|
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
СЕЛЕКЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ІНСТИТУТ
КУЗНЄЦОВ ВАЛЕРІЙ ЄВГЕНОВИЧ
УДК 575:57.089.67:591.32:599
ЦИТОГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ РОЗВИТКУ
IN VITRO ДОІМПЛАНТАЦІЙНИХ ЗАРОДКІВ ССАВЦІВ,
ОТРИМАНИХ БІОТЕХНОЛОГІЧНИМИ МЕТОДАМИ
03.00.15-генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Одеса-1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин УААН.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Соломко Олександр Петрович
Інститут молекулярної біології і
генетики НАН України, м.Київ
зав. від. біохімічної генетики
доктор біологічних наук,
професор Клименко В'ячеслав Вікторович
Інститут тваринництва УААН, м.Харків
зав. лаб. генетики розвитку
доктор біологічних наук,
професор Чухрій Борис Миколайович
Інститут землеробства і біології
тварин УААН, м.Львів
головний науковий співробітник
Провідна установа: Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка, м.Київ
кафедра загальної та молекулярної
генетики
Захист відбудеться “14” травня 1999 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 05.15.01 Селекційно-генетичного інституту УААН за адресою: 270036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Селекційно-генетичного інституту УААН, 270036, м. Одеса, Овідіопольська дорога, 3.
Автореферат розісланий 5 квітня 1999 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Станкевич А.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останнім часом в світі відбувається швидкий розвиток біотехнологій. Важливий вклад у розуміння, дослідження та вирішення багатьох фундаментальних проблем становлення та індивідуального розвитку організмів, отриманих біотехнологічними методами, вносять генетика, клітинна біологія та експериментальна ембріологія. Суттєве значення в цьому відношенні має вивчення особливостей раннього доімплантаційного розвитку ссавців in vitro та in vivo [Дыбан А.П., 1988; Mason L., 1989; Seidel G.E., 1983].
Багато питань репродуктивної біотехнології, які відображають різні напрями досліджень, залишаються нез'ясованими. Зокрема, важливого значення набуває розроблення більш об'єктивних способів оцінки якості сперми самців сільськогосподарських тварин. Íа клітинному та субклітинному рівнях, а також за рівнем розвитку після трансплантації існує істотна різниця між зародками, отриманими in vivo та in vitro у великої рогатої худоби. Значний інтерес викликають дослідження партеногенетичного розвитку ооцитів ссавців. Привертають увагу надзвичайні можливості химерних ембріонів, зокрема для отримання потомства методом так званого "химерного" клонування [Modlinski J.A., Karasiewicz J., 1997]. Важливе значення має удосконалення методів отримання монозиготних близнят у різних видів тварин. Багатообіцяючі надії пов'язані із розробкою й удосконаленням принципово нового способу розмноження у тварин - клонуванням пересадкою ядер у позбавлену власного ядерного матеріалу яйцеклітину або зиготу. Це потребує вивчення таких фундаментальних проблем як здатність геному різних типів клітин до взаємодії з реципієнтною цитоплазмою, роль фаз клітинних циклів у перепрограмуванні хроматину донорського ядра, значення характеристик цитопластів для успішної пересадки ядер, множинне клонування, вплив цитоплазматичної спадковості на клонування та ін.
Значні можливості для вивчення мейотичних та мітотичних перетворень хроматину гамет і зародків, досліджень впливу різних типів хромосомних порушень на розвиток гамет та ембріонів, оцінки біологічної повноцінності ооцитів, сперматозоїдів та зародків, досліджень шляхів розвитку зародків різного походження мають цитогенетичні методи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту розведення і генетики тварин УААН по завданнях: “Розробити нові методи і технології розмноження сільськогосподарських тварин” 1986-1990 рр. (N держреєстрації 01.87.0050462); "Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин" 1991-1995 рр. (N держреєстрації UA01001476P); "Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів в селекції сільськогосподарських тварин" 1996-1998 рр. (N держреєстрації 0196U016325), а також була підтримана грантами Міністерства України у справах науки і технологій N 03.05.02/008-93 (1993-1995 рр.), N 03.05.00/001-94 (1994-1995 рр.) та N держреєстрації 0198U002131 (1997-1998 pp.).
Мета і завдання досліджень. Метою роботи було отримання біологічно повноцінних зародків ссавців біотехнологічними методами, вивчення їх цитоморфологічних характеристик, особливостей розвитку in vitro на початкових стадіях ембріогенезу, оцінка мейотичних і мітотичних перетворень хромосом ооцитів і зародків.
Згідно з метою досліджень були поставлені наступні завдання:
1. Удосконалити способи одержання повноцінних ембріонів великої рогатої худоби in vitro, в тому числі з використанням ооцитів, одержаних з яєчників живих донорів.
2. На основі теоретичного обгрунтування розробити нові методичні підходи до "химерного" клонування у ссавців.
3. Вивчити вплив різних факторів на ефективність отримання телят після мікрохірургічного поділу ембріонів.
4. Удосконалити методики енуклеації і партеногенетичної активації ооцитів, пересадки ядер зародків для підвищення ефективності отримання реконструйованих зародків у кролів та великої рогатої худоби.
5. Оцінити стан хроматину ядер зародків великої рогатої худоби різного походження та метафазні пластинки ооцитів золотистого хом'ячка і корів, сперміїв бугая, перетворення хроматину після запліднення in vitro та активації до партеногенезу цитогенетичними методами.
Наукова новизна одержаних результатів. Удосконалені методики вилучення ооцитів з яєчників живих корів та телиць під контролем ультразвуку, культивування і запліднення in vitro ооцитів від окремих донорів, що дозволило отримати 2-6-клітинні зародки та бластоцисти з тією ж частотою, що і для ооцитів, вилучених з яєчників забитих тварин. Встановлено, що дворазова щотижнева трансвагінальна пункція антральних фолікулів яєчників живих донорів, не оброблених гормонально, не зменшує при наступній аспірації кількості придатних для пункції фолікулів протягом 2 місяців, проте покращує якість ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) через 3-4 взяття після початку досліду внаслідок відсутності формування жовтого тіла. Виявлена індивідуальна різниця між донорами за середньою кількістю помітних і аспірованих фолікулів, кількістю і якістю ОКК, кількістю отриманих in vitro 2-6-клітинних зародків та бластоцист. Отримані тільності після пересадки морул-бластоцист, одержаних in vitro, в тому числі з використанням OPU-ооцитів. Вперше у cільськогосподарських тварин на коровах доведена можливість активації ооцитів до партеногенезу за умовою інгібування виділення першого полярного тіла та фізіологічного дозрівання ооцитів - отримані парте-ногенони були здатні до розвитку in vitro принаймні до 16-клітинної стадії. Доведена можливість визначення статі ембріона великої рогатої худоби цитогенетичним методом з використанням однієї половинки або четвертинки. Удосконалена методика клонування зародків кроля та великої рогатої худоби методом пересадки ядер в енуклейовані ооцити. Встановлено, що злиття пар "оопласт-бластомер" під дією електричного струму може відбуватись при застосуванні постійного струму без використання змінного, реконструйовані зародки здатні до розвитку in vitro до стадії бластоцисти.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблений спосіб комплексної оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв в умовах in vitro для дослідів по одержанню ембріонів великої рогатої худоби поза організмом може бути використаний при відборі бугаїв для штучного осіменіння. Отримання і пересадка половинок ембріонів впроваджені в практику трансплантації ембріонів, що дозволяє істотно збільшити кількість телят від донорів ембріонів. Показана можливість отримання тільностей після пересадки реципієнтам ембріонів, одержаних in vitro, в тому числі з використанням ооцитів, вилучених з яєчників живих донорів.
Видано рекомендації щодо отримання якісних половинок ембріонів великої рогатої худоби, визначення у них статевих хромосом та трансплантації реципієнтам ("Методические рекомендации по микрохирургическому делению эмбрионов крупного рогатого скота", Киев-1991); "Рекомендації по одержанню ембріонів великої рогатої худоби in vitro", Київ-1998, які були розглянуті, схвалені і рекомендовані до друку науково-технічною радою Національного об'єднання по племінній справі в тваринництві; "Програма розвитку конкурентноспроможного тваринництва до 2005 року. I. Підпрограма "Молочне скотарство", Київ-1997, яка була розглянута і схвалена на спільному засіданні секції виробництва і переробки продукції тваринництва науково-технічної ради Мінсільгосппроду України і УААН.
Особистий внесок здобувача. Участь автора в одержанні наукових результатів, викладених в дисертації, становить близько 92%, а саме: проведено огляд і аналіз першоджерел літератури; зроблені теоретичні обгрунтування щодо клонування у ссавців; розроблена схема і методика виконання досліджень; з використанням сучасних методів проведені всі експериментальні дослідження, документовані мікрофотографіями; виконано статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу; опубліковані матеріали досліджень. Окремі фрагменти робіт були виконані спільно з іншими виконавцями. Досліди по вилученню ооцитів з яєчників живих ко-рів та телиць методом OPU та частина дослідів по пересадці ядер зарод-ків проводилась спільно із співробітниками Відділу фізіології розмно-ження під керівництвом проф. 3. Сморонга в Інституті зоотехнії (Польща).
Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати досліджень доповідались та обговорювались на: засіданнях вченої ради інституту розведення і генетики тварин УААН (1987-1998 рр.); координаційних нарадах в Інституті розведення і генетики тварин УААН (1991-1998 рр.); на міжнародних та українських наукових і науково-практ. конференціях і нарадах (1988-1998 рр.), в тому числі науковій конференції "Biotechnologia rozrodu zwierzat gospodarskich - stan badan oraz mozliwosci praktycznego zastosowania", Krakow (Польща), 1997; II міжн. конференції "Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях", Одеса, 1998.
Публікації. Результати досліджень опубліковані в 1 монографії, 24 статтях в наукових журналах. 4 збірниках наукових праць, 36 матеріалах і тезах конференцій, 1 методичних рекомендаціях і 1 рекомендаціях. Всього опубліковано 67 праць, з них 20 без співавторів.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, 4 розділів, висновків та практичних пропозицій. Обсяг дисертації - 357 сторінок, в тому числі 40 ілюстрацій і 33 таблиці, список використаних літературних джерел охоплює 494 найменування.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Загальна схема досліджень наведена на рис. 1.
Суперовуляцію у самок золотистого хом’ячка (Mesokricetus auratus), мишей-гібридів СВ6 F1 (BALB/c х C57Bl/6) і кролів породи новозеландський білий викликали ін'єкцією тваринам ГСЖК та лХГ. Після обробки лХГ самиць мишей і кролів спаровували з самцями.
Ооцити корів та телиць отримували від тварин, забитих на м'ясокомбінаті і культивували в середовищі 199, яке містило 10-20% інактивованої фетальної сироватки теляти, ФСГ, лХГ, естрадіолу-17β і антибіотики на протязі 22-24 годин при температурі +38,5oС. Частину ооцитів корів після дозрівання зберігали у 1,5 М хлориді магнію при +5oС.
Рис.1. Загальна схема досліджень
Спільну інкубацію ооцитів корів і хом’ячка із капацитованими поза організмом сперматозоїдами бугая проводили в модифікованому середовищі Тіроде. Капацитацію сперматозоїдів викликали за допомогою розчину гепарину (200 ОД/мл, 15 хв.).
Для одержання препаратів метафазних хромосом сперматозоїдів бугая осіменені яйцеклітини хом'ячка культивували протягом 8 годин у середовищі Бігерса, яке містило 0,5 мкг/мл колцеміду. В іншій серії експериментів метафазні хромосоми сперміїв бугая отримували після осіменіння поза організмом ооцитів корів, у яких попередньо індукували блокування ядерного дозрівання.
Нехірургічну трансвагінальну пункцію вмісту антральних фолікулів яєчників живих корів та телиць здійснювали під контролем ультразвуку (ovum pick-up - OPU) двічі на тиждень (через 3-4 дні) протягом 2 місяців з використанням спеціального обладнання - ультразвукового сканера з піхвовим трансдусером (тип Picker, модель CS 9100 з частотою 6,5 МГц), поєднаним з аспіруючим пристроєм (модель Mariensee), розташованим у вагінальному зонді з насадкою для пункції, а також вакуумної помпи. Гормональну обробку тварин не проводили.
Кріоконсервування 7-8-денних бластоцист великої рогатої худоби, одержаних поза організмом, методом вітрифікації здійснювали у розчині ЕФС (40% етиленгліколю, 18% фіколу 70 і 0,3 М сахарози в PBS з 20% фетальної сироватки теляти), описаному М.Касаї для вітрифікації ембріонів миші [Kasai M. e.a., 1990].
Партеногенетичний розвиток ооцитів корів індукували 7%-ним розчином етанолу 7 хв. в PBS з 20% фетальної сироватки теляти при 37,5oС. В деяких експериментах в середовище культивування ооцитів додавали цитохалазин D в концентрації 1 μг/мл.
Зародки мишей культивували поза організмом протягом 90 годин у середовищі М16 при 37oС, зародків кролів - у середовищі Менезо В2 з наступним додаванням 20% фетальної сироватки теляти на стадії морули при 38,5oС, зародки великої рогатої худоби - при 38,5oС в середовищі 199 з фетальною сироваткою теляти на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів. Для одержання препаратів метафазних хромосом ембріони великої рогатої худоби, одержані поза організмом, культивували протягом 5 годин в середовищі з 0,05 мкг/мл колцеміду.
Скляні мікроінструменти виготовляли на мікрокузні типу "МК", металеві ножі - з кромки самих тонких бритвених лез.
В дослідженнях по клонуванню ембріонів методом пересадки ядер енуклеацію ооцитів, перенос бластомерів у перивітеліновий простір яйцеклітин та пересадку ядер в цитопласти здійснювали за методом, описаним раніше [Chesne P. e.a., 1993] з деякими модифікаціями. Злиття пар "оопласт-бластомер" здійснювали в неелектролітному 0, З М розчині манітолу, який містив 0,1 мМ MgSO4 та 0,05 мМ СаСl2 в скляній камері з відстанню між паралельними електродами 500 μм. Для підрахунку кількості ядер та аналізу їх стану деякі реконструйовані ембріони фарбували розчином барвника Хекст 33342 (5 μг/мл) або готували сухоповітряні препарати зародків з наступним фарбуванням 2%-ним розчином барвника Гімза.
З метою вивчення динаміки мейотичних та мітотичних перетворень хроматину, виявлення та ідентифікації типів хромосомних порушень, оцінки зародків готували сухоповітряні препарати за методом А.К.Тарковського [Tarkowski А. К., І966].
Матеріал документували мікрофотографіями. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критеріїв Ст'юдента та χ2-квадрат [Лакин Г.Ф., 1990], а також прикладних програм для мікрокалькулятора "Електроніка МК-52'' [Полупан Ю.П., 1988].
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Одержання ембріонів великої рогатої худоби з дозрілих
поза організмом та запліднених in vitro ооцитів корів
Для розробки методів клонування у великої рогатої худоби дуже важ-ливим є одержання біологічно повноцінних ембріонів і дозрілих ооцитів.
З метою відбору бугаїв для отримання зародків великої рогатої худоби поза організмом нами проводились експерименти по визначенню ефективності оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв за допомогою гетеро- і гомологічного тестів. Дослідження показали відсутність вірогідної різниці за частотою пенетрації яйцеклітин золотистого хом'ячка сперматозоїдами обох бугаїв протягом 5 годин, проте, була виявлена різниця між бугаями при пенетрації гомологічної прозорої оболонки ооцитів, які зберігались у сольовому розчині (рис. 2), що відповідала різниці за частотою запліднення і дроблення ооцитів корів.
Рис.2. Порівняння запліднювальної здатності сперматозоїдів двох
бугаїв in vitro. По осі абсцис - кількість осіменених
яйцеклітин (b:c - P<0,001; c:d - P<0,05)
Ми вважаємо, що комплексний метод дозволяє вірогідніше оцінити запліднювальну здатність сперматозоїдів бугаїв в умовах in vitro, тому що гетерологічна пенетрація та тест на пенетрацію гомологічної прозорої оболонки (проникнення сперматозоїдів бугаїв в ооплазму ооцитів корів, які зберігались у 1,5 М хлориді магнію не відбувалося) дозволяють оцінити різні функції сперматозоїдів, такі як здатність до проходження капацитації і акросомної реакції, злиття з оолемою, пенетрації прозорої оболонки, деконденсації хроматину в ооплазмі яйцеклітин, що дозріли in vivo.
Важливе значення при відборі бугаїв для дослідів по одержанню ембріонів великої рогатої худоби поза організмом має також показник ефективності перетворення хроматину сперміїв в метафазні хромосоми; до того ж розробка способів отримання метафазних хромосом сперматозоїдів може бути використана як додатковий тест на носійство хромосомних порушень, які виникають у мейозі.
Нами доведено, що сперматозоїди бугая можуть пенетрувати in vitro променистий вінець, прозору оболонку та оолему ооцитів корів, мейотичне дозрівання яких було заблоковано на стадії диплотени-діакінезу (табл.1), при цьому спостерігається формування метафазних хромосом сперміїв (без попереднього формування чоловічого пронуклеуса) з тією ж ефективністю, що і при осіменінні поза організмом дозрілих in vivo яйцеклітин хом'ячка.
Таблиця 1
Частота формування метафазних хромосом сперматозоїдів бугая в
яйцеклітинах золотистого хом’ячка та незрілих ооцитах корів
b:c - P < 0,05
У наших дослідженнях не виявлено вірогідного впливу виготовленої нами еструсної сироватки крові корів на експансію кумулюсу (56/65, 86,2%), частоту дозрівання (97/111, 87,4%), рівень хромосомних порушень на метафазі II (11/97, 11,3%) і частоту запліднення ооцитів корів in vitro (76/178, 42,7%) порівняно з фетальною сироваткою теляти (54/67, 80,6%; 72/86, 83,7%; 8/72, 11,1%; 71/186, 38,2% відповідно). Проте, подальший розвиток зигот залежав від типу сироватки, яка використовувалась при культивуванні ооцитів. При дозріванні ооцитів в середовищі з додаванням еструсної сироватки крові корів кількість запліднених клітин збільшилась на 4,5%, вихід ембріонів - на 8,1% (48/178, 27,0% і 33/186, 17,7% відповідно). Очевидно, саме еструсна сироватка крові корів містить необхідні для розвитку ооцитів стероїди, гормони пептидної природи та фактори росту, які сприяють повноцінному цитоплазматичному дозріванню.
Додаткові можливості при одержанні ембріонів відкриваються з використанням в дослідах по заплідненню in vitro методів мікроманіпуляцій. Результати досліджень показали, що розсічення невеликої ділянки (10-20 μм) прозорої оболонки (ЧРО) значно збільшує частоту запліднення ооцитів спермою з дещо зниженою концентрацією сперматозоїдів (1 млн. Сп/мл) (Р < 0,001) і не впливає негативно на подальший розвиток зигот до ранніх стадій дроблення, - при осіменінні інтактних ооцитів (п = 212) відсоток запліднення становив 24,5, тоді як частота запліднення ЧРО-яйцеклітин (n = 172) була вірогідно вищою - 48,9%. Кількість осіменених ооцитів, які розвились до ранніх стадій дроблення в дослідній групі була більшою, ніж в контрольній - 23,3 і 17% відповідно. Важливим є той факт, що часткове розсічення оболонки яйцеклітин не підвищувало кількості партеногенетичних зародків з одним пронуклеусом (2,3%) і рівня поліспермного запліднення (2,3%) у порівнянні із даними контрольної групи (9,4 і 1,9% відповідно). Наступні експерименти показали, що ЧРО ооцитів перед їх заплідненням не перешкоджало подальшому розвитку 2-4-клітинних зародків до стадії ранньої і пізньої морули, однак розвитку до стадії бластоцисти не спостерігалось.
Для одержання in vitro якісних морул-бластоцист велике значення мають умови розвитку ембріонів в культурі. Культивування одноклітинних зародків в середовищі на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів, яєчник яких містив новоутворене жовте тіло (ЕКЯЖТ), і у кондиційованому на моношарі ЕКЯЖТ середовищі дозволило одержати більше морфологічно нормальних пізніх морул-бластоцист, ніж на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів, яєчник яких мав ознаки недавньої овуляції (ЕКЯО), - відсоток розвитку зигот до морули-бластоцисти становив 27,0; 28,8 і 16,0% (P < 0,05) відповідно.
Наші дослідження з вивчення динаміки розвитку ембріонів великої рогатої худоби від стадії зиготи до бластоцисти in vitro виявили, що між стадією розвитку, якої досягають зародки через 24 години після запліднення ооцитів in vitro (через 42 години від початку осіменіння), і їх подальшим розвитком до пізньої морули-бластоцисти є певний зв'язок .
На нашу думку, отримання ембріонів на різних стадіях (на 2-клітинній знаходилось 51,2%, n = 44; на 3-клітинній - 3,5%, n =3 і на 4-клітинній - 45,3% ембріонів, n = 39) через 24 години культивування після запліднення, а також різна здатність зародків до наступного ділення дроблення (43,2%, 19/44; 33,3%, 1/3 і 100%, 39/39) та до розвитку до стадії пізньої морули-бластоцисти (22,7%, 10/44 і 69,2%, 27/39; P < 0,001) можуть мати значення для відбору якісних ембріонів, а також їх диференціювання за статтю.
Дослідження впливу клітин гранульози на дозрівання, запліднення та подальший розвиток яйцеклітин корів поза організмом показали, що хоча ядерне дозрівання ооцитів (відсоток клітин, що дозріли до метафази II, та кількість ооцитів з хромосомними порушеннями) не залежало від наявності (+) або відсутності (-) клітин гранульози, їх додавання (3-5 х 106 клітин/мл) сприяло підвищенню здатності яйцеклітин до формування чоловічих пронуклеусів на 33,6-51,6%, підвищенню дроблення зигот на 38,4-60,6% та розвитку ембріонів до стадії бластоцисти - на 15,1-36,1% (табл. 2). Здатність клітин гранульози забезпечувати повноцінніше дозрівання ооцитів, очевидно, зв'язана з їх стероїдогенною активністю, синтезом простагландинів і деяких білків (останні впливають на експансію кумулюсу при дозріванні ооцитів) [Grasselli F. e.a., 1994; Mattioli M., 1996].
Таблиця 2
Вплив клітин гранульози в середовищі культивування ооцитів на
запліднення та подальший розвиток яйцеклітин корів in vitro
a:b, b:c, d:e - P < 0,001; a:d - P < 0,01
Відбір рухливих сперматозоїдів у градієнтах перколу вірогідно збільшив кількість запліднених яйцеклітин у порівнянні з їх відбором методом swim-up в групі О1, в дослідній групі О2 було отримано значно більше ембріонів, що дробились, а також бластоцист, ніж в дослідній групі О1. Культивування зигот на моношарі ЕКЯЖТ в середовищі Менезо В2 в наших дослідженнях незначно збільшувало вихід 2-6-клітинних ембріонів від запліднених яйцеклітин (95,7% проти 89,0%) у порівнянні з культивуванням одноклітинних зародків в середовищі 199 (О1), але подальше культивування ембріонів виявило, що використання середовища Менезо В2 для культивування зародків сприяє значно кращому розвиткові зародків до стадії бластоцисти, ніж середовище 199 - 48,9 і 32,3% зигот відповідно досягли in vitro стадії бластоцисти (P < 0,05).
Цитогенетичний аналіз препаратів одержаних in vitro ембріонів, які розвивались нормально, виявив наявність морфологічно нормальних ядер, які містили диплоїдний набір хромосом. Наші спостереження показали, що на 2-бластомерній стадії ядра ембріонів великої рогатої худоби мають організацію, подібну до організації хроматину у пронуклеусів, проте, вже у ембріонів 8-клітинної стадії в ядрах спостерігаються типові ядерця, і вони мають структуру, подібну до ядер пізніх морул та бластоцист.
Після попарної трансплантації 5 реципієнтам 10 пізніх морул-бластоцист, отриманих in vitro, була зареєстрована одна тільність.
Великі можливості використання ембріонів великої рогатої худоби, отриманих поза організмом, відкриваються з розробкою способів вилучення ооцитів з яєчників живих донорів. Досліди показали, що використане нами обладнання дозволяє успішно візуалізувати на екрані монітора та аспірувати антральні фолікули діаметром від 2 мм і більше (в наших дослідженнях не використовували гормональної обробки тварин).
Виявлено, що морфологічні показники ооцитів, отриманих з яєчників живих донорів методом OPU, значно відрізняються від ооцитів, вилучених з ізольованих яєчників забитих корів та телиць - вони оточені меншою кількістю клітин кумулюсу, і у них спостерігається негомогенність ооплазми, яка може у подальшому зникати.
Таблиця 3
Вплив аспіраційного тиску на кількість і якість ооцитів,
отриманих методом OPU (кількість взяттів - 12)
a:b - P < 0,01
Як показали дослідження, хоч при підвищенні тиску від 0,1 до 0,15 та 0,2 Б і спостерігається збільшення кількості вилучених з яєчників живих донорів ооцитів, ця різниця статистичне невірогідна (табл. 3).
Але підвищення тиску до 0,2 Б супроводжувалось значним погіршенням якості ооцитів. Отже, для вилучення ооцитів з яєчників живих корів та телиць доцільно використовувати аспіраційний тиск 0,1-0,15 Б.
Дослідження, проведені протягом 2 місяців, показали, що пункція фолікулів двічі на тиждень не зменшує при наступній аспірації кількості придатних для пункції фолікулів, середня кількість пункційованих фолікулів за перші 6 взяттів не відрізнялась від останніх 6 взяттів (5,2 ± 0,56 і 5,9 ± 0,26 відповідно; P > 0,05). Більше того, кількість якісних ооцит-кумулюсних комплексів в наших дослідах через 3-4 взяття від початку використання тварин збільшувалась. Це пов'язано з тим, що дворазове вилучення ооцитів на тиждень з інтервалом 3-4 дні перешкоджає відбору та розвитку домінуючого фолікула, внаслідок того відсутня овуляція, циклічність припиняється [Gibbons J.R. e.a., 1994; Kruip T.A.M., 1994].
Наші експерименти показали, що між донорами-телицями існує індивідуальна різниця у середній кількості помітних і аспірованих фолікулів, кількості вилучених ооцитів, в тому числі придатних для культивування, 2-6-клітинних зародків та бластоцист, отриманих з цих ооцитів (табл. 4).Частота дроблення запліднених in vitro OPU-яйцеклітин (83/113, 73,5%) та розвитку таких зародків поза організмом до стадії бластоцисти (18/106, 17,0%) була менше, ніж у контролі (ооцити, вилучені з ізольованих яєчників забитих тварин) - 78/95, 82,1% і 25/95, 26,3% відповідно, що відповідає даним інших авторів [Bungartz L. e.a., 1995; Palma G.A. e.a., 1996; Rath D., 1993; Smorag Z. e.a., 1997]. Однак, в наших дослідах ця різниця була невірогідною і одержані нами показники були вищі, ніж у інших дослідників.
Безперечно, одним з вагомих чинників гіршого розвитку запліднених in vitro OPU-яйцеклітин є відсутність у них частини кумулюсу, тому що у корів клітини кумулюсу мають велике значення не тільки для ядерного, але і для цитоплазматичного дозрівання, яке необхідно для формування чоловічого пронуклеуса і раннього ембріонального розвитку [Konishi M. e.a., 1996]. Ми вважаємо, що іншим чинником гіршого розвитку яйцеклітин та ембріонів є те, що OPU-ооцити дозрівають та запліднюються, а в подальшому і розвиваються окремо або в малих групах, тоді як ооцити, вилучені з яєчників забитих тварин і отримані з них зародки культивуються у великих групах, тобто пов'язано з недостатньою кількістю аутокринних і паракринних факторів росту.
Таблиця 4
Вплив донора на кількість отриманих OPU-ооцитів та частоту формування ембріонів in vitro
при застосуванні тиску 0,1 та 0,2 Б
е - в одному досліді культивування ембріонів до стадії бластоцисти не здійснювали
У наших дослідженнях повноцінне дозрівання OPU-ооцитів досягалось тільки у присутності додаткової кількості гранульози, яку отримували як з фолікулів живих донорів (разом з ооцитами), так і з фолікулів яєчників забитих тварин.
Після трансплантації 10 телицям-реципієнтам 10 пізніх морул-бластоцист, отриманих in vitro з використанням OPU-ооцитів, у двох телиць була зареєстрована тільність. Протягом 2-місячного періоду дослідів у 6 постійних донорів ми не спостерігали негативного впливу трансвагінальної аспірації вмісту фолікулів на стан яєчників, матки та піхви тварин, не зареєстровано захворювань статевого апарату, що відповідає даним інших дослідників [Bucher P. e.a., 1996; Kruip T.A.M. e.a., 1994].
Ефективність вітрифікації бластоцист великої рогатої худоби, отриманих in vitro, в розчині ЕФС при 1-ступеневій еквілібрації залежала від стадії їх розвитку - для 7-денних бластоцист мала місце тенденція до підвищення частоти виживаності (реекспансії порожнини після вітрифікації та відтавання) у порівнянні з 8-денними (рис. 3), при цьому лише після 1,5-хвилинного перебування в ЕФС-розчині 7-денні бластоцисти розвинулись до стадії вилуплення з прозорої оболонки.
Рис. 3. Вплив тривалості еквілібрації на виживаність 7- і 8- денних
бластоцист великої рогатої худоби, одержаних
поза організмом, після їх вітрифікації
Двоступенева еквілібрація 8-денних бластоцист, таких, що розширюються, і розширених покращувала виживаність ембріонів у порівнянні з 1-ступеневою еквілібрацією - після вітрифікації у 66,7% бластоцист спостерігалась реекспансія порожнини і у 33,3% - вилуплення з оболонки. Очевидно, кращою є 2-ступенева еквілібрація, що забезпечує достатнє проникнення кріопротектора у бластоцель і запобігає утворенню внутрішньоклітинного льоду, а наступне короткочасне перебування у розчині ЕФС знижує токсичний вплив кріопротектора.
Цитогенетичний аналіз партеногенетичного розвитку
ооцитів корів in vitro
Партеногенетична активація ооцитів є суттєвою частиною технології пересадки ядер та мікрохірургічного запліднення in vitro у ссавців [Goto K e.a., 1994; Takahashi S. e.a., 1996].
Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів виявив, що в наших умовах оптимальною тривалістю дозрівання ооцитів корів поза організмом для їх активації до партеногенезу з врахуванням фактора хромосомних порушень (дегенерація і деспіралізація хромосом, блок анафази I, часткове нерозходження бівалентів на уніваленти) виявилось 30-годинне культивування у порівнянні з культивуванням протягом 24, 36 і 42 годин. В наших дослідах партеногенетична активація ооцитів корів була успішно індукована етанолом як через 24 години культивування, так і після наступного 6-годинного культивування (старіння), тобто через 30 годин дозрівання. На відміну від даних інших авторів [Minamihashi A. e.a., 1993] нами не було відмічено вірогідної різниці між цими двома групами за частотою активації ооцитів (49/89, 55,1% і 74/107, 69,2% відповідно), але індукція ооцитів корів етанолом після 30-годинного дозрівання дозволила отримати значно більше 2-4-клітинних партеногенонів (55/107, 51,4%), ніж обробка клітин через 24 години (13/89, 14,6%). Подальше культивування партеногенонів приводило до їх розвитку до стадії 8-16 бластомерів (18/107, 16,8% і 6/89, 6,7% відповідно).
Цитогенетичний аналіз партеногенетичних ембріонів виявив наяв-ність інтерфазних і профазних морфологічно нормальних ядер бластомерів, метафазні пластинки зародків містили як гаплоїдний, так і диплоїдний набір хромосом. Більшість 2-клітинних зародків мала перше полярне тільце.
Особливий інтерес викликають експерименти по активації ооцитів ссавців до завершення першого (редукційного) ділення мейозу, тому що це може "наблизити вирішення питання про амейотичний партеногенез ссавців" [Дыбан А.П., 1988]. В наших експериментах індукцію незрілих ооцитів корів проводили з використанням підходів, запропонованих Я.Кубяком для активації тетраплоїдних мишачих ооцитів - одержані автором амейотичні партеногенетичні бластоцисти були генетично ідентичні одна одній та їхній матері [Kubiak J. e.a., 1991].
Дослідження проводили на ооцитах корів 3 груп в залежності від тривалості обробки цитохалазином D (табл. 5). Перед обробкою етанолом у більшої частини цих ооцитів не було виявлено полярних тілець (Д1 і Д2), решта ооцитів містили перше полярне тіло (Д3). Експерименти показали, що активація ооцитів при меншій тривалості дії цитохалазину D (група Д2) була значно успішнішою, при цьому, як показав цитогенетичний аналіз препаратів яйцеклітин 57,1% (12/21) ооцитів безпосередньо перед застосуванням етанолу були на стадії так званого "блоку анафази І" (тобто вони мали хромосомний набір, який складався з 60 унівалентів).
Таблиця 5
Активація ооцитів корів етанолом після інгібування
виділення першого полярного тілаa
a - ооцити дозрівали in vitro протягом 24 годин, останні 4 години - у
відсутності цитохалазину
Отже, додавання до середовища дозрівання ооцитів корів цитохалазину D після їх 15-годинного дозрівання in vitro, тобто приблизно за 3 години до редукційного ділення мейозу у більшості ооцитів, достатнє для пригнічення виділення першого полярного тільця. Після обробки етанолом 60,7% яйцеклітин в цій групі виявились активованими - перебували на стадії телофази II мейозу з двома диплоїдними наборами хроматид або містили один чи два жіночі пронуклеуси. Аналіз сухоповітряних препаратів 2-16-клітинних ембріонів показав, що бластомери партеногенетичних зародків мали ядра, кількість яких відповідала кількості бластомерів, а ядра містили ядерця.
Слід відмітити, що оброблені цитохалазином ооцити, які виділили перше полярне тільце перед обробкою етанолом не мали ознак активації.
Таким чином, нами вперше була показана можливість партеногенетичного розвитку ооцитів сільськогосподарських тварин (корів) за умовою інгібування виділення першого полярного тільця та активації ооцитів на стадії дозрівання, яка за часовими параметрами відповідає фізіологічній зрілості ооцита після 24 годин культивування, що є дуже важливим для наступного розвитку.
Відсутність першого полярного тільця на той час, коли в нормі у ооцитів корів вже відбувається екваційне ділення мейозу після їх активації сперматозоїдом або іншим фактором (через 24 години дозрівання), наявність тетраплоїдних ооцитів на стадії блоку анафази I з морфологічно нормальними хромосомами в обох наборах, ооцитів з двома диплоїдними наборами хроматид дозволяє припустити, що принаймні деякі ооцити в наших дослідах розвивались за амейотичним шляхом.
Створення химерних ембріонів та перспективи
їх використання в клонуванні зародків
Експерименти показали (табл.6), що після звільнення від прозорої оболонки агрегації пізніх морул великої рогатої худоби, отриманих in vivo, та половинок пізніх морул можна успішно досягти механічним притисненням їх один до одного в розчині фітогемаглютинину, при цьому частота формування агрегатів між парами цілих ембріонів та парами якісних половинок вірогідно не відрізнялась. Більше ніж у 2 рази ефективнішим виявився спосіб отримання агрегатів введенням двох половинок в пусту прозору оболонку без використання ФГА, що забезпечує щільні контакти та їх збереження і адгезію між ембріонами.
Таблиця 6
Частота формування химерних ембріонів
a:b - P < 0,001
Через 24 години культивування in vitro агрегати розвивались до стадії бластоцисти, при цьому потенція до розвитку in vitro агрегатів в трьох групах досліду була подібною, що свідчить про відсутність негативного впливу ФГА та методів поділу ембріонів на життєздатність агрегатів.
Після трансплантації 4 химерних бластоцист, отриманих агрегацією цілих ембріонів, 4 телицям-реципієнтам, одержано одне теля, але дослідження з метою ідентифікації химеризму у теляти не проводились.
На нашу думку, химерні ембріони мають велике значення для вивчення можливості розробки методів клонування дорослих тварин шляхом партеногенезу. Класичні досліди М. Сурані із співавторами [Surani M.A.H. e.a., 1987], виконані на мишах, виявили, що для завершення ембріогенезу клітина повинна мати і материнські і батьківські хромосоми. Проте, для мишей [Otani H. e.a., 1987; Pinyopummin A. e.a., 1995] і великої рогатої худоби [Boediono A., Suzuki T., 1996] доведено, що пересадка реципієнтам химерних ембріонів, які складаються з клітин звичайних (отриманих внаслідок запліднення) та диплоїдних мейотичних партеногенетичних зародків, приводить до народження живих потемків, органи і тканини яких походили як від звичайних, так і від партеногенетичних бластомерів.
Виходячи з ролі материнських і батьківських генів у формуванні позазародкових тканин і власно ембріона, геномного імпринтингу, маловивченої здатності химер до підтримання розвитку зародків, важливого значення набуває вивчення можливості клонування тварин-донорів ооцитів отриманням химерних зародків, які складаються з клітин звичайних і амейотичних партеногенетичних ембріонів. На нашу думку, такий химерний ембріон можна отримати методами мікроманіпуляцій замінюючи клітини ВКМ звичайної бластоцисти на ВКМ бластоцисти партеногенетичного походження, тобто химерний зародок буде складатись з клітин ТЕ звичайної бластоцисти і ВКМ бластоцисти-амейотичного партеногенона. Присутність батьківських хромосом в трофектодерме химерної бластоцисти, очевидно, забезпечить імплантацію і формування повноцінних позазародкових тканин, в тому числі плаценти, а гени партеногенона - розвиток власне ембріонів. Генотип такого партеногенетичного ембріона буде відрізнятись від генотипу матері лише внаслідок мінливості, обумовленої мейотичним кросинговером.
Відомо, що тетраплоїдні клітини мишей приймають участь у формуванні тканин плаценти, яка може майже повністю складатись з тетраплоїдних клітин, і поступово елімінуються з ембріональних тканин [Nagy A. e.a., 1990, 1993; Modlinski J.A., Karasiewicz J., 1997]. На нашу думку, виходячи з ролі тетраплоїдних клітин у розвитку ембріонів мишей, іншим підходом до клонування звичайних (одержаних після запліднення) або амейотичних партеногенетичних 8-64-клітинних ембріонів великої рогатої худоби може стати агрегація їхніх бластомерів з звичайними тетраплоїдними ембріонами.
Нами вивчено можливість отримання тетраплоїдних зародків мишей та кролів (як модельних об'єктів) методом злиття бластомерів 2-клітинних зародків між собою під впливом електричного імпульсу та проаналізована їхня здатність до розвитку поза організмом. Встановлено, що ефективність злиття бластомері залежить від параметрів змінного та постійного струму. Для мишей оптимальним параметром електрозлиття виявились 0,6-0,8 МГц, 8 В, 6 с (змінний струм) та 50 В, 500 мкс, 1 імпульс (постійний струм), при яких всі 32 оброблені двоклітинні зародки сформували інтактні 1-клітинні зародки; кількість ембріонів, що розвились до стадій дроблення, морули-бластоцисти та бластоцисти складала 100, 100 і 90,6% відповідно, дегенерованих зародків не спостерігалось. Для кролів найкращі результати були отримані при застосуванні 110 В, 30 мкс, 2 імпульсів - 26/35 (74,3%) зародків сформували інтактні 1-клітинні зародки і 22/35 (62,9%) зародків роздробилось. У контролі (n зигот = 36) на цей час були також отримані 4-бластомерні ембріони (n = 36, P < 0,001). Очевидно, ця різниця у порівнянні з контролем є наслідком вибору не оптимальних параметрів електричної обробки, хоч і не можна виключити міжвидової різниці за отриманням та здатністю&n | 
