|
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА УААН
Мауссе Франсіско Саломон
УДК 636.22/.28:57.08
ЧУТЛИВІСТЬ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ РІЗНИХ СТАДІЇ РОЗВИТКУ ДО ДІЇ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР
03.00.20 - Біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
ХАРКІВ - 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біотехнології відтворення і генної інженерії Інституту тваринництва УААН та в лабораторії трансплантації ембріонів АТЗТ “Світанок” Охтирського району Сумської області.
Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук
Безуглий Микола Дмитрович,
директор Харківського біотехнологічного
центру
Офіційні опоненти :
-доктор ветеринарних наук, професор, Харута Григорій Григорович, Білоцерківського державного аграрного університету зав. каф. ветеринарного акушерства і гінекології
-доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Вишневський Валентин Йосипович Інституту кріобіології та кріомедицини УААН
Провідна установа: Державний науково-дослідний інститут біотехнології
і штамів мікроорганізмів, м. Київ
Захист дисертації відбудеться ‘’_29__ ‘’ ___червня__________ 1999 р. о _12_____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д27.821.01 при Білоцерківському державному аграрному університеті, 256400, Київська обл., м. Біла Церква, пл. Волі, 8/1 корп. № , ауд. №
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Білоцерківського аграрного державного університету.
Автореферат розісланий ‘’ __25_’’_____травня_________1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої Ради,
кандидат біологічних наук Розпутній О.І.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми.
Ефективність застосування найновіших методів біотехнології відтворення с.-г. тварин, таких як клонування, химеризація, виявлення статі ембріонів та ін. може зростати тільки при наявності банку ембріонів. Єдиним способом збереження ембріонів в зворотньому анабіозі є їх заморожування і тривале зберігання при низьких температурах.
Використання розроблених способів заморожування ембріонів корів на стадіях ранніх морул і бластоцист після вилуплення з зони пелюцида менш результативне, тобто дає низький рівень приживлення після пересадки реципієнтам. Очевидно, що для заморожування таких ембріонів необхідно або оптимізувати окремі технологічні параметри раніше розроблених способів заморожування, або розробити інші, більш ощадливі способи їх кріоконсервації для підвищення рівня збереженості і приживлення пересаджених ембріонів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Подана робота має зв’язок з такими науковими програмами як: створення нових режимів заморожування ембріонів ссавців з врахуванням їх стадій розвитку, класификація ембріонів корови для їх використання в різних біотехнологічнних методах а також пов’язана з програмою навчання студентів по спеціальностям біологічного профілю.
Мета і задачі досліджень.
У зв’язку з вищевказаним є актуальним встановити причини різної чутливості ембріонів корів різних стадій розвитку до дії низьких температур і розробити спосіб заморожування таких зародків. Для досягнення поставленої мети нами вирішувалися наступні задачі:
1. Отримати ембріони корів різних стадій розвитку від 8-ми клітинної до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида.
2. Вивчити стійкість до температурного шоку ембріонів різних стадій розвитку.
3. Вивчити морфологічні відмінності і особливості транспорту речовин для ембріонів різних стадій розвитку.
4. Порівняти здатність до виживання деконсервованих ембріонів на стадіях від ранньої морули до вилупленої бластоцисти, що заморожені стандартним методом.
5. Застосувати методи кріоконсервації органів і тканин ссавців для заморожування ембріонів на стадії вилупленої бластоцисти.
Наукова новизна одержаних результатів. Запропонована нова класифікація ембріонів у відповідності зі стадіями їх розвитку від 8-ми клітинної до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида;
-показано що стійкість до температурного шоку ембріонів корів різних стадій розвитку зростає поступово по мірі зміни стадій розвитку. Встановлено, що стійкість зростає з 0% для 8-ми клітинних ембріонів до 55% для ранніх морул і досягає 100% для компактних морул бластоцист в зоні пелюцида, але падає до 63% для денудованих бластоцист;
-встановлено, що на збереженість 8-ми клітинних ембріонів впливає тривалість експозиції при 00 С;
-показано різницю протікання осмотичних процесів у ембріонів різних стадій розвитку ;
-запропоновано спосіб кріоконсервації ембріонів на стадії пізньої бластоцисти без зони пелюцида, що забезпечує рівень приживлення в 2,4 рази вищий за результатами трансплантації, ніж при використанні стандартного методу заморожування.
Практичне значення одержаних результатів.
Дані, отримані в результаті різкого охолодження ембріонів корів різних стадій розвитку, з урахуванням характеру протікання осмотичних процесів, можуть бути застосовані для оптимізації і створення режимів заморожування відповідного віку ембріонів; в біологічних і ветеринарних вузах при складанні програм навчання студентів, в наукових і виробничих програмах.
Оптимізований нами режим заморожування ембріонів використовується при заморожуванні денудованих бластоцист в лабораторії трансплантації ембріонів АТЗТ ‘’Світанок’’ Охтирського р-ну Сумської області і в Харківському біотехнологічному центрі при виконанні наукових і виробничих програм.
Особистий внесок здобувача.
Більшість досліджень виконані автором самостійно. Методичні підходи і схеми дослідів відпрацьовані спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації.
Основні положення дисертації були представлені на розгляд вченої ради Харківського біотехнологічного центру та обговорені на міжнародній науково-виробничій конференції “Теорія та практика племінної справи у тваринництві” (Харків, 1996).
Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результати досліджень, висновків та пропозиції виробництву. Містить 16 таблиць, 13 рисунків та 7 фотографій. Список літератури включає 206 найменуваннь, у тому числі 113 іноземною мовою.
Публікації.
Дисертантом опубліковано 5 наукових статей в журналах, що входять в перелік ВАК України, такими як ‘’Науково-технічний бюлетень’’ № 75 Інституту тваринництва УААН; ‘’Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини‘’ № 4, харківвского зооветеринарного інституту, ‘’Проблем Біології і Медицини‘’ № 8, полтавської медицинської академії. Крім того, ним був опублікований тезис для наукової конференцції, присвяченої 80-річчю з дня народження член-кореспондента ВАСГНІЛ Ф.Ф.Ейснера.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження.
Об’єктом досліджень були ембріони корів від 8-ми клітинної стадії розвитку до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида. Ембріони різних стадій розвитку отримували шляхом промивання яйцепроводів та рогів матки корів та телиць-донорів після попередньої обробки тварин з метою отримання реакції суперовуляції.
Оцінка життєздатності ембріонів проводилася морфологічно, за результатами культивування in vitro і шляхом пересадки ембріонів реципієнтам.Заморожування ембріонів проводилося стандартним методом за допомогою термоблоку, розміщеного у горловині посудини Дьюара.
Принцип дії цього пристрою заснований на пасивному охолодженні (Осташко Ф.І., Безуглий М.Д., 1989). Швидкість охолодження при цьому визначали за допомогою самопишучого потенціометра КСП-4.
Понашвидке охолодження проводилося шляхом прямого переносу дослідних біооб’єктів з 370С в танучий лід. Швидкість охолодження в цьому випадку була визначена за допомогою проведених нами математичних розрахунків.
Результати досліджень
Отримання ембріонів різних стадій розвитку.
В дослідах було використано 80 корів-донорів, які позитивно прореагували суперовуляцію (817 жовтих тіл), відповідно 10,21 жовтих тіл на кожного донора. Із результатів видно, що всього було отримано 665 біологічних об’єктів, серед яких 168 (25%) виявились яйцеклітинами, а 497 (75%) - ембріонами. Ці дані свідчать про високу ефективність обробки донорів з метою отримання реакції суперовуляції. Аналіз якості отриманих ембріонів та їх розподіл за стадіями розвитку наведені в таблиці 2. За даними цієї таблиці видно, що із 75% отриманих ембріонів 46% були відмінної якості, 27% - доброї, 14% - задовільної, а 13%- незадовільної. Ці результати свідчать про високу якість батьківських репродуктивних клітин. Присутність яйцеклітин пояснюється варіабельністю темпів овуляції. Як видно із результатів, ембріони однієї й тієї ж стадії розвитку можна вилучити на протязі декількох днів естрального циклу.
Так, 8-ми клітинні ембріони були вилучені не тільки на протязі 4-го дня статевого циклу, що відповідає їх фізіологічному вікові, але і на п’ятий день, коли, зазвичай, ембріони корови знаходяться на більш продвинутих стадіях розвитку. Результати отримання ембріонів подано в таблиці 1.
Таблиця 1.
Результати вилучення ембріонів корів різних стадій розвитку.
*- вилучення проводилося після забою тварин-донорів
До цієї стадії слід відносити всі зародки до моменту імплантації (14-17-й день після осіменіння), але в дослідах ми використовували лише 9-10-денні блас-тоцисти, хоча 3 з них були отримані вже на 8-ий день статевого циклу.
Відносно бластоцист після вилуплення цей висновок не дійсний, так як до цієї стадії розвитку ми відносили всі бластоцисти, що втратили зону пелюцида, без урахування кількості клітин в них і їх розмірів.
Таблиця 2.
Якість ембріонів різних стадій розвитку.
Гетерогенність розвитку ембріонів в статевих шляхах корів-донорів після гормональної обробки була підтверджена ще й тим, що на протязі одного й того ж дня статевого циклу були вилучені зародки різного віку.
На наш погляд, ембріони різних стадій розвитку, але вилучені із статевих шляхів донора на протязі одного й того ж дня статевого циклу мають різний вік, що пояснюється різноякісністю самих ембріонів, нерівномірністю процесу овуляції. Ці результати наведені на мал. 1.
Чутливість ембріонів корів до охолодження до 00С.
Отримані ембріони поміщали в термостат при температурі +370С, потім охолоджували з визначеною швидкістю до фіксованої температури, витримували визначений час і потім проводили короткочасне (24 год.) культивування in vitro.
На початку вивчення чутливості ембріонів корів різних стадій розвитку ми визначали технологічні параметри, що можуть впливати на збереженість ембріонів при охолодженні: кінцеву температуру охолодження, швидкість зниження температури, експозицію при кінцевій температурі та наявність кріопротектора.
На початку вивчення чутливості ембріонів до низьких температур ембріони (від 8-ми клітинних до бластоцист після вилуплення із зони пелюцида) охолоджували шляхом прямого переносу із термостатованої чашки Петрі при 370 С до кінцевої температури 00 С. При цьому охолодження проводилося з різною швидкістю не меншою 1600 0 С/с. Результати подані в таблиці 3.
. Таблиця 3.
Збереженість ембріонів корови при охолодженні до 00С
Цифри з однаковим літерним індексом означають, що результати достовірні (P>0,95), цифри з різним літерним індексом означають, що результати не достовірні.
Для більш точного визначення температурного діапазону, в якому відбувається загибель ембріонів від температурного шоку, ми охолоджували ембріони від 8-ми клітин до компактної морули, з +370 С до +200 С (кімнатна температура). Отримані результати подані в таблиці 4.
Із даних таблиці випливає, що збереженість ембріонів всіх стадій достовірно не відрізнялась одна від одної і від контролю. Таким чином, критична температура охолодження, яка призводить до загибелі ембріонів, знаходиться в діапазоні від +20 до 00 С.
Причиною різниці в чутливості ембріонів різних стадій розвитку до різкого охолодження можуть бути фізіологічні і біохімічні відмінності ембріонів і, зокрема, відмінності в кількості та якості ліпідних компонентів цитоплазми і цитоплазматичних мембран бластомерів.
Далі ми вивчали вплив швидкості зниження температури на збереженість ембріонів.
Таблиця 4.
Збереженість ембріонів корови різних стадій при охолодженні до 200С
Для дослідження цього фактору ембріони на стадіях від 8-ми клітин до компактної морули охолоджували від 370 С до 00 С з різною швидкістю (1, 10 і 30 хв.), витримували на протязі 1 хвилини при 00 С, переносили в середовище з температурою +370С, оцінювали морфологічно і культивували. Результати даного досліду подані в таблиці 5.
Таблиця 5.
Збереженість ембріонів корів різних стадій охолоджених до 00С з різною швидкістю.
Із поданих результатів таблиці №5 випливає, що швидкість охолодження ембріонів до 00С не чинить істотного впливу на збереженість ембріонів від 8-ми клітин до компактних морул.
Наступним параметром, що може зумовлювати чутливість ембріонів, є їх експозиція при температурі 00 С. Вивчення впливу цього фактору проводилося шляхом переміщення ембріонів з фізіологічних умов у середовище з температурою 00С і експозиціях у ньому 7с., 1 та 30 хвилин, після чого ембріони оцінювали морфологічно та культивували. Результати подані в таблиці 6.
З таблиці видно, що для ембріонів на стадії компактної морули і розширеної бластоцисти рівень збереженості не залежить від експозиції. Тим часом, 8-ми клітинні ембріони витримують лише короткочасні експозиції в 33% випадках. Цей факт дозволяє припустити, що пошкоджуючу дію низьких температур на 8-ми клітинні ембріони частково зумовлює тривалість експозиції.
Таблиця 6.
Кількість життєздатних ембріонів після охолодження до 0оС при
різних експозиціях.
Можливо, визначною умовою в цьому випадку є наявність фазових переходів складових компонентів цитоплазматичних мембран із рідкокристалічного в твердокристалічний стан. Нами була вивчена захисна дія гліцерину при різкому охолодженні ембріонів до 00 С. Ембріони на стадіях від компактної морули до бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида насичували гліцерином в концентрації 1,2 М при +370 С, потім переносили в середовище з температурою танучого льоду, витримували на протязі однієї хвилини і повертали в фізіологічні умови. Після виведення гліцерину 0,5 М розчином сахарози ембріони відмивали і оцінювали якість як і в попередніх дослідах. Контрольну групу ембріонів піддавали аналогічному насиченню, однак охолодження їх не проводили (Таблиця 7).
Таблиця 7.
Збереженість ембріонів корів різних стадій насичених 1,2 М розчином
гліцерину, при охолодженні до 00С
Дані таблиці 7 показують, що при охолодженні ембріонів, які вивчалися, гліцерин не змінює їх збереженість на стадіях від компактної морули до стадії бластоцисти після вилуплення із зони пелюцида.
Заморожування ембріонів різних стадій розвитку.
Експерименти по низькотемпературній консервації ми почали дослідом по заморожуванню ембріонів всіх стадій розвитку, що вивчалися нами, використовуючи стандартні методи. Як кріопротектор використовували гліцерин у концентрації 1,2 М. Насичення і видалення кріопротектору проводилося одноступінчато. Заморожування проводилось із використанням термоблоку, поміщеного в горловину судини Дюара. При цьому режим заморожування відповідав закону пасивного охолодження до кінцевої температури -30 ± 2,40С.
Після видалення кріопротектору ембріони оцінювали морфологічно і поміщали на короткочасне культивування in vitro.
Ті ембріони, що зберегли життєздатність після заморожування-відтавання, пересаджувались коровам і телицям-реципієнтам нехірургічним методом. Результати досліду подані в таблиці 8.
Таблиця 8.
Збереженість ембріонів корів різних стадій після кріоконсервації.
*- ембріони не культивували, а відразу пересадили реципієнтам.
| 
