|
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН
ГУНТІК ЛЮДМИЛА МИХАЙЛІВНА
УДК 636.22/28.082.4532
УДОСКОНАЛЕННЯ СПОСОБІВ КРІОКОНСЕРВАЦІЇ СПЕРМИ БУГАЇВ ШЛЯХОМ ВИЗНАЧЕННЯ ОПТИМАЛЬНОГО СПІВВІДНОШЕННЯ КОМПОНЕНТІВ РОЗРІДЖУВАЧІВ
Спеціальність 06.02.01 – розведення та селекція тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата
сільськогосподарських наук
Чубинське Київської області - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин УААН
Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор Сірацький
Йосип Зенонович, завідувач відділу відтворення Інституту
розведення і генетики тварин УААН
Офіційні опоненти:
- доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Петренко Іван Петрович, головний науковий співробітник лабораторії розведення червоно-рябої худоби і генофонду порід Інституту розведення і генетики тварин УААН;
- кандидат біологічних наук, доцент Журавель Михайло Петрович, доцент кафедри розведення сільськогосподарських тварин ім. М.А. Кравченка Національного аграрного університету
Провідна установа: Вінницький державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, кафедра розведення сільськогосподарських тварин і зоогігієни
Захист відбудеться “11” грудня 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська область, Бориспільський район,
с. Чубинське, вул. Погребняка, 1.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН.
Автореферат розісланий “ 6 ” листопада 2003 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Ю.В. Мільченко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Серед багатьох факторів, що забезпечують інтенсивне відтворення поголів‘я великої рогатої худоби, важлива роль належить якості сперми, застосуванню досконалих розріджувачів, які сприяють збереженню життєздатності сперміїв після їх технологічної обробки.
Для розбавлення сперми бугаїв і її наступного заморожування у гранулах і соломинках на більшості спеціалізованих підприємств України та інших країн СНД з 1968 року і до цього часу використовують лактозо-гліцерино-жовтковий розріджувач (ЛГЖ). Із багатьох спеціальних літературних джерел відомо, що при використанні цього розріджувача значна частина заморожено-розмороженої сперми має невисоку якість (Н.И. Мунтаниолов, В.В. Николаев, 1983; М.Г. Ковалев, Т.В. Цеханович, Г.М. Дробышевская, 1985; А.П. Кругляк, 1986). При обробці кращих за рухливістю і концентрацією сперміїв еякулятів отримують гіршу якість сперми після заморожування-розморожування (В.М. Кушнір, 1995; В.М. Кушнір, К.І. Пасічна, Л.М. Гунтік, 1997).
Тому давно вже виникла необхідність покращити якість заморожено-розмороженої сперми бугаїв у гранулах шляхом використання більш ефективних розріджувачів сперми.
Одним із таких шляхів є врахування осмоляльної концентрації середовища, що утворюється після розбавлення еякулятів розріджувачами з гліцерином і співвідношення в ньому осмотично активних речовин (J.Lovelock, 1953, 1957; І.В. Смирнов, 1951-1975; Ф.І. Осташко, 1963-1980; П.Пакенас, 1972, 1993).
Крок у цьому напрямку зроблений В.М. Кушніром (1974, 1995). Він теоретично обґрунтував і експериментально визначив певне співвідношення між кількістю гліцерину в складі розріджувача, з одного боку, і кількістю інших осмотично активних речовин, з другого боку. На основі цього були запропоновані нові, досить ефективні, розріджувачі і способи розрідження еякулятів. Однак не визначались оптимальні співвідношення вуглеводів і солей в складі розріджувачів при певному вмісті в них гліцерину, в зв‘язку з чим тема даної роботи є актуальною.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі відтворення тварин Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук за завданням “Розробити на основі осмотично-дифузійної теорії розріджувачі і способи кріоконсервації сперми бугаїв”, що входило до теми “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів в селекції сільськогосподарських тварин за 1996-2000 роки” (№ держреєстрації 0196U016325).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було удосконалити спосіб кріоконсервації сперми бугаїв у відкритих гранулах шляхом розроблення нового лактозо-цитратно-гліцерино-жовткового розріджувача (ЛЦГЖ) і на цій основі досягти поліпшення якісних показників заморожено-відтаяної сперми та запліднюючої здатності сперміїв.
Для досягнення поставленої мети ставились такі завдання:
- порівняти якісні показники заморожено-розмороженої сперми при використанні ЛГЖ і УЛГЖ (удосконаленого ЛГЖ);
- розробити новий ЛЦГЖ шляхом встановлення оптимального співвідношення для життєздатності сперміїв лактози і цитрату натрію;
- підібрати для розробленого нового розріджувача кращий коректуючий розріджувач;
- визначити оптимальні режими розрідження, еквілібрації, заморожування і розморожування сперми;
- дослідити якісні показники заморожено-розмороженої сперми за рекомендованим і апробованим способами її обробки;
- впровадити рекомендований спосіб обробки сперми у виробництво.
Об’єкт дослідження – сперма бугаїв-плідників, розбавлена і заморожено-розморожена, розріджувачі і їх компоненти, прийоми обробки сперми (спосіб розрідження, тривалість еквілібрації, температура заморожування і розморожування).
Предмет дослідження – співвідношення лактози і цитрату натрію в складі розріджувачів та його вплив на якість заморожено-розмороженої сперми.
Методи дослідження: фізіологічні – визначення об‘єму еякуляту, концентрації сперміїв в 1 мл, рухливості і виживаності сперміїв; морфологічні – підрахунок живих і мертвих сперміїв, нормальних і патологічних; біохімічні – визначення осмоляльної концентрації та осмотичного тиску розріджувачів і розчинів їх компонентів; технологічні – визначення оптимальних режимів обробки сперми; зоотехнічні – оцінка запліднюючої здатності сперміїв за запліднюваністю маток після першого осіменіння і кількістю одержаного приплоду; біометричні – визначення середніх величин, їх похибок, коефіцієнтів варіації, критеріїв вірогідності; економічні – економічна оцінка результатів досліджень.
Наукова новизна одержаних результатів. Розроблений новий, ефективний спосіб кріоконсервації сперми бугаїв у відкритих гранулах.
Спосіб передбачає застосування двох розріджувачів: основного ЛЦГЖ і коректуючого ЛЖ. Розбавляючи розробленими розріджувачами різні за концентрацією сперміїв еякуляти, вперше одночасно одержують в дозі необхідну кількість рухливих сперміїв і створюють для них однакове за концентрацією і оптимальне за співвідношенням осмотично активних речовин оточуюче середовище.
Для використання розріджувачів визначені кращі режими розбавлення, еквілібрації, заморожування і відтаювання сперми.
Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що при використанні розробленого способу кріоконсервації рухливість заморожено-розмороженої сперми вища в порівнянні з контролем на 11,6-13,3%, виживаність - на 32,5-34,1 %, а запліднююча здатність - на 16,3-20,3 %.
Впровадження результатів наукових досліджень здійснюється з 2002 року на масиві тварин чорно-рябої молочної худоби у господарствах Новоград-Волинського району Житомирської області (акт впровадження від 01 квітня 2003 року). Економічний ефект від впровадження розробки становить 12602 гривні в рік на 100 корів.
Методика оптимізації розріджувачів може стати основою для удосконалення існуючих технологій кріоконсервації сперми.
Особистий внесок здобувача. Добір і аналіз даних літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, їх опис, аналіз та теоретичне обґрунтування виконані автором особисто. Вибір напряму досліджень та методики проведений разом з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Одержані в експериментах наукові матеріали доповідалися і обговорювалися на щорічних засіданнях відділу відтворення тварин і аспірантських сесіях Інституту розведення і генетики тварин УААН (1997-2000), на науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу зооінженерного факультету та факультету ветеринарної медицини ДАУ (м. Житомир, 1998-2001), на конференціях: “Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтворення, зберігання і використання генофонду тварин” (Київ, 1997); “Проблеми виробництва екологічно чистої сільськогосподарської продукції на межі 3-го тисячоліття” (Житомир, 2000); “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); на розширеному засіданні лабораторій відділення розведення молочної худоби та відділу відтворення тварин Інституту розведення і генетики тварин УААН (2003).
Публікації. Результати експериментальних досліджень опубліковані у 4 статтях, що вийшли у збірниках наукових праць.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаних джерел наукової літератури. Робота викладена на 132 сторінках машинописного тексту, містить 1 рисунок, 26 таблиць. Список використаних літературних джерел складається з 245 найменувань, у тому числі 40 іноземних.
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експериментальна частина роботи проведена на трьох племпідприємствах України: ВАТ “Коростенське агроплемоб’єднання”, ВАТ “Новоград-Волинське агроплемоб’єднання”, ВАТ “Лубенське племпідприємство”.
Для дослідів використані еякуляти 40 бугаїв молочних і м'ясних порід: голштинської, симентальської, поліської м’ясної, української червоно-рябої молочної, української чорно-рябої молочної.
Загальна схема досліджень наведена на рис. 1.
Для розробки рецептів розріджувачів використали методику зустрічних рядів (В.К. Милованов, 1962), дещо змінену нами. Адже методика ця придатна тільки для ізотонічних розчинів і для зберігання сперми при 2-5˚С.
Рис. 1. Загальна схема досліджень
До складу ж розріджувачів для заморожування сперми входить ще проникаючий в клітину кріопротектор – гліцерин. Тому ці розріджувачі повинні бути гіпертонічними навіть без врахування концентрації кріопротектора.
Спочатку для розріджувачів підбирали концентрацію осмотично активних речовин близьку до такої апробованого розріджувача. У нашому випадку прототипом служив удосконалений В.М. Кушніром ЛГЖ (УЛГЖ), дозволений до впровадження у виробництво НТР Міністерства сільського господарства і продовольства України 18 грудня 1996 року (протокол № 5) і впроваджений на ВАТ Коростенського і Лубенського агроплемоб’єднань.
При постійному вмісті гліцерину, сануючих препаратів і жовтка підбирали концентрацію лактози і цитрату натрію методом арифметичних зустрічних рядів з різним співвідношенням цих компонентів з інтервалом 25%:
При цьому отримали 5 розріджувачів і шляхом біоконтролю при розбавленнях сперми в 2, 3, 4, 8, 16, 32, і 64 рази за показниками рухливості і виживаності сперміїв вибрали два кращі з них. Ними виявились два перших розріджувачі з процентним співвідношенням лактоза/цитрат натрію 0/100 і 25/75.
Тоді складали другий ряд з більш дрібними співвідношеннями компонентів:
і знову проводили біоконтроль. За його показниками визначали оптимальний склад розріджувача.
Основний розріджувач використовували з первинним коректуючим розріджувачем, який теж підбирався дослідним шляхом.
Кількість розріджувачів визначали за формулами В. М. Кушніра (1996):
 ;
 ;
де ООР- об'єм основного розріджувача, мл; ОЕ - об'єм еякуляту, мл; К – концентрація сперміїв в еякуляті, млрд./мл; Р – рухливість сперміїв, бали; ОД - об'єм дози, мл; РО- оптимальна кратність розбавлення сперми основним розріджувачем; 1,10 – постійні величини; Н – необхідна кількість рухливих сперміїв в дозі до заморожування, млрд.; ОКР- об'єм коректуючого розріджувача.
Осмоляльну концентрацію розчинів речовин, які використовувались для приготування розріджувачів, визначали електричним напівпровідниковим мікрокріоосмометром.
Об‘єм еякуляту, концентрацію сперміїв в 1 мл, їх рухливість, співвідношення нормальних і патологічних форм сперміїв визначали згідно з ГОСТом 20909.3-6-75 та ДСТУ 3535-97.
Оцінену і визнану придатною до обробки нативну сперму ділили на частини і піддавали обробці. Розбавляли, охолоджували, еквілібрували, заморожували і розморожували контрольні зразки за чинною інструкцією (1981), а дослідні - за встановленими автором цієї роботи параметрами.
Розморожену сперму оцінювали за рухливістю, виживаністю і абсолютним показником виживаності (АПВ) згідно з ГОСТом 27777-88.
Запліднюючу здатність розмороженої сперми визначали шляхом осіменіння телиць і корів в першу охоту після отелення ректальним дослідженням через 60-90 днів і за отеленнями.
Для обробки результатів дослідів використаний варіаційно-статистичний метод (Н.А. Плохинский, 1969; Е.К. Меркурьева, 1970; Н.Г. Балашов, 1980).
Економічна оцінка одержаних результатів здійснена за методикою О.С. Мітюкова, З.І. Екселєвої (1988) та В.І. Костенка (1996).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Розроблення нових розріджувачів для кріоконсервації сперми бугаїв
Розроблення основного ЛЦГЖ-розріджувача починалось з того, що для нього підбирали концентрацію лактози і цитрату натрію, рівну концентрації лактози в УЛГЖ. Склад УЛГЖ: вода дистильована – 100 мл, лактоза – 12,5 г, жовток – 20 мл, гліцерин – 6,65 мл, спермосан – 50 тис. од. Його осмоляльна концентрація – 1372 мосм/л, осмотичний тиск – 30,7 атм.
Виробнича перевірка на ВАТ “Коростенське агроплемоб’єднання” показала, що УЛГЖ має значні переваги над ЛГЖ, рекомендованим чинною інструкцією.
УЛГЖ взагалі не містить солей. В ЛЦГЖ ми ввели цитрат натрію в різних співвідношеннях, не змінюючи загальну осмоляльну концентрацію розчинених речовин, кількість гліцерину, жовтка і сануючих препаратів.
У процесі роботи виявилось, що різні партії лактози, цитрату натрію та гліцерину дещо відрізняються між собою за своїми осмоляльними характеристиками. Якщо, наприклад, розчинити 12,5 г лактози, випущеної різними заводами, в 100 мл дистильованої води, то осмотичний тиск розчинів буде коливатись в межах 8,0-8,6 атм. Це відбувається основним чином внаслідок втрати речовинами води в процесі зберігання або, навпаки, поглинання її з повітря. Тому в подальшому для приготування розріджувачів використовували тільки перевірені компоненти.
Результати першої серії дослідів з визначення кращих розріджувачів для сперми бугаїв представлені в таблиці 1. Вони показали, що кращими є розріджувачі №1 і №2 з співвідношенням лактоза/цитрат натрію 100/0 і 75/25. Сперма, розбавлена ними, при розрідженні в 2-3 рази мала рухливість 3,6– 4,1 бала, виживаність – 4,1 – 4,4 години, АПВ – 11,0 – 12,9 умовної одиниці.
1. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми бугаїв при використанні розріджувачів №1, №2, №3, №4, №5, M±m (n = 10)
Краща кратність розбавлення – в 3 рази, хоча різниця між якісними показниками сперми при розрідженні в 2 і 3 рази незначна. Із збільшенням кратності розрідження якісні показники заморожено-розмороженої сперми знижувались.
Якість сперми при використанні розріджувачів №1 і №2 не має достовірної різниці за показниками рухливості, виживаності і АПВ. Проте ці два розріджувачі достовірно кращі за перерахованими показниками від усіх інших (Р<0,001…0,05). При трикратному розрідженні різниця за рухливістю склала від 0,7 до 1,7 бала, за виживаністю - від 0,7 до 1,7 години, за АПВ - від 3,6 до 6,2 умовної одиниці.
Результати другої серії дослідів з визначення оптимального розріджувача для сперми бугаїв представлені в таблиці 2. Вони свідчать, що кращими є перші чотири розріджувачі з перевагою розріджувача за № 3 з співвідношенням лактоза/цитрат натрію 90/10 %, оптимальне розбавлення – в 2-3 рази, з незначною перевагою трикратного. Рухливість сперміїв в заморожено-розмороженій спермі була практично однаковою при застосуванні розріджувачів №1, №2, №3, №4 і становила 3,8-3,9 бала. Виживаність і АПВ були кращими при застосуванні розріджувача №3 і склали при розбавленні в 3 рази відповідно 5,70±0,15 години та 14,8±0,90 умовної одиниці. Причому за виживаністю розріджувач №3 був достовірно кращий від розріджувачів №1, №5 і №6 (Р<0,001…0,05).
2. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми бугаїв при використанні розріджувачів №1, №2, №3, №4, №5, №6, M±m (n = 10)
Оптимальним співвідношенням лактоза / цитрат натрію в складі ЛЦГЖ є 90/10 %. Тому для наступних досліджень був вибраний розріджувач № 3. Його склад: лактоза – 11,25 г, натрій лимоннокислий тризаміщений 5,5-водний – 0,37 г, гліцерин – 6,65 мл, жовток – 20 мл, спермосан – 50 тис.од., вода дистильована – 100 мл. Оптимум розбавлення – в 2-3 рази.
Результати наших досліджень не узгоджуються з висновками Н.Г. Балашова і М.Є Євсюкова (1981), за їх даними солі в складі розріджувача (цитрат натрію і хлорид натрію) негативно впливають на виживаність і рухливість сперміїв після їх заморожування.
Для отримання постійної і оптимальної осмоляльної концентрації розчинених речовин в розрідженій спермі при всіх кратностях розрідження еякулятів основний розріджувач (ЛЦГЖ) використовували з декількома первинними або коректуючими розріджувачами: лактозо-жовтковим (ЛЖ) і лактозо-цитратно-жовтковим (ЛЦЖ). Ці розріджувачі ізотонічні стосовно сперми, їх осмоляльна концентрація становила 323 мосм/л. Для того, щоб отримати в дозі (0,2 мл) заморожено-розмороженої сперми 15 млн. рухливих сперміїв, треба розрідити сперму до отримання 30 млн. рухливих сперміїв; для того, щоб розбавити сперму основним розріджувачем в 2-3 рази (до отримання в дозі 30 млн. рухливих сперміїв), коректуючим розріджувачем її треба розбавити до отримання 60-90 млн. рухливих сперміїв.
Встановлено, що кращим із первинних розріджувачів є ЛЖ як при дво-, так і при трикратному розрідженні еякулятів. При його поєднанні з основним ЛЦГЖ рухливість становила 3,7-3,8 бала, виживаність – 5,3-5,5 години, АПВ – 13,7-14,1 умовної одиниці (табл.3). Різниця за рухливістю склала 0,2 бала (Р>0,05), виживаністю – 0,6-0,8 години (Р<0,05), АПВ – 1,4-1,8 умовної одиниці (Р>0,05).
3. Середні якісні показники заморожено-розмороженої сперми при використанні розріджувача №3 в комплексі з двома коректуючими розріджувачами (n = 10)
Склад ЛЖ-розріджувача: лактоза – 9,6 г, жовток – 20 мл, спермосан – 50 тис.од., вода дистильована – 100 мл.
Визначення оптимальних режимів обробки сперми при використанні розроблених розріджувачів
При розбавленні сперми одним ЛГЖ в залежності від кратності розрідження спермії оточує різне за концентрацією і за співвідношенням між гліцерином та іншими осмотично активними речовинами середовище (В.М. Кушнір, 1996). Тому, власне, на практиці неможливо для всієї множини концентрацій підібрати оптимальні режими обробки. Але це можливо і необхідно зробити при використанні розроблених нами розріджувачів.
Визначення способу розрідження. Розбавляють сперму бугаїв при заморожуванні, згідно з чинною інструкцією, за різними технологіями при температурі (32±2)°С через 5-6 хвилин після її одержання. На практиці проводять одномоментне або двомоментне її розбавлення із розрахунку отримання в дозі необхідної кількості рухливих сперміїв.
Наша методика сама по собі передбачає двомоментне розбавлення. Розбавлення первинним розріджувачем проводиться для створення однакової і оптимальної концентрації розчинених речовин для життєздатності сперміїв при всіх кратностях розрідження, вторинним – для захисту клітин від дії низьких температур. У досліді вивчались три способи розрідження:
Спосіб 1: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35°С, а після 5-6 хвилин витримки – вторинним ЛЦГЖ - теж при температурі 32-35 °С;
Спосіб 2: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35°С, витримували розріджену сперму 15 хвилин, вторинне розбавлення проводили ЛЦГЖ при кімнатній температурі (16-20°С);
Спосіб 3: еякулят розбавляли первинним ЛЖ при температурі 32-35°С, витримували розріджену сперму 15 хвилин, потім ставили в холодильник і через 30 хвилин розбавляли холодним (2-5°С) ЛЦГЖ.
Порівняльним аналізом встановлено, що найкращим є 3-й спосіб розрідження. При його застосуванні рухливість сперміїв в заморожено-розмороженій спермі становила 4,1±0,10 бала, виживаність - 6,4±0,15 години, АПВ – 17,3±0,70 умовної одиниці (табл.4). Різниця за якістю сперми, замороженої 3-м і першими двома способами, склала: за рухливістю від 0,3 до 0,4 бала, за виживаністю від 0,6 до 0,9 години, за АПВ – від 2,8 до 3,1 умовної одиниці (Р< 0,05).
| 
