ СПОЛУКАМИ АЗОТУ
Значну частку серед розчинених у воді органічних азотвмісних сполук водоростевого походження становлять речовини білкової природи, що надходять у воду, в основному, внаслідок автолізу чи лізису відмерлих клітин (Семенов, 1967). Результати наших досліджень свідчать, що кількість білковоподібних речовин у р. Прип'ять знаходиться у межах 0,026–0,062 мг/л, у р. Здвиж – 0,026–0,103 і в р. Ірпінь – 0,038–0,073 мг/л. Порівняння вмісту досліджуваних сполук з біомасою фітопланктону виявило наявність між зазначеними показниками позитивного зв'язку (r = 0,23–0,55 при P = 0,95). Показано, що підвищення концентрації речовин білкової природи у водотоках басейну Дніпра здебільшого спостерігається в періоди зростання біомаси планктонних водоростей (рис. 3).
Рис. 3. Динаміка біомаси фітопланктону (1), вмісту білковоподібних
речовин – БПР (2) і вільних амінокислот (3) у деяких притоках
Дніпра: А, В – р. Здвиж; Б, Г – р. Ірпінь.
У зв'язку з тим, що вміст вільних амінокислот у природній воді значною мірою залежить від життєдіяльності водоростей, ми дослідили його сезонну
динаміку залежно від біологічних процесів у деяких притоках Дніпра. Встановлено, що концентрація вільних амінокислот у р. Прип'ять знаходилась у межах 7,1–123,0 мкг/л, у р. Здвиж – 5,5–153,0 мкг/л і в р. Ірпінь – 3,0–158,9 мкг/л. Порівняння цих даних з кількісними показниками розвитку фітопланктону свідчить про те, що у вегетаційний період підвищення вмісту досліджуваних азотвмісних сполук здебільшого збігалося з максимумами біомаси планктонних водоростей (див. рис. 3). У результаті проведеного кореляційного аналізу встановлено позитивні коефіцієнти кореляції, які становили для р. Прип'ять 0,47, для р. Здвиж – 0,63 і для р. Ірпінь – 0,78 (при P = 0,95). Наявність такої залежності вказує на те, що рослинний планктон в досліджуваних водотоках є одним із важливих джерел збагачення води вільними амінокислотами.
Поряд з кількісними показниками вмісту амінокислот у природній воді, важливо знати і їх якісний склад. Відомо, що природна вода характеризується досить різноманітним складом вільних амінокислот (Кораблева, 1978, 1983, 1987). У зв'язку з цим ми дослідили якісний і кількісний склад цих азотвмісних сполук у воді Київського та Канівського водосховищ і порівняли його з інтенсивністю розвитку фітопланктону. У воді досліджуваних водойм нами виявлено 17 амінокислот: аспарагінову, треонін, серин, глутамінову, пролін, гліцин, б-аланін, цистин, валін, метіонін, ізолейцин, лейцин, тирозин, фенілаланін, гістидин, лізин та аргінін. Найбільша кількість вільних амінокислот (753,0 мкг/л) зареєстрована в районі Київської ГЕС, де спостерігалась і найвища біомаса фітопланктону. Із її зниженням зменшувався і вміст вільних амінокислот, і вже в районі Тетерівської затоки він становив 377,2 мкг/л, а в районі злиття річок Прип'ять та Дніпро – лише 197,1 мкг/л.
У Канівському водосховищі виявлено подібну тенденцію: у його верхній ділянці при біомасі водоростей 6,970 мг/л вміст вільних амінокислот у воді становив 100,3 мкг/л, а поблизу греблі біля м. Канева – 304,0 мкг/л (біомаса – 17,280 мг/л).
Оскільки водорості є одним із джерел збагачення природної води азотвмісними сполуками, значний інтерес становлять результати, пов'язані з вивченням особливостей амінокислотного складу їх білків. Провівши дослідження щодо якісного спектру зв'язаних амінокислот у прісноводних водоростей Calothrix braunii, Oscillatoria limosa, Scenedesmus armatus, Scenedesmus maximus, Pediastrum boryanum і Selenastrum gracile, ми виявили 17 амінокислот, а саме: аспарагінову, глутамінову, треонін, серин, пролін, гліцин, б-аланін, цистин, валін, метіонін, ізолейцин, лейцин, тирозин, фенілаланін, гістидин, лізин та аргінін. Кількісний аналіз показав, що в білках досліджуваних видів водоростей домінують аспарагінова і глутамінова кислоти (22,2–27,9% загального вмісту). Зазначені водорості характеризувались також порівняно високим вмістом б-аланіну (7,7–9,9%) та лейцину (7,5–9,5%). Представники пор. Chlorococcales відзначались значною кількістю гліцину (6,6–8,2%), тоді як Calothrix braunii – помітним вмістом лізину (7,2%) та серину (7,0%), а Oscillatoria limosa та Selenastrum gracile – аргініну (відповідно 8,7 і 8,0%). У складі білків в найменшій кількості містяться цистин (0,6–2,1%), гістидин (1,4–1,8%) і метіонін (1,3–4,4%).
У більшості досліджених видів водоростей загальна кількість зв'язаних амінокислот знаходилася у межах 20682,2–26290,8 мкг на 100 мг сухої маси і лише у Calothrix braunii становила 40537,8 мкг/100 мг.
З огляду на те, що водорості є важливим джерелом збагачення води леткими амінами, та у зв'язку з недостатньою вивченістю їх складу, ми дослідили якісний спектр цих азотвмісних сполук у двох представників хлорококових водоростей – Scenedesmus acutus і Chlorella fusca. В період логарифмічної фази їх росту серед позаклітинних летких амінів були ідентифіковані такі: метиламін, етиламін, н-пропіламін, ізопропіламін, н-бутиламін, циклогексиламін, н-гептиламін, диметиламін, диетиламін, диізопропіламін, н-пропіл-н-бутиламін, н-пропіл-н-пентиламін, н-пропіл-циклопентиламін, ізопропілізобутиламін, ди-н-бутиламін, метил-н-бутиламін, н-бутилізопентиламін, ізобутилізопентиламін, метил-втор-пентиламін, метил-н-гексиламін, етил-н-гексиламін, аліл-ізопентиламін, триметиламін, диметилетиламін, триетиламін, ди-н-пропіл-н-бутиламін, ди-н-бутилметиламін, піридин, 2,6-диметилпіридин, піперидин, 2-метилпіразин, N,N-диметилпіперазин та N-етилпірол. Характерною рисою Chlorella fusca була відсутність н-бутиламіну, н-гептиламіну, диізопропіламіну та н-пропіл-циклопентиламіну. Серед метаболітів Scenedesmus acutus не виявлені н-пропіл-н-пентиламін та 2,6-диметилпіридин. Серед продуктів метаболізму цих двох видів водоростей більшість амінів ідентифіковано нами вперше, раніше для них були відомі лише метиламін, диметиламін, етиламін, н-пропіламін, ізобутиламін та етаноламін (Klein, Kneifel, 1978; Kneifel, 1977; Kneifel et al., 1976, 1977; Rolle et al., 1971, 1977).
Дослідженнями азотвмісних сполук, які потрапляють у воду внаслідок розкладу біомаси природних популяцій основного збудника "цвітіння" води у дніпровських водосховищах - Microcystis aeruginosa, поряд з уже відомими речовинами цієї природи (Мельниченко и др., 1974; Осипов, 1980; Сакевич, 1985; Клоченко, 1988), були виявлені метилетиламін, метилізобутиламін, метил-циклопентиламін, метил-н-гексиламін, ізопропіл-н-пентиламін і диізобутиламін.
Водночас з накопиченням летких амінів у воді відбувається їх асиміляція клітинами водоростей. Цей процес було зафіксовано нами у Канівському водосховищі, де із збільшенням біомаси фітопланктону кількість летких амінів зменшувалася, що підтвердив і проведений кореляційний аналіз (r = –0,52 при P ? 0,95). Однак ця залежність не є лінійною, а описується степеневою функцією: y = 20,552 · x-0,38, де у – вміст амінів, мкг/л, а х – біомаса водоростей, мг/л. Кількість летких амінів у цій водоймі коливалась в межах 7,5–64,0 мкг/л.
Для підтвердження асимілюючої здатності водоростей по відношеню до летких амінів ми провели досліди з 14С-диметиламіном. Виявлена нами різниця в інтенсивності поглинання цієї сполуки зумовлена, очевидно, різним фізіологічним станом клітин і біомасою водоростей.
З'явившись у воді внаслідок активної життєдіяльності водоростей, а також після їх відмирання, азотвмісні метаболіти трансформуються надалі в інші сполуки, серед яких можуть бути і канцерогенні речовини (Клоченко, 1988). Дослідивши особливості синтезу сполук цієї природи за умов різної концентрації амінів водоростевого походження, а також нітритів, ми встановили, що кількість утворених N-нітрозамінів досягала майже 500 мкг/л. Вона знаходиться в прямій залежності від вмісту попередників та істотно зменшується із зростанням рН середовища. В процесі ідентифікації речовин, які утворюються внаслідок реакції нітрозування, поряд з уже відомими N-нітрозодиметиламіном (НДМА), N-нітрозопіперидином (НПІП) та N-нітрозопіролідином (НПІР) (Клоченко, 1988), було виявлено ще дві нові сполуки, а саме: N-нітрозодибутиламін (НДБА) і N-нітрозоморфолін (НМОР). Показано, що при трансформації амінів Microcystis aeruginosa переважали НДБА (59,4%) і НДМА (30,6%), у Spirulina platensis – НДБА (46,2%) і НМОР (44,1%) і у Chlorella vulgaris – НДБА (74,0%).
Провівши дослідження щодо наявності N-нітрозамінів у природних водоймах, ми встановили, що концентрація НДМА в Кременчуцькому водосховищі коливалась у межах 0,7–1,8 мкг/л, причому найбільша його кількість відмічалася у поверхневих шарах води. На нашу думку, це могло бути пов'язано з різною інтенсивністю вегетації водоростей і відповідно з різним рівнем їх азотвмісних метаболітів.
Отже, фітопланктон відіграє важливу роль у збагаченні води притоків Дніпра білковоподібними речовинами та вільними амінокислотами. Зокрема збільшення концентрації зазначених азотвмісних сполук у вегетаційний період здебільшого збігається з найвищими показниками біомаси фітопланктону. Серед вільних амінокислот, розчинених у воді Київського та Канівського водосховищ, ідентифіковано 17 сполук, концентрація яких залежить від інтенсивності вегетації планктонних водоростей. Склад зв'язаних амінокислот синьозелених і зелених водоростей в цілому схожий, однак їх білки відрізняються кількісним співвідношенням цих амінокислот.
Леткі аміни можуть утворюватися як в процесі активної життєдіяльності водоростей, так і після відмирання їх клітин. Серед вперше ідентифікованих сполук цієї групи речовин переважають вторинні аміни. Поряд з накопиченням летких амінів в природних водоймах спостерігається їх асиміляція клітинами водоростей, інтенсивність якої найбільша при помірному розвитку фітопланктону. Кількість N-нітрозамінів – сполук, що утворюються внаслідок трансформації амінів водоростевого походження, прямо пропорційна концентрації попередників і зменшується із збільшенням величини активної реакції водного середовища. Серед вперше ідентифікованих продуктів реакції нітрозування за участю метаболітів водоростей слід вказати на N-нітрозодибутиламін і N-нітрозоморфолін. N-нітрозосполуки виявлені і у водосховищах Дніпра – на ділянках, де фітопланктон перебуває у стані активної вегетації.
ПРІСНОВОДНІ ВОДОРОСТІ ЯК ДЖЕРЕЛО ВТОРИННИХ АЗОТВМІСНИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ СПОЛУК
Поряд із сполуками, які беруть безпосередню участь у метаболізмі клітин водоростей (вуглеводи, амінокислоти, органічні кислоти, ліпіди тощо), ці автотрофні організми продукують різноманітні вторинні речовини, такі як гормони, антибіотики, токсини тощо. Проведені нами дослідження показали, що здатність синтезувати гепатотоксини притаманна і водоростям, які розвиваються у водоймах України. Так, зокрема, вивчення вмісту мікроцистинів (азотвмісні сполуки, які відомі своєю токсичною дією внаслідок руйнування печінки у різноманітних теплокровних тварин і впливають на життєдіяльність гідробіонтів) свідчить, що їх кількість у біомасі синьозелених водоростей змінювалась від 0,01 до 726,3 мкг/г сухої маси. Найбільший вміст мікроцистинів був зареєстрований у водоростей, які розвиваються в планктоні водосховищ Дніпра. Зокрема, у Київському водосховищі він становив 15,5–150,0 мкг/г, у Канівському – 50,0–270,0 мкг/г, у Кременчуцькому – 21,8–261,1 мкг/г та у Дніпродзержинському – 63,0–726,3 мкг/г.
Аналіз видового складу водоростей, в біомасі яких визначали мікроцистини, показав, що їх великий вміст у дніпровських водосховищах можна пояcнити наявністю Microcystis aeruginosa як домінуючого виду, а також присутністю інших збудників "цвітіння" води – Aphanizomenon flos-aquae та Anabaena flos-aquae, тобто видів з широким спектром адаптаційних можливостей, які виборюють собі місце в ареалі.
При відсутності серед домінуючих видів основного продуцента мікроцистинів – Microcystis aeruginosa (наприклад, в озерах) суттєво зменшується і кількість токсинів. Так, у більшості водойм цього типу вміст гепатотоксинів не перевищував 60,0 мкг/г і лише в одному випадку в озері у с. Глеваха сягав 354,0 мкг/г.
Ще нижчим був вміст гепатотоксинів при відсутності Microcystis aeruginosa в зразках біомаси як у ролі домінанта, так і субдомінанта, наприклад у складі фітоперифітону і фітобентосу. В цих випадках кількість мікроцистинів у біомасі водоростей не перевищувала 24,4 мкг/г.
Підтвердженням одержаних результатів можуть служити також середні величини вмісту мікроцистинів. Так, для водоростей водосховищ Дніпра цей показник становив 177,8 мкг/г, значно меншим він був для водоростей озер – 50,6 мкг/г і мінімальним – для фітобентосу – 4,1 мкг/г та фітоперифітону водосховищ – 2,3 мкг/г.
Значна кількість мікроцистинів виявлена нами і у воді досліджуваних водних об'єктів. Зокрема, протягом наших спостережень вміст цих сполук у воді дніпровських водосховищ знаходився у межах 5–500 мкг/л, а у водоймі-охолоджувачі Чорнобильської АЕС не перевищував 250 мкг/л.
Одержані нами результати свідчать про високу стійкість мікроцистинів щодо руйнування, оскільки їх вміст у сухій біомасі водоростей, яка зберігалась впродовж десяти років у колекції Інституту гідробіології НАН України, становив декілька сотень мікрограмів на 1 г, а порівняння оригінальних даних про вміст мікроцистинів у біомасі водоростей з рівнями радіонуклідів дає підставу стверджувати, що здебільшого між ними не існує чітко вираженого зв'язку.
Відомо, що рівень токсичності метаболітів синьозелених водоростей коливається у досить широких межах (Rinehart et al., 1994; Carmichael, 1997). Проведений нами порівняльний аналіз літературних даних щодо структури відомих токсинів водоростевого походження дозволив запропонувати механізм їх активації, виходячи з наявності в них так званих функціональних груп (Курчій, 1998), які містять атом водню, що легко відщеплюється від них. Внаслідок цього молекула речовини переходить у вільнорадикальний стан, в якому сполуки легко реагують з ліпідами, нуклеїновими кислотами та білками, що може викликати перебіг вільнорадикальних реакцій, які не контролюються ферментами або антиоксидантами.
Експериментальні дослідження показали, що прісноводні водорості поряд з токсичними сполуками продукують метаболіти, які можуть істотно впливати на розвиток мікроскопічних грибів. У наших дослідах встановлено, що представники родів Anabaena, Aphanizomenon, Calothrix, Gloeotrichia, Hapalosiphon, Lyngbya, Nostoc, Oscillatoria, Plectonema, Spirulina і Tolypothrix синтезують і здатні виділяти у середовище біологічно активні азотвмісні сполуки, які пригнічують ріст грибів з роду Fusarium. Ці мікроміцети спричиняють різні хвороби таких сільськогосподарських культур, як пшениця, жито, ячмінь, овес, рис, соя, боби, картопля та інші, знижуючи їх урожайність. Найбільш активними по відношенню до Fusarium oxysporum були метаболіти Calothrix braunii, Hapalosiphon fontinalis, Gloeotrichia natans, Oscillatoria sp., Spirulina platensis і Tolypothrix tenuis. Проведені нами дослідження з використанням рідинної хроматографії (HPLC) та мас-спектроскопії виявили серед метаболітів Calothrix braunii досить активну азотвмісну сполуку з характеристичним іоном з m/z 327,17.
Таким чином, внаслідок інтенсивного розвитку синьозелених водоростей у різнотипних водоймах України накопичуються токсичні азотвмісні сполуки – мікроцистини, концентрація яких у воді сягає 500 мкг/л. Значна кількість цих сполук (більш ніж 700 мкг/г) міститься також в біомасі водоростей і може зберігати токсичність протягом десяти років. Серед важливих чинників, які впливають на кількість мікроцистинів як у воді, так і в біомасі водоростей, є наявність основного продуцента – Microcystis aeruginosa. Різний рівень активності токсичних азотвмісних сполук пов'язаний, на нашу думку, з особливостями їх хімічної структури, зокрема з наявністю в них атомів водню, які легко відщеплюються від молекули.
Метаболіти прісноводних синьозелених водоростей виявляють фунгіцидну активність, що продемонстровано на прикладі представників роду Fusarium. Інтенсивність дії метаболітів водоростей на мікроміцети є видоспецифічною. За допомогою сучасних аналітичних методів (HPLC та мас-спектроскопії) у Calothrix braunii виявлена сполука, яка пригнічує ріст Fusarium oxysporum – збудника хвороб бобів та льону.
|
